甘肅省黃芩白粉病病原鑒定及對黃芩葉片生理特性的影響

蔣晶晶,陳愛昌,杜 蕙,李繼平,李雪萍,漆永紅

(1.甘肅省農業科學院 植物保護研究所,蘭州 730070;2.定西市植保植檢站,甘肅定西 743000)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)為唇形科(Labiatae)黃芩屬(Scutellaria)多年生草本植物,以根入藥,味苦,性寒,有消炎、健胃、清涼、解熱等功效[1]。黃芩主產于中國北方的甘肅、陜西、山西、河北、內蒙、吉林等省[2]。近年來,由于市場需求量的增加,黃芩種植面積逐年擴大,連年種植導致連作障礙凸顯,生產上黃芩病害明顯加重。甘肅省農業科學院植物保護研究所經濟作物病害研究室于2020-2021年7-8月在甘肅省定西市隴西縣對黃芩病害進行調查時發現,白粉病病田率達60%,病株率達80%～100%。田間大面積黃芩葉片普遍初生白色小粉狀斑,隨病情加重逐漸擴大呈不規則粉狀斑,嚴重時白粉病菌覆蓋葉片正反兩面,后期白粉斑中產生黃褐色或黑色小顆粒物,導致整個植株光合作用受阻,嚴重影響黃芩的產量和品質。

國內對黃芩白粉病的研究較少,陳秀蓉[3]對黃芩白粉病的發病癥狀、病原、發生條件和防治技術進行了研究,同時報道了該病害的病原菌為真菌界白粉菌屬(Erysiphesp.);陳君等[4]研究發現,黃芩白粉病的病原菌為白粉菌屬(Erysiphesp.)二孢白粉菌(Erysiphecichoracearum),它的無性世代為粉孢屬(Oidiumsp.)脈革粉孢菌(Oidiumambrosiae);常瑾等[5]報道,引起陜西黃芩白粉病的病原菌為白粉菌屬(Erysiphesp.)真菌,病菌以閉囊殼在田間病殘體上越冬,6-8月為發病盛期;Zhang等[6]對河北承德黃芩白粉病的發生規律及防治進行了研究,病原菌形態學鑒定為白粉菌屬(Erysiphesp.)蓼白粉菌(Erysiphepolygoni),上述研究均是通過形態學特征進行黃芩白粉病病原菌鑒定,但關于甘肅黃芩該病害病原菌分子生物學特征的研究和鑒定鮮見報道。因此,本試驗結合形態學和rDNA-ITS序列分析技術對甘肅省黃芩白粉病的病原菌進行鑒定,旨在明確該病害的病原菌種類,為科學診斷、研究發生規律和田間綠色防控提供科學依據;同時,測定白粉病對黃芩葉片葉綠素、電解質滲漏電導率、主要營養元素和微量元素含量的影響,為明確白粉病菌對黃芩脅迫的響應機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020-2021年7-8月,在甘肅省定西市隴西縣黃芩主產區白粉病嚴重發生的田塊,觀察并記錄病害相關的癥狀,采集病癥明顯的病枝將其置于保鮮袋中,保持新鮮狀態,及時帶回實驗室,編號以BF表示(表1),共獲得8份病樣。

表1 黃芩白粉病樣品采集地Table 1 Sample collection of Scutellaria baicalensis powdery mildew

1.2 病原菌分離純化及致病性測定

在采集的田間發病黃芩葉片上選取典型的白粉病病斑,將附著新鮮白粉病菌分生孢子的葉片置于待接種溫室培育的黃芩苗葉片上方4～7 cm處,輕輕刮取并振動葉片,使孢子抖落在黃芩幼苗葉片上。5 min后在花盆上方50 cm處噴霧保濕,以直接噴霧作為空白對照[7]。接種后在25 ℃左右的正常溫室隔離保濕管理,逐天觀察葉片發病情況。待出現明顯白粉病病癥后,挑取病原菌,觀察是否與原接種菌株形態相同。重復以上接種方法,獲得純化的白粉菌菌株,保存于室內活體黃芩苗植株上。

1.3 病原菌形態學觀察

無性態觀察:用透明膠帶粘取少量葉片上的白色粉狀物,將其置于滴有蒸餾水的載玻片上,蓋上蓋玻片制成臨時玻片。在顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子梗等形態,拍照并測量相關數據 (n=30)。

有性態觀察:取干凈的載玻片滴一滴無菌水于載玻片中心,選取發病癥狀典型的病葉,用無菌針挑取病葉上的白粉層和黃褐色閉囊殼至無菌水中,蓋上蓋玻片,輕輕按壓蓋玻片使子囊果破裂,溢出子囊和子囊孢子,觀察閉囊殼、子囊、附屬絲等形態,同時統計數目,拍照并測量相關數據 (n=30)。參考劉鐵志[8]和Braun等[9]的相關資料進行白粉菌形態學鑒定。

1.4 病原菌rDNA-ITS序列鑒定

用軟毛筆刷輕輕地將接種病葉表面的白粉菌刷至硫酸紙上,收集于無菌離心管中,采用CTAB法[10]提取病原菌基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取總DNA的完整性。利用白粉菌專用鑒定引物[11]ITS1和PM6進行PCR擴增,引物序列分別為:ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和PM6(5′-GYCRCYCTGTCGCGAG-3′),引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。PCR反應體系25 μL:2×PCR Master Mix 12.5 μL,DNA 1 μL,ITS1和PM6各1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃復性45 s,72 ℃延伸1 min,共循環30次;最后 72 ℃延伸5 min,4 ℃保存,備用。制備1.2%瓊脂糖凝膠,120 V電泳30 min,0.5 mg·L-1EB溶液中染色10 min,置于凝膠成像儀進行拍照并保存。

把具特異性條帶PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,將測序得到的序列與NCBI的GenBank數據庫中已知核苷酸序列進行相似性比較。下載與其高度同源的10個高氏白粉菌屬的代表種序列,以穆氏節絲殼菌(Arthrocladiellamougeotii)為外群,采用DNAMAN 7軟件對核苷酸序列進行多重比對,然后使用MEGA 5.2軟件以鄰接法構建系統發育樹,自展法進行檢驗,重復1 000次,確定病原菌的分類地位。

1.5 白粉病對黃芩葉片生理特性的影響

1.5.1 葉片電解質滲漏電導率測定 采用電導率法[12]測定黃芩葉片電解質滲漏電導率,具體為:采集同一田塊中自然發病和健康的黃芩葉片,帶回實驗室后剪成約1 cm×1 cm小片,稱取發病和健康樣品各2份,每份1 g,分別將一份加入50 mL蒸餾水后在常溫放置,另一份加入50 mL蒸餾水稱量后于電磁爐上煮沸15 min,冷卻后再稱量并補充蒸餾水至原質量;將上述處理后的樣品在室溫下浸提1 h,然后將葉片夾出,采用DDS-11A電導率儀分別測定不同處理的電導率。每個處理重復3次,分別取平均值。

1.5.2 葉片葉綠素含量測定 采用丙酮浸漬法[13]測定葉片葉綠素含量,具體為:采集同一田塊中自然發病和健康的黃芩葉片,帶回實驗室后剪成約1 cm×1 cm的小片,分別稱取0.1 g鮮樣浸泡在10 mL 80%丙酮中,直至葉組織完全變白。利用UV-8420紫外分光光度計分別測663、645、440 nm的光密度A663、A645和A440;每處理重復3次,取其平均值作為測定值,計算葉綠素含量

葉綠素a含量=12.7A663-2.59A645,葉綠素b含量=22.9A645-4.67A663,葉綠素a+b含量=20.3A645-8.04A663。

1.5.3 黃芩葉片主要營養元素含量測定 分別稱取0.05 g自然發病的病葉和健康葉片,烘干粉碎過40目篩(孔徑0.425 mm),置于消煮管中。采用550 ℃灼燒法(GB 5009.4-2016)、凱氏定氮法(GB 5009.5-2016)、酸水解法(GB 5009.9-2016)、直接滴定法(GB 5009.7-2016)分別測定總灰分、蛋白質(Kjeltec8200半自動定氮儀)、總糖和可溶性糖含量;采用自動定氮儀法(NY/T 2419-2013)、酸溶-釩鉬黃比色法(NY/T2421-2013)和酸溶-火焰光度法(NY/T2420-2013)分別測定全氮(Kjeltec8200半自動定氮儀)、全磷(Cary50紫外可見分光光度計)和全鉀(M410型火焰光度計)含量。以上每個處理重復3次,取其平均值。

1.5.4 黃芩葉片微量元素含量測定 分別稱取0.05 g自然發病的病葉和健康葉片,烘干粉碎過40目篩(孔徑0.425 mm),置于消煮管中。采用原子吸收分光光度法(GB/T 5009.90-2003食品中鐵、鎂、錳的測定,GB 5009.92-2003食品中鈣的測定)測定Fe、Mg、Mn、Ca微量元素含量(iCE3500原子吸收光譜儀);采用原子吸收光譜法(GB/T 5009.14-2003 食品中鋅的測定,GB/T 5009.13-2003 食品中銅的測定)測定Zn和Cu微量元素含量(iCE3500原子吸收光譜儀);采用干灰化—甲亞胺比色法(LY/T 1273-1999 森林植物與森林枯枝落葉層全硼的測定)測定全B含量(Cary50紫外可見分光光度計)。以上每個處理重復3次,取其平均值。

1.6 數據處理

采用DPS 2002軟件[14]進行數據統計分析和處理,用“平均值±標準誤”表示測定結果,分別對健康葉片和發病葉片生理特性進行單因素方差分析,依Duncan’s新復極差法檢驗差異顯著性 (P<0.05)和差異不顯著(P>0.05);采用Excel 2010制圖。

2 結果與分析

2.1 黃芩白粉病田間發病癥狀

黃芩白粉病病菌的菌絲體在葉、莖和萼片上雙生,致密,形成明顯的不規則白色斑塊。發病初期在葉片正面產生放射狀圓形斑(圖1-A),隨后病斑逐漸擴大連成一片,很快整個葉片正反面布滿了厚厚的一層白色粉狀物(圖1-B),即病原菌的分生孢子;發病后期白色粉層擴散至整個植株,葉片白色粉層上產生黃褐色或黑色小顆粒(圖1-C),即病原菌的閉囊殼。

A.田間發病癥狀;B.發病葉片正反面;C.發病后期癥狀

2.2 致病性測定

室內盆栽純化及致病性結果表明,接種培養20 d后,在接種黃芩葉片上觀察到大量白粉病菌,發病癥狀和自然發病類似(圖2-A),但對照葉片沒有發病(圖2-B)。將發病葉片上的白粉菌重新進行病原菌形態學鑒定,得到的病原菌和原來接種的病原菌種類一致,表明該菌是引起黃芩白粉病的病原菌。

A.室內接種后發病癥狀;B.對照 A.Symptoms after indoor inoculation; B.CK

2.3 病原菌形態特征鑒定結果

2.3.1 無性形態特征 菌絲寬4～7 μm,透明、薄壁且光滑;附著胞乳突狀,直徑4～8 μm;分生孢子梗37.5～47.5 μm×7.5～10 μm,足細胞柱狀直立,足細胞的基部隔高于與菌絲母細胞的連接處,上接1～3個短細胞;分生孢子串生,圓柱形或橢圓柱形,臍處有縊縮,大小為25～40 μm× 15～20 μm,長/寬為1.4～2.0;初生分生孢子頂部圓形,基部近截形;芽管短,前端具有膨脹的附著胞(圖3)。

A.分生孢子梗和分生孢子;B.分生孢子梗;C.分生孢子;D.初生孢子;E.分生孢子萌發;F.附著胞;比例尺:A～B為50 μm,C～F為20 μm

2.3.2 有性形態特征 閉囊殼球形,褐色,直徑85～150 μm,常聚生或少量散生于菌絲中;附屬絲呈菌絲狀,多數著生在子囊果一側,大多數彎曲不分支,基部顏色為褐色,向上逐漸變為無色;子囊球形、卵形或囊狀,通過短柄著生在閉囊殼內側,大小為45～75 μm×25～40 μm;1個子囊內含有2～8個子囊孢子,子囊孢子圓形或橢圓形(圖4)。病原菌有性和無性形態特征與文獻中琉璃草高氏白粉菌(Golovinomycescynoglossi)描述基本一致。

A.閉囊殼聚生;B.閉囊殼和附屬絲;C.破裂的閉囊殼;D.一個閉囊殼中含有6個子囊;E.未成熟的子囊;比例尺:A為100 μm,C和D為50 μm,B和E為20 μm

2.4 rDNA-ITS序列鑒定結果

用白粉菌專用鑒定引物ITS1和PM6對2020和2021年收集并完成回接的8個黃芩白粉菌的基因組DNA進行rDNA-ITS區擴增,并對擴增產物進行測定與分析,結果顯示:菌株堿基序列完全相同(核酸同源性100%),選取2020年采集的菌株BF-1序列進行后續分子生物學分析。將測序得到的序列經過BLASTn分析,結果顯示:該序列(GenBank登錄號:OL440406)與報道的高氏白粉菌屬(Golovinomycessp.)序列相似性達99%以上。下載和比對高氏白粉菌屬的10個代表種的序列,以穆氏節絲殼菌(A.mougeotii)為外群構建系統發育樹,發現菌株BF-1的序列與琉璃草高氏白粉菌(Golovinomycescynoglossi)(GenBank登錄號:MH189701)聚在同一支,同源性達98%(圖5)。綜合白粉菌無性和有性形態學特征以及rDNA-ITS分子生物學特征,將引起甘肅省黃芩白粉病的病原菌鑒定為琉璃草高氏白粉菌(G.cynoglossi)。

圖中分支上數值為1 000次自展檢驗置信度,標尺示遺傳距離

2.5 白粉病對黃芩葉片生理特性的影響

2.5.1 葉片電解質滲漏電導率 黃芩病葉電解質滲漏電導率為36.45 μS·cm-1,而健康葉片電解質滲漏電導率為19.27 μS·cm-1,兩者差異顯著(P<0.05)(圖6),結果表明,黃芩白粉病發生后葉片電解質滲漏電導率升高。

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05),下同

2.5.2 葉綠素含量 黃芩發病葉片葉綠素含量為1.84 mg·g-1,而健康葉片葉綠素含量為 3.08 mg·g-1,兩者差異顯著(P<0.05)(圖7),結果表明,黃芩白粉病發生后葉片葉綠素含量降低。

圖7 白粉病對黃芩葉片葉綠素含量的影響Fig.7 Effect of G.cynoglossi on chlorophyll content of Scutellaria baicalensi leaves

2.5.3 葉片主要營養元素含量 黃芩白粉病發生后,葉片主要營養元素總灰分和全P含量升高,而蛋白質、總糖、可溶性糖、全N和全K均降低(表2)。方差分析結果表明,黃芩病葉和健康葉片之間總灰分、蛋白質、總糖、可溶性糖、全N、全P和全K主要營養元素含量差異不顯著 (P>0.05),表明白粉病對黃芩葉片主要營養元素含量的影響不大。

表2 白粉病對黃芩營養元素含量的影響Table 2 Effect of G.cynoglossi on nutrient elements of Scutellaria baicalensi leaves

2.5.4 葉片微量元素含量 黃芩白粉病發生后,病葉微量元素Zn、Mn、Cu、Fe、Ca、Mg和B的含量均升高(表3)。方差分析結果表明,黃芩病葉和健康葉片之間Mn、Fe和B的含量差異顯著 (P<0.05),而Zn、Cu、Ca和Mg的含量差異不顯著(P>0.05)。

表3 白粉病對黃芩葉片微量元素含量的影響Table 3 Effect of G.cynoglossi on micro element of Scutellaria baicalensi leaves

3 討論與結論

白粉病在世界各地廣泛分布,在蔬菜、花卉、果樹和牧草等植物上均可發生;白粉菌寄主范圍廣,為害較大,對植物的產量造成重大損失。白粉菌是一類植物專性寄生性真菌,人工培養困難,僅依靠形態鑒定在分類上存在很大爭議,近年來分子生物技術廣泛應用于白粉菌種類鑒定、系統發育和進化研究[15-18]。

關于黃芩白粉病的病原菌國內一些學者僅通過形態學特征鑒定為白粉菌屬(Erysiphesp.)、二孢白粉菌(E.cichoracearum)、脈革粉孢菌(O.ambrosiae)和蓼白粉菌(E.polygoni)等[3-6]。本試驗通過2年時間在隴西縣不同地區調查和采集黃芩白粉病發病葉片,觀察其無性和有性時期的形態特征,同時首次采用白粉菌專用鑒定引物ITS1和PM6對其ITS區域進行擴增測序及系統發育分析,鑒定出黃芩白粉病的病原菌為琉璃草高氏白粉菌(G.cynoglossi),該結果與以上學者的不一致,這可能與目前關于黃芩白粉病病原研究少,且均為早年研究結果,未進行分子生物學方面的鑒定,結果可能不準確有關,另一方面也與中國不同地區的氣候條件存在明顯差異等因素有關。例如,丁卓等[19]研究發現引起葫蘆科作物的白粉病菌有很多,不同地區致病的菌種并不相同;李金鴻等[20]發現黃芪白粉病的病原菌也因地區差異而不同。據報道,琉璃草高氏白粉菌(G.cynoglossi)可引起紫草科(Boraginaceae Juss.)長葉微孔草(Microulatrichocarpa)、毋忘草(Myosotissylvatica)和西亞琉璃草(Omphalodescappadocica)白粉病[21-23],本研究發現該病原菌也可以侵染唇形科(Lamiaceae)中藥材黃芩,導致黃芩白粉病發生。一些研究表明,白粉菌以閉囊殼和菌絲體隨著病殘體在地表越冬,翌年溫濕度條件適宜時侵染寄主植物,病部產生的分生孢子借風雨傳播進行再侵染,加重病害的發生;田間栽培的植株在郁閉、陰濕等環境條件下發病較重,這表明在白粉病發病初期及時進行有效防治和收獲期徹底清除田間病葉、病株殘體對切斷病原菌的傳播有重要作用[24]。

病原菌侵染不但影響植物葉片的光合作用,而且破壞葉片內部的組織[25]。本試驗得出,黃芩發病葉片電解質滲漏電導率升高,葉綠素含量降低,這是由于白粉菌侵染黃芩葉片后,葉片內部細胞結構發生很大變化,葉綠素分解速率高于合成速率,導致葉片葉綠素的含量降低;同時葉片內部細胞壁破壞和細胞膜受到損傷,葉片細胞的透光性增強,大量水分從細胞內部流出,導致電解質滲漏電導率升高。病原菌不僅造成植物葉片光合作用受阻,還會影響葉片主要營養元素(N、P、K)和微量元素(Fe、Zn、Cu、Mn、Ca、Mg、B等)的吸收與含量變化。營養元素和微量元素在植物生長發育過程中對細胞結構的構成、調節生命活動、維持內部環境穩定、參與能量轉化和物質運輸等起到十分重要的作用[26]。當植物缺乏一種或多種營養元素和微量元素時,往往在不同程度上導致一些生理性病害和病理性病害發生[27]。朱錦惠等[28]和王如月等[29]研究發現,植物體內氮含量增加,相應的可溶性氮化物容易增多,通常會誘發病原菌發生,導致白粉病加重發生;植物體內鉀含量不足,淀粉合成過程會減弱,酚類化合物減少,氣孔開關調節能力下降,導致植物的發病率升高;植物體內磷含量不足,核酸與蛋白質的合成受阻,老葉最先受到危害,快速脫落;同時植物通過不同的機理、途徑和方式等吸收一些微量元素來激活抗菌物質,進而達到提高抗病力;相反,當植物遭到病原菌侵染,總會導致一些營養元素和微量元素的含量發生相應的變化。本試驗首次得出黃芩白粉病發生后,主要的營養元素全N、全K的含量降低,而全P的含量增加;一些微量元素Zn、Mn、Cu、Fe、Ca、Mg和全B的含量升高,關于這些營養元素和微量元素與白粉菌之間的發病機制有待于進一步研究。