大口黑鱸形態特征、染色體核型及眼晶狀體乳酸脫氫酶的電泳分析

張 濤,周劍光, 張 林,甘金華,何 力

(農業農村部水產品質量安全風險評估實驗室(武漢)/農業農村部淡水魚類種質監督檢驗測試中心/中國水產科學研究院 長江水產研究所,武漢 430223)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)隸屬鱸形目(Perciformes)、太陽魚科(Centrarchidae)、黑鱸屬(Micropterus),原產于北美洲,1983年從中國臺灣引入廣東省,是一種廣溫、生長迅速的優質淡水肉食性魚類,已在中國多個省市推廣養殖[1]。然而大口黑鱸在中國部分地區推廣繁育過程中,普遍缺乏人工定向選育,且繁殖時未嚴格遵守親本選擇的要求,近期出現餌料轉化率下降、生長速率減緩和病害頻發等種質退化跡象[2]。另一方面,大口黑鱸可能存在雜交的現象[1],已有的研究表明,雜交產生的子一代在外形上一致[3],但種質已發生改變,表現出雜交優勢,因此有必要加強大口黑鱸種質鑒定方面的相關研究。

目前關于大口黑鱸種質資源方面的報道主要集中在形態特征[3-7]、細胞遺傳學[8-9]、生化遺傳學[10-11]以及分子生物學[12-17]。通過形態水平的表型鑒定、同工酶電泳以及DNA分子標記都是魚類種質鑒定的技術手段[18],對于親緣關系較近的魚類,如果僅借助一種種質鑒定技術未必能達到種質鑒定的目的,如大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種在胸、腹、臀鰭條、側線上鱗和側線下鱗等方面均無顯著差異[19],有必要借助多種種質鑒定技術手段對大口黑鱸進行種質鑒定。從形態特征、核型分析和同工酶技術等多層面遺傳學分析手段研究大口黑鱸種質的報道較少。本研究綜合利用傳統形態學分析、染色體核型分析和同工酶技術對大口黑鱸種質進行多層面遺傳學鑒定分析,以期豐富大口黑鱸種質資源學的研究內容,為探討種質鑒定在大口黑鱸良種選育中的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大口黑鱸分別于2016年4月采自湖北荊州、2020年7月采自安徽合肥,共33尾,所有試驗魚均為純種,來自國家級或省級良種場,不存在種質混雜現象,均為池塘養殖所得,隨機選取,無傷、無畸形,體質量637.6～1 322.5 g,均值為(802.3±131.5) g,體長28.6～35.3 cm,均值為(30.3±1.4) cm。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態測定 在進行形態測量之前,所有試驗魚均停食1 d,按照“GB/T 18654.3-2008 養殖魚類種質檢驗 第3部分:性狀測定”中的方法規定,用游標卡尺(精確到0.01 mm)對33尾樣本魚進行測定。可數性狀共7個,包括背鰭和臀鰭的鰭式、齒式、側線鱗數、側線上鱗數、側線下鱗數以及左側第一鰓弓外側鰓耙數。可量性狀共9個,包括全長(Total Length,TL)、體長(Standard Length,SL)、體高(Body Depth,BD)、頭長(Head Length,HL)、吻長(Proboscis Length,PL)、眼徑(Eye Diameter,ED)、眼間距(Eye Interval,EI)、尾柄長(Caudal Length,CL)和尾柄高(Caudal Depth,CD)。

1.2.2 染色體標本制備及核型分析 參照周劍光等[20]的方法進行染色體標本制備并進行核型分析。

1.2.3 同工酶制備、電泳方法及酶譜分析 參照“GB 21045-2007 大口黑鱸”中選取眼晶狀體乳酸脫氫酶(LDH)作為鑒定大口黑鱸種質的生化遺傳標記,同工酶制備、電泳方法及酶譜分析參照張濤等[21-22]的方法。

1.3 數據處理

所得數據采用Excel(2007)和SPSS 20.0(IBM公司,美國)進行分析,數據表示形式為“平均數±標準差”。P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 形態特征及可數、可量性狀

2.1.1 形態特征 觀測33尾大口黑鱸(圖1)外部形態,體紡錘形,側扁,背稍厚。背部黑綠色,體側青綠。體被小櫛鱗。口裂大、斜裂,頜能伸縮,上頜骨向后延伸至眼后。眼球突出。吻端至尾鰭基部有排列成帶狀的黑斑。鰓蓋上有3條呈放射狀的黑斑。背鰭硬棘部和軟鰭部間有一小缺刻;側線完全,沿體側中部與背鰭平行,后端幾乎延伸至尾鰭基部。尾鰭略內凹、正尾狀。第一鰓弓外鰓耙,形狀似彎月形,除鰓耙背面外,其余三面均布滿倒鋸齒狀骨質化突起。鰾一室,長圓柱形。上下頜均布滿錐狀細齒,較銳利。脊椎骨總數 30～32。腹膜白色。

圖1 大口黑鱸外觀形態Fig.1 Morphological measurement of M.salmoides

2.1.2 可量、可數性狀 大口黑鱸可數、可量性狀分別見表1和表2,表1為所測各指標的上下限和均值,反映了所測數據的集中程度。可數性狀中側線鱗數變幅最大。可量性狀中主要以體長和頭長為參照,反映吻長和眼間距等頭部與頭長的比例關系,也反映了體高、尾柄長和尾柄高等軀干部主要性狀與體長的比例關系。表3反映可量性狀之間的相關性分析。

表1 大口黑鱸的形態特征的可數性狀Table 1 Countable parameter of M.salmoides

表2 大口黑鱸的形態特征的可量性狀Table 2 Parameters ratio of M.salmoides body size

表3 大口黑鱸各表型性狀間相關性分析Table 3 Correlation coefficients among morphometric traits of M.salmoides

2.2 眼晶狀體乳酸脫氫酶的表達情況

大口黑鱸樣本眼晶狀體LDH同工酶表達結果一致,隨機選取10尾,其電泳圖譜如圖2所示,將靠近陽極最近的一條帶定義為LDH1,自陽極向陰極方向依次編號為LDH2、LDH3……,10尾大口黑鱸眼晶狀體LDH同工酶共檢測到5條LDH酶帶, 由3個基因即LDHA、LDHB和LDHC編碼, 靠近陽極的兩條LDH酶帶為同一個基因,即LDHC基因編碼的兩個等位基因,其余3條LDH酶帶由LDHA和LDHB兩個基因編碼,自陽極向陰極依次對應C1C1、C2C2、B4、A2B2、A4,LDH4表達活性最強,LDH1和LDH2表達活性相對較弱。

1～10分別表示不同個體的酶譜

2.3 染色體核型分析

2.3.1 確定染色體眾數 在油鏡下通過Olympus IX 81 倒置熒光顯微鏡系統進行觀察、拍照,選取清晰且分散良好的100個中期分裂相,并統計染色體數目(表4),根據眾數確定大口黑鱸二倍體染色體數2n=46。

表4 大口黑鱸染色體眾數Table 4 Chromosome numbers of M.salmoides

2.3.2 核型分析 選取5個數目完整、無重疊、分散良好、長度適中和著絲粒清楚的分裂相,通過photoshop CS2軟件測量每一條染色體的長臂和短臂,數據取平均值。計算相對長度和臂比,并按 Levan 等[23]提出的標準進行配對、分類并排列核型(圖3)。染色體類型統計見表5。染色體相對長度和臂比值的計算參照“GB/T 18654.12-2002, 養殖魚類種質檢驗 第12部分:染色體組型分析”中的方法。大口黑鱸染色體核型根據其著絲點位置可分為3組:第1組有1對中部著絲點染色體(m),第2組有1對亞端部著絲點染色體(st),第3組有21對端部著絲點染色體(t)。大口黑鱸染色體核型公式2n=2m+2st+42t,臂數NF=48。未發現帶有隨體、次縊痕的染色體和異型性染色體。

表5 大口黑鱸核型參數Table 5 Karyotype parameter of M.salmoides

圖3 大口黑鱸染色體中期分裂相及核型圖Fig.3 Metaphase chromosomes and karyotype of M.salmoides

3 討 論

3.1 大口黑鱸的形態特征比較

表型差異是魚類生態適應性最直接的外在表現[24],研究魚類表型特征信息不僅有助于種質鑒定,而且還能為良種選育提供參考依據[25]。在可量性狀方面,本研究與“GB 21045-2007 大口黑鱸”、李武輝等[1]的研究結果基本吻合,與蔡磊等[4]的研究結果中大口黑鱸北方亞種基本吻合,但與大口黑鱸佛羅里達亞種在頭長/眼間距上存在較大差異,兩者關于頭長/眼間距分別為 3.06～3.91和4.39～4.71,頭長/眼間距反映魚體眼眶上緣之間直線距離占頭長的比例,綜合本研究與蔡磊等[4]關于大口黑鱸可量性狀的研究結果,初步判斷本研究中樣本屬大口黑鱸北方亞種。

在可數性狀方面的不同見表6,造成可數性狀差異的原因除了與樣本量大小有關外,還可能與樣本的種屬特性有關,20世紀80年代中國大陸引進大口黑鱸北方亞種,而在北美的天然水域存在兩個亞種:北方亞種和佛羅里達亞種,這兩個亞種在可數性狀上存在差異[4]。Bailey等[26]的研究結果也表明大口黑鱸北方亞種的側線鱗數和肋骨數分別為59～65、15,而大口黑鱸佛羅里達亞種的側線鱗數和肋骨數分別為69～73、14。本研究中的樣本來源于湖北荊州和安徽合肥,屬北方亞種的可能性較大。本研究與蔡磊等[4]的研究結果存在差異,尤其體現在背鰭分支鰭條上。本研究關于可數性狀的結果與種質標準“GB 21045-2007 大口黑鱸”中的數據吻合,盡管該種質標準中未標明其中形態特征適應于大口黑鱸北方亞種還是佛羅里達亞種、或者兩者都囊括,但鑒于目前大口黑鱸北方亞種已成為國內重要的淡水養殖品種之一[4],同時20世紀80年代中國大陸引進的是大口黑鱸北方亞種,作為一個中國政府批準發布、在國內執行的大口黑鱸種質標準,推測該標準中形態特征適應于大口黑鱸北方亞種。綜合可量性狀和可數性狀分析,本研究中樣本魚屬于大口黑鱸北方亞種的可能性較大。至于本研究與蔡磊等[4]關于大口黑鱸北方亞種可數性狀的研究結果存在差異,尚需進一步分析考證。

表6 大口黑鱸可數性狀的比較Table 6 Comparations of countable parameters of M.salmoides

3.2 大口黑鱸核型的比較

小島吉雄根據魚類染色體數目及核型特點,將真骨魚類劃分為低位類、中位類和高位類3個演化類群,高位類群的染色體數目多集中在42～48范圍內,以2n=48最多,m型染色體和sm型染色體少,st型染色體和t型染色體多,而且以t型染色體為主[27]。大口黑鱸符合高位類群核型特征,在進化上屬于較原始核型或者由原始核型演化而來。梁述章等[28]的研究表明,核型為2n=48t的鱸形目海水魚類占已報道符合原始核型鱸形目海水魚類的55.6%,推測鱸形目海水魚類核型的相對穩定與海洋為魚類提供相對穩定的生活環境有關。大口黑鱸作為一種淡水且符合高位類群核型特征的魚類,其染色體核型公式2n=2m+2st+42t,也說明了在進化過程中淡水魚類核型不及海水魚類穩定,可能與淡水魚類生活環境沒有海水魚類生活環境穩定有關,與Zhang等[29]的研究吻合。推測大口黑鱸核型可能是由原始核型通過著絲點融合、羅伯遜移位等方式演化而來。

從表7可見,除了秦偉等[9]的研究結果外,本研究與“GB 21045 大口黑鱸”、胡紅等[8]的研究結果在染色體數目及核型上都相同。與秦偉等[9]的研究結果存在差異的原因可能是試驗方法如PHA、秋水仙素濃度及處理時間等不同所致,也可能是染色體存在變異、樣本來源存在不同地理分布以及樣本魚性別不同導致染色體核型不同。在其他魚類的研究中也見類似現象,如棘頭梅童魚(Collichthyslucidus)[28-29]、黃鰭刺蝦虎魚(Acanthogobiusflavimanus)[30]。說明在研究魚類染色體尤其據此作為鑒定種質的依據時,應盡可能收集不同地理種群、驗證不同性別的魚類,并通過不同的試驗方法綜合確證染色體數目及核型特征。

表7 大口黑鱸染色體核型比較Table 7 Comparations of karyotypes of fish of M.salmoides

接近40%的鱸形目魚類核型為典型的原始核型或者由原始核型演化而來[30],張大莉等[10]也認為大多數鱸形目魚類核型相像,因此在對鱸形目魚類進行種質鑒定時建議綜合多種技術手段,除了借助染色體核型外,需要結合形態特征以及DNA分子標記等分子生物學技術。

3.3 大口黑鱸眼晶狀體LDH同工酶的比較

同工酶是生物機體的天然標記,具有明顯的種屬、組織和發育階段的特異性,可作為生理指標和遺傳標志[31]。本研究中大口黑鱸眼晶狀體LDH共由3個基因即LDHA、LDHB和LDHC編碼,與Philipp等[11]的研究結果一致,該研究中發現LDHC基因主要在大口黑鱸眼和腦中表達,而LDHA和LDHB基因在骨骼肌、肝臟和眼等所有組織中均有表達。已有的研究[32-33]表明LDH是由LDHA、LDHB、LDHC3個基因編碼的四聚體蛋白質,LDHA和LDHB基因在脊椎動物各組織器官中普遍表達,可聚合成A4、A3B1、A2B2、A1B3、B4共5種四聚體,但在部分脊椎動物中只表達A4、B4兩種四聚體和A4、A2B2、B4 3種四聚體,本研究中LDHA和LDHB基因在大口黑鱸眼晶狀體中只表達A4、A2B2、B4 3種四聚體。LDHC基因具有高度的組織特異性,對魚類而言依據不同種類表達在不同組織中,在鱒魚、綠色太陽魚、黑鱸等魚類中,主要表達于神經視網膜光接收細胞和腦組織,稱為“眼帶”;而在鱈科、鯉科和胭脂魚科魚類中,主要表達于肝組織,稱為“肝帶”[34]。本研究中大口黑鱸LDHC基因在眼晶狀體中特異性表達,酶譜圖上表現為靠近陽極高遷移率,屬典型的“眼帶”,與上述已有研究結果一致。

4 結 論

大口黑鱸鰭棘部與鰭條部相連,背鰭鰭式D.VIII～XI-11～14;臀鰭鰭式A.III～9～12。口裂大。背部黑綠色,體側青綠。吻端至尾鰭基部有排列成帶狀的黑斑。左側第一鰓弓外側鰓耙數為6～7,鰾1室,脊椎骨總數30～32。綜合可量性狀和可數性狀分析,本研究中樣本魚屬于大口黑鱸北方亞種的可能性較大。

染色體數目2n=46,核型公式為2m+2st+42t,臂數NF=48,未發現帶有隨體、次縊痕的染色體和異型性染色體,大口黑鱸進化上符合高位類群核型特征。

眼晶狀體中的LDH酶帶條數為5條,觀察到LDHA、LDHB和LDHC3個基因。

在對大口黑鱸進行種質鑒定時,建議采用多種種質鑒定技術系統化地考察與評價其種質 狀況。