接骨木鐮刀菌產嘔吐毒素條件篩選及致病性分析

肖萌萌,賀付蒙,馮 旭,徐永清,蔣先鋒,王 雪,劉 丹,李鳳蘭

(東北農業大學 生命科學學院,哈爾濱 150030)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是人類的主要食物來源之一[1]。然而,馬鈴薯干腐病作為一種常見的貯藏病害,嚴重影響馬鈴薯的品質和市場價值[2]。據估計,約有6%～25%的馬鈴薯儲藏期產量損失是由干腐病造成的[3-4]。鐮刀菌是馬鈴薯干腐病的主要病原菌[5],閔凡祥等[6]和李鳳蘭等[7]鑒定了黑龍江省馬鈴薯干腐病主要病原菌有7個種及變種,分別為擬枝孢鐮刀菌(Fusariumsporotriodides)、擬絲孢鐮刀菌(F.trichothecioides)、茄腐鐮刀菌(F.solani)、接骨木鐮刀菌(F.sambucinum)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、茄腐鐮刀菌藍色變種(F.solanivar.coeruleum)和黃色鐮刀菌(F.culmorum)。其中接骨木鐮刀菌致病性最強,是甘肅、黑龍江、河北等馬鈴薯主產區的優勢病原菌[8]。研究表明鐮刀菌能產生次級代謝產物鐮刀菌毒素,從而使植物致病。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又名嘔吐毒素,是馬鈴薯干腐病致病鐮刀菌分泌的毒素之一,被認為是重要的致病因子[9]。

1972年,嘔吐毒素在日本的赤霉病大麥中首次分離得到,并進行鑒定和命名[10]。其化學名稱為3α,7α,15-三羥基草鐮孢菌-9-烯-8-酮,分子式為C15H20O6,在水和極性溶劑中溶解度良好[11]。嘔吐毒素理化性質較穩定,在弱酸條件具有較強的耐受性,而在堿性條件下不穩定[12]。嘔吐毒素作為一種霉菌毒素常見于動物飼料中,通過動物腸道進入機體產生毒理作用[13]。其產量受各種因素的影響,菌株是關鍵因素[14]。Bajestani等[15]通過研究小麥對真菌提取物、孢子懸液、嘔吐毒素的防御反應,發現低濃度嘔吐毒素能誘導小麥系統獲得性抗性的產生,從而提高對瘡痂病的抗性。研究表明低濃度嘔吐毒素處理馬鈴薯提高了薯塊防御酶和抗氧化酶的活性,從而有效提高了馬鈴薯的抗病性[16]。毒素能夠在感病組織中或人工培養條件下獲得[17]。通過對苦瓜枯萎病菌毒素[18]、玉米伏馬毒素[19]和赭曲霉毒素A[20]產生條件的研究表明,人工培養條件下毒素產量與培養時間、環境等條件有關。目前對于嘔吐毒素產生條件的研究較少。

為探討嘔吐毒素與馬鈴薯抗病誘導的相關性,首先需要培養出大量的嘔吐毒素,然而對于接骨木鐮刀菌產嘔吐毒素的培養條件迄今未見報道。本研究以接骨木鐮刀菌為研究對象,通過響應面法探究嘔吐毒素產生條件,研究接骨木鐮刀菌在產毒條件、毒素積累動態變化規律、霉變程度與嘔吐毒素之間的關系,為窖藏馬鈴薯提供用于指導防控實踐的理論依據,有望在最大程度上降低馬鈴薯干腐病的風險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試致病鐮刀菌為接骨木鐮刀菌(F.sambucinum),供試植物為大西洋馬鈴薯,均由東北農業大學寒地藥用植物資源實驗室保存。嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒(NO.HEM0896/HEM0848)由中國北京華安麥格納奇生物科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 毒素粗提液制備 將置于25 ℃恒溫培養箱中暗室培養的鐮刀菌用研缽進行粉碎處理,然后轉到錐形瓶中,取100 mL提取液[V(乙腈)∶V(水)=84∶16],充分攪拌后密封。用超聲震蕩法提取1 h,抽濾后收集濾液,轉至旋轉蒸發儀內65 ℃旋轉蒸干,然后用色譜級純甲醇4 mL溶解瓶壁殘留物,以10 000 r/min離心5 min,取上清液為毒素粗提物,4 ℃保存,以備后續試驗。

1.2.2 LC-MS分析 將毒素粗提液用注射器和0.45 μL濾膜進行過濾,然后裝入棕色小瓶,再加入100 μL的0.1 mol/L冰醋酸促進電離,進行樣品檢測。色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流速0.25 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量10 μL,流動相A為 0.05%甲酸和1 mmol/L乙酸銨水溶液,B為甲醇,梯度洗脫條件為0～11 min,20%～40%B; 11～16 min,40%～70%B;16～25 min,70～95%B;95%B沖洗10 min;每次進樣前用20%B平衡柱子,10 min。

1.2.3 單因素試驗及設計方案 分別考察碳源種類(乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖)、培養時間 (10 d、15 d、20 d、25 d、30 d)、碳源濃度(10 g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L、18 g/L)、培養溫度 (20 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、30 ℃)、pH(5.7、5.9、6.1、 6.3、6.5)等因素對嘔吐毒素產量的影響,采用酶聯免疫法測定嘔吐毒素的含量,平行試驗3次,結果取平均值,確定最佳產毒條件。

1.2.4 響應面設計 以單因素試驗結果為基礎,選擇培養時間、溫度和pH 3個因素,應用Design-Expert v8.0.6軟件采用4因素3水平的Box-Behnken響應面試驗設計法,每個因子設置為高、中、低3個水平(-1,0,1)作出響應曲面圖。

1.2.5 毒素在致病性中的作用 方法參照單瑋玉等[21]略有改進,將大西洋馬鈴薯消毒后,用打孔器打出直徑為1 cm深1.5 cm的孔,以水為對照,以300 μL濃度為10 ng/mL的嘔吐毒素為處理組,經6 h后將培養好的接骨木鐮刀菌挑取菌絲并接種在馬鈴薯體內,在25 ℃恒溫培養箱暗室中培養10 d后調查發病率和病情指數。試驗設3次重復,每次重復選5個塊莖,根據病斑面積占薯塊表面積的百分比分為5級,標準為:0級塊莖無病斑,1級病斑面積為5%以下,2級病斑面積為6%～15%,3級病斑面積為16%～30%,4級病斑面積為31%～50%,5級病斑面積為50%以上。病情指數=Σ(各級發病塊莖×相對級數值)/(總塊莖數×最高病情級數)×100。

1.2.6 數據處理 采用Microsoft office Excel 2007和SPSS 17.0軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 鐮刀菌的毒素分析

用LC-MS檢測樣品發現(圖1),嘔吐毒素標準品的保留時間在樣品里也有峰,且嘔吐毒素的含量為6.10 ng/mL(表1)。

表1 LC-MS檢測嘔吐毒素標準品和樣品的嘔吐毒素含量Table 1 Vomitoxin content of vomitoxin standards and sample tested by LC-MS

A.為標準品;B.為檢測樣品

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 碳源種類 由圖2-A可知,接骨木鐮刀菌在不同的碳源培養基上都能產生嘔吐毒素,但產毒量有顯著差異。在以葡萄糖為碳源時,鐮刀菌產嘔吐毒素量最高,達到1.38 ng/mL;以乳糖為碳源時,嘔吐毒素產量最低為0.57 ng/mL,因此選擇葡萄糖作為碳源。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 培養時間 由圖2-B可以看出,培養前期嘔吐毒素產量變化較為平緩,隨著培養時間的延長,在20～25 d產毒速率明顯加快,產毒量最高為2.25 ng/mL,并在25 d后產毒量出現下降趨勢,說明培養時間影響鐮刀菌產嘔吐毒素的能力。因此將25 d作為最優條件繼續培養,并將響應面試驗的培養時間設置為20～30 d。

2.2.3 培養溫度 圖2-C顯示,當培養溫度由20 ℃上升到25 ℃時,隨著溫度的升高,接骨木鐮刀菌產生的嘔吐毒素濃度逐漸升高,并且在23 ℃至25 ℃過程中產毒速率加快,當培養溫度繼續升高,毒素含量逐漸降低,產毒量趨于平緩,說明溫度過高或過低都不利于接骨木鐮刀菌產毒,可能是因為溫度會影響酶活。在培養溫度為25 ℃時,達到最高產毒量1.85 ng/mL,因此將響應面優化試驗的培養溫度設置為23～27 ℃。

2.2.4 pH 由圖2-D可見,隨著pH由酸性到弱堿性過程中,嘔吐毒素含量呈現先升高后降低趨勢,具體表現為pH 為5.9～6.1的條件下毒素含量迅速升高,然后逐漸降低,故確定以pH 5.9、6.1和6.3進行響應面優化分析。

2.2.5 碳源濃度 檢測碳源不同添加量對嘔吐毒素的產生情況,如圖2-E所示,隨著碳源濃度持續上升,嘔吐毒素產量趨于平緩,表明碳源濃度對接骨木鐮刀菌產嘔吐毒素的能力影響不大。

2.3 接骨木鐮刀菌產嘔吐毒素條件優化

2.3.1 響應面試驗結果與回歸方程的建立 選擇A(培養時間)、B(培養溫度)、C(pH),根據嘔吐毒素含(Y)的響應值,考察3個因素對鐮刀菌產嘔吐毒素的影響(表2),進行3因素3水平產毒條件響應面優化。結果如表3所示,分析得到嘔吐毒素含量(Y)對編碼變量A、B、C的二次多項回歸方程為:Y=2.42+0.35A+0.16B+ 0.063C-0.050AB+0.15AC+0.020BC- 0.77A2-0.10B2-0.55C2。

表2 響應面試驗因素水平Table 2 Response surface test factor level

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface test design and result

由方差分析可知(表4),該響應面模型具有顯著性,回歸極顯著(P<0.000 1),失擬項不顯著(P=0.461 7)。R2為0.995 2,Radj=0.989 1,表明預測值與實際值有較高的相關性,擬合良好。因素一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2的P值均小于0.05,表明它們對鐮刀菌產嘔吐毒素有較大影響,交互項只有AC對嘔吐毒素產量有顯著影響(P<0.05)。進一步說明該方程與實際結果擬合較好,可靠性高。可用于嘔吐毒素含量的分析與計算;從各項F值可以看出,嘔吐毒素含量關鍵因素的關系為:A>B>C,即培養時間> 培養溫度>pH。

表4 響應面法方差分析Table 4 Response surface analysis of variance table

2.3.2 響應面模型分析 根據回歸方程得到嘔吐毒素含量與培養時間、培養溫度和pH 3個因素的3D響應面模型(圖3),均為開口向下的凸形曲面,表明在考察范圍內存在響應值的極大值,由圖3-A可知培養時間對嘔吐毒素含量的影響較大,隨著培養時間和培養溫度逐漸增加,嘔吐毒素含量呈先升高后降低的趨勢。在培養時間24～28 d,培養溫度24～27 ℃時,嘔吐毒素含量處于較高水平。在固定培養溫度的情況下,如圖3-B所示,培養時間與pH反映出一定的交互作用,隨著培養時間的延長及pH增大,嘔吐毒素含量呈先升高后降低的趨勢,嘔吐毒素含量最大值出現在培養時間24～29 d,pH 6.0～ 6.3時。由圖3-C可知,在固定培養時間的條件下,嘔吐毒素產量隨培養溫度及pH升高呈現先升高后降低的趨勢,在pH為6.0～6.3,培養溫度24～27 ℃時,嘔吐毒素含量在較高范圍內。綜上所述,嘔吐毒素含量的最大值出現的條件為:培養時間24～28 d,培養溫度24～27 ℃,pH 6.0～6.3。

A.培養溫度和培養時間;B.培養時間和pH;C.培養溫度和pH

2.3.3 優化工藝驗證 由Design-Expert V8.06軟件求解回歸方程,得出嘔吐毒素含量最大時的條件為:以葡萄糖為碳源,培養溫度26.19 ℃、pH 6.12、培養時間25.38 d。在此條件下,嘔吐毒素含量預測值為2.50 ng/mL。綜合試驗操作的可行性,調整產毒條件為:培養溫度26 ℃、pH 6.1、培養時間25 d,進行3次重復試驗,嘔吐毒素含量為2.57 ng/mL,與預測值相差不大,說明此條件可以有效提高接骨木鐮刀菌產嘔吐毒素含量。

2.4 毒素在致病性中的作用

由圖4和表5可知,用水(A)處理的馬鈴薯病健交界區域寬,呈現淺褐色,病健交界線不明顯且有蔓延趨勢,病情指數為61.3。而用嘔吐毒素(B)處理馬鈴薯,病斑平均直徑均小于水處理,病情指數為41.3。薯內病健交界區域極窄且呈現深褐色,病健交界線更為清晰明顯,嘔吐毒素處理的塊莖病斑明顯小于水處理,且嘔吐毒素處理后病斑幾乎無蔓延。

表5 毒素致病性分析Table 5 Pathogenicity analysis of toxins

A.水+鐮刀菌處理;B.DON+鐮刀菌處理

3 討 論

鐮刀菌毒素的產生受到許多因素影響,如溫度、pH和時間等[22-23]。研究表明小麥貯藏階段的嘔吐毒素在溫度為25～30 ℃時大量積累[24]。唐亞梅等[25]利用響應面分析法對硫色鐮刀菌體外產毒條件進行篩選,結果表明溫度 22.2 ℃及pH 5.1最有利于產毒,鐮刀菌會隨著溫度的升高而快速生長,但產毒能力也會受到抑制[22]。本研究也出現類似趨勢,在25 ℃產毒量最高,溫度過高會造成酶失活,不利于鐮刀菌產毒。李俊霞等[26]在對四川玉米串珠鐮刀菌進行研究時發現其最佳產毒pH為5。本研究發現酸性條件有利于鐮刀菌產毒,研究結果與Merhej等[27]的研究類似。閆海霞[28]研究表明:禾谷鐮刀菌中嘔吐毒素的產量與時間呈近似拋物線關系且在30 d時產毒最高。而本研究中接骨木鐮刀菌在25 d產毒量達到高峰,這可能是由于菌株不同而造成的差異。

嘔吐毒素可以引起植物的代謝物轉化、氧化應激反應等一系列寄主防御反應[29]。低濃度嘔吐毒素作為激發子處理馬鈴薯,提高了幾丁質酶活性以及木質素、花青素的積累[16]。從鐮刀菌毒素與致病性的試驗結果來看,毒素處理的馬鈴薯病健交界區域極窄,無蔓延趨勢,說明低濃度嘔吐毒素誘導了馬鈴薯的防御反應,合成木質素以及酚類等物質,病健交界處呈現深褐色,阻止了病斑進一步蔓延。鐮刀菌及毒素與馬鈴薯的互作是極其復雜的過程,包括鐮刀菌產生的代謝產物以及馬鈴薯防御反應產生的酶及其他抗性物質,嘔吐毒素對馬鈴薯的這種抗性誘導是否會在分子水平對馬鈴薯塊莖具有影響需要進行更多的研究和 分析。