雄激素受體與腫瘤浸潤淋巴細胞對三陰性乳腺癌預后影響的相關性分析

張炯炯，鄭彬，沈海幸，陳湛

雄激素受體與腫瘤浸潤淋巴細胞對三陰性乳腺癌預后影響的相關性分析

張炯炯1，鄭彬1，沈海幸1，陳湛2

1.慈溪市人民醫院甲乳外科，浙江慈溪 315300；2.慈溪市人民醫院病理科，浙江慈溪 315300

探討雄激素受體（androgen receptor，AR）與腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）在三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的表達特征和相關性及對預后的影響。收集2011年6月至2021年12月慈溪市人民醫院收治的70例TNBC患者資料，免疫組化法檢測AR表達，蘇木精–伊紅染色評估間質TILs表達水平，隨訪術后生存情況，分析AR表達和TILs表達水平與臨床病理特征的關系，TILs與AR相關性及預后的關系。TNBC中AR表達與增殖指數Ki-67、是否有脈管癌栓密切相關（<0.05），TILs浸潤水平與增殖指數Ki-67、是否復發轉移密切相關（<0.05），Spearman秩相關檢驗提示AR表達與TILs浸潤水平呈負相關（=-0.344，=0.004）。單因素Cox回歸分析，TNBC脈管癌栓、淋巴結轉移、AR表達、TILs浸潤水平對無病生存期（disease-free survival，DFS）有影響（<0.05），多因素Cox回歸分析示淋巴結轉移對DFS有影響（<0.05）。AR在低Ki-67、有脈管癌栓的TNBC中表達率高，TILs在高Ki-67、無復發轉移的TNBC中浸潤水平高，TNBC中AR表達與TILs浸潤水平呈負相關，淋巴結轉移是影響TNBC預后的獨立因素，AR和TILs及脈管癌栓是可能的預后因素，需要更多研究證實，提示TNBC可根據AR表達和TILs浸潤水平進行精準治療。

三陰性乳腺癌；雄激素受體；腫瘤浸潤淋巴細胞；預后

乳腺癌是我國女性發病率首位、死亡率居前的惡性腫瘤，隨著社會經濟發展，預計我國的乳腺癌疾病負擔將持續加重[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）均為陰性的乳腺癌，占乳腺癌的15%～20%。TNBC因其異質性大，侵襲性強，缺乏治療靶點，治療手段單一，易復發轉移，是乳腺癌中預后較差的一個亞型[2-3]。面對診治困境，臨床需要新的生物標志物細分TNBC，尋找治療靶點提高療效。

現有研究提示雄激素受體（androgen receptor，AR）表達與TNBC的發生發展及預后相關，但相關結論并不一致[4-5]。而腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor- infiltrating lymphocytes，TILs）在TNBC中的高浸潤水平提示相對好的預后[6-7]。本研究分析TNBC中的AR表達和TILs浸潤水平及其相關性和預后影響。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集2011年6月至2021年12月慈溪市人民醫院初診并手術的70例TNBC患者的臨床資料，術后免疫組化ER陰性（<1%細胞核染色），PR陰性（<1%細胞核染色），HER-2陰性（免疫組化結果0或1+或2+且熒光原位雜交檢測陰性）[8-9]。患者年齡31～84歲，平均（53.3±11.6）歲。所有納入研究者均行根治性手術（改良根治術或保乳根治術），按照術后評估進行輔助放化療。

病例納入標準：在慈溪市人民醫院初診行根治性手術的TNBC患者；術后按當時的診療規范予以輔助放化療，未進行新輔助治療；具備完整的臨床病歷資料，保存完整的術后病理標本；常規進行術后復查隨訪。排除標準：合并其他惡性腫瘤，手術時合并轉移情況，術后未進行推薦輔助治療，術后未定期復查或失聯。本研究經慈溪市人民醫院醫學倫理委員會批準（倫理審批號：2019-LP-14）。

1.2 病理方法

免疫組化法測定AR表達，對70例石蠟包埋組織進行切片，使用AR抗體進行染色，AR陽性閾值定為1%（圖1）[10]。按照國際乳腺癌TILs工作組共識，用蘇木精–伊紅染色評估間質TILs浸潤程度，定義TILs浸潤程度<10%為低浸潤，≥10%且<40%為中浸潤，≥40%為高浸潤（圖2）[11]。

圖1 TNBC中AR表達情況（SP×100）

A.AR陽性；B.AR陰性

圖2 TNBC中TILs浸潤情況（HE×100）

A.低浸潤；B.中浸潤；C.高浸潤

1.3 隨訪記錄

記錄患者的臨床病理特征，包括年齡、腫瘤直徑、組織學分級、Ki-67、脈管癌栓、腋窩淋巴結轉移、AR表達及TILs浸潤情況。隨訪周期：兩年內每3個月隨訪1次，兩年后每半年隨訪1次，以復發轉移為終點，計作無病生存期（disease-free survival，DFS），隨訪截止時間為2022年12月，中位隨訪時間57個月。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行分析，計數資料以例數（百分率）[（%）]表示，采用2檢驗進行簡單關聯性檢驗（多組率比較20%理論頻數<5或存在理論頻數<1時取Fish確切概率法；兩組率比較存在1≤理論頻數<5時作連續性修正，理論頻數<1時取Fish確切概率法），分析AR和TILs在臨床病理特征上的表達特點；采用Spearman秩相關分析AR表達與TILs浸潤程度的相關性；用Kaplan-Meier繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較DFS；應用單因素和多因素Cox回歸分析影響DFS的因素，<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AR表達和TILs浸潤水平與TNBC臨床病理特征的關系

AR陰性48例（68.6%），AR陽性22例（31.4%）；TILs高浸潤18例（25.7%），中浸潤24例（34.3%），低浸潤28例（40%）；復發轉移13例（18.6%），無病生存57例（81.4%）。

TILs浸潤水平與Ki-67值密切相關（2=7.548，=0.023），與是否復發轉移密切相關（2=6.343，=0.038），見表1；AR表達與Ki-67值密切相關（2=9.291，=0.002），與有無脈管癌栓密切相關（2=4.822，=0.028），見表2。TILs更傾向在高Ki-67、無復發轉移的TNBC中高浸潤；AR更傾向在低Ki-67、有脈管癌栓的TNBC中表達。

表1 TNBC的TILs浸潤水平與臨床病理特征的關系[n（%）]

表2 TNBC的AR表達與臨床病理特征的關系[n（%）]

2.2 TILs浸潤水平與AR表達的相關性分析

由表1知，TILs浸潤水平與AR表達密切相關（2=8.389，=0.015），采用Spearman秩相關檢驗，TILs浸潤水平與AR表達呈負相關（=–0.344，=0.004），見表3。

表3 TILs浸潤水平與AR表達的相關性分析[n（%）]

2.3 AR表達、TILs浸潤水平與TNBC患者DFS生存分析

AR陰性患者較AR陽性患者有更好的DFS，差異有統計學意義（Log-rank=0.031），見圖3。TILs浸潤程度的DFS生存曲線在中段存在交叉，對后期可能存在正相關，但無統計學意義（Log-rank=0.060），見圖4。

圖3 AR與TNBC無病生存期的Kaplan-Meier分析

圖4 TILs與TNBC無病生存期的Kaplan-Meier分析

2.4 影響TNBC患者DFS的單因素及多因素分析

對年齡、腫瘤直徑、組織學分級、Ki-67、脈管癌栓、淋巴結轉移、AR表達及TILs浸潤程度，逐一構建單因素Cox比例風險模型，見表4。結果發現，脈管癌栓對DFS的影響具有統計學意義（=5.155，95%：1.718～15.470，=0.003）；淋巴結轉移對DFS的影響具有統計學意義（=5.849，95%：1.904～17.965，=0.002）；AR表達對DFS的影響具有統計學意義（=3.147，95%：1.051～9.422，=0.040）；TILs浸潤程度對DFS的影響具有統計學意義（=0.427，95%：0.188～0.970，=0.042）。

表4 影響TNBC無病生存期的單因素Cox回歸分析

注：*為對照組

納入脈管癌栓、淋巴結轉移、AR表達及TILs浸潤程度，構建多因素Cox比例風險模型。結果發現，淋巴結轉移對DFS的影響具有統計學意義（=8.358，95%：2.168～32.214，=0.002）；其余變量對DFS的影響均無統計學意義，見表5。

3 討論

本研究TNBC的AR陽性率31.4%，與既往研究的陽性率10%～43%相符[12]。AR在TNBC中的臨床病理特征關系和預后的研究很多，AR與年齡、組織學分級、Ki-67、區域淋巴結、脈管癌栓等存在相關性，但結論各異。有研究顯示AR表達與低Ki-67、較低的組織學分級等低侵襲性臨床病理特征相關，也有研究顯示在AR陽性的TNBC中淋巴結轉移數量要多于AR陰性TNBC[13-14]。而AR作為TNBC預后指標的研究結論也不一致[15]。究其原因：一方面是TNBC的高度異質性及分型差異，研究質量參差不齊，AR陽性閾值并不統一；另一方面是AR的復雜作用機制及各種旁路信號交叉影響，AR可與ER、HER-2等通路、免疫微環境存在串擾機制，成為一個復雜多變的角色。

本研究顯示AR更傾向在低Ki-67、有脈管癌栓的TNBC中表達，生存曲線提示AR陰性具有更好的預后。單因素回歸提示AR陽性對DFS的不良影響有統計學意義，而多因素回歸沒有統計學意義，此結論與既往文獻報道相符。

TILs是腫瘤免疫微環境的重要組成部分，是腫瘤免疫原性的重要標志物，分為巢內和間質內，研究間質TILs更有臨床意義。間質TILs免疫成分復雜，包括CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、自然殺傷細胞、CD4+調節性T細胞（Treg）、樹突狀抗原呈遞細胞、巨噬細胞等，其類型和浸潤水平和預后密切相關，可幫助TNBC療效評估及預后判斷，既往研究提示TNBC中TILs高水平浸潤，治療反應更好，預后更好[16-17]。

本研究提示TILs更傾向在高Ki-67和無復發轉移的TNBC中高浸潤，生存曲線TILs在中段存在交叉，后段可能存在正相關，無統計學意義。單因素回歸分析提示TILs、AR、脈管癌栓、淋巴結轉移對DFS的影響具有統計學意義，納入多因素后，淋巴結轉移對DFS的影響具有統計學意義，其余因素失去統計學意義。這種情況需考慮混雜因素及中介變量的影響，采用兩因素分析探討影響TILs的干擾因素，發現AR和脈管癌栓對TILs有影響。采用去因素法建模，剔除AR和脈管癌栓，則多因素分析提示TILs對DFS影響有統計學意義；剔除AR，多因素分析TILs對DFS影響有統計學意義；剔除脈管癌栓，多因素分析TILs對DFS影響也有統計學意義。而從理論和既往文獻考慮，AR和脈管癌栓是需要列入模型的暴露因素或混雜因素，不建議剔除，本研究只能從單因素分析角度推測AR和TILs是可能的預后因素。本研究TILs的預后意義與既往研究的差異可能與樣本量相對較小有關，故需要更大的樣本量，減少不均衡的混雜因素，提高回歸建模效率得出更可靠的結論。

TNBC中AR與TILs存在負相關線性關系，符合既往文獻報道，在前列腺癌中這一關系也是成立的，AR可通過MHC-Ⅰ影響TILs浸潤水平，提示可通過嘗試抑制AR來改善腫瘤免疫微環境，調高腫瘤免疫，甚至加用免疫治療達到改善預后的目的[18]。

TNBC是近年來的研究熱點。2019年復旦大學提出TNBC復旦分型，將其分為腔面雄激素受體型（luminal androgen receptor，LAR）、免疫調節型（immunomodulatory，IM）、基底樣免疫抑制型（basal-like immune-suppressed，BLIS）和間質型（mesenchymal-like，MES）4個亞型[19]。本研究的AR及TILs可對應其LAR及IM型，涉及抗AR治療和免疫治療。在Future精準臨床試驗中，IM型應用免疫治療可明顯改善TNBC患者的預后，LAR型的抗AR治療卻令人失望[20]。這說明TILs在TNBC中提示免疫微環境對精準治療、療效評估、預后提示意義重大，而AR在乳腺癌中的作用機制復雜交互，多種串擾機制并存，需要進一步深入研究。

表5 影響TNBC無病生存期的多因素Cox回歸分析

注：*為對照組

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Correlation analysis of the effects of androgen receptor and tumor-infiltrating lymphocytes on the prognosis of triple negative breast cancer

ZHANG Jiongjiong, ZHENG Bin, SHEN Haixing, CHEN Zhan

1.Department of Thyroid and Breast Surgery, Cixi People’s Hospital, Cixi 315300, Zhejiang, China; 2.Department of Pathology, Cixi People’s Hospital, Cixi 315300, Zhejiang, China

To discuss the expression characteristics of androgen receptor (AR) and tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in triple negative breast cancer (TNBC), the correlation between the AR and TILs, and the correlation analysis between them on the prognosis of TNBC.Clinical data of 70 patients with TNBC from Cixi People’s Hospital between June 2011 and December 2021 were collected. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of AR, Hematoxylin-eosin staining was used to evaluate the degree of TILs infiltration，patients were followed up their health status whether recurrence or metastasis occurred. The relationship among AR, TILs and clinicopathological parameters were determined. The correlation between AR and TILs and clinical outcome were evaluated.The expression of AR was significantly associated with Ki-67 expression, whether there was vascular tumor thrombus in TNBC (<0.05); The degree of TILs infiltration was significantly associated with Ki-67 expression, whether recurrence or metastasis occurred in TNBC (<0.05); Spearman correlation analysis showed that the expression of AR and the degree of TILs infiltration were negative related (=–0.344,=0.004). Univariate Cox regression analysis showed whether there was vascular tumor thrombus, whether recurrence or metastasis occurred, AR expression and TILs infiltration in TNBC had an impact on disease-free survival (DFS) (<0.05); Multivariate Cox analysis showed regional lymphatic in TNBC had an impact on DFS (<0.05).AR has a high expression rate in TNBC with low Ki-67 expression and the presence of vascular tumor thrombi, TILs have a high degree infiltration in TNBC with high Ki-67 expression and no recurrence or metastasis. The expression of AR in TNBC is negatively correlated with the degree of TILs infiltration. Regional lymphatic is independent risk factors affecting the prognosis of TNBC. AR expression, TILs infiltration and vascular tumor thrombi are possible prognostic factors, needs more data to be conformed, indicating TNBC can be treated according AR expression and TILs infiltration degree.

Triple negative breast cancer; Androgen receptor; Tumor-infiltrating lymphocytes; Prognosis

R737

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.013

慈溪市農業和社會發展類科技計劃項目（CN2019010）

張炯炯，電子信箱：jojo@zju.edu.cn

（2023–03–29）

（2023–09–09）