2015-2020年FAdV-4安徽流行株全基因組測序分析及不同感染途徑的致病性研究

趙 磊,張留君,劉欣超,陳芳芳,劉 暢,張訓海

(1.安徽科技學院,家禽疫病防控監測安徽省重點實驗室,安徽鳳陽 233100;2.安徽農業大學 動物科技學院,合肥 230036)

禽心包積液-肝炎綜合征(Hydropericardium-hepatitis syndrome,HHS)是一種由Ⅰ群血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirusserotype4,FAdV-4)致病毒株引發的以心包積液、肝臟和腎臟炎癥為特征的禽類傳染病[1]。該病首次報道于1987年巴基斯坦安卡拉地區肉雞群,也稱雞“安卡拉病”,隨后擴散至美國、墨西哥、印度、俄羅斯、日本、韓國等國家,給世界養禽業造成了重大經濟損失[2-3]。中國最早從2013年發生的HHS病例中分離到FAdV-4新型高致病性江蘇JSJ13株和廣西GX2013株[4-5],2015年起,在山東、江蘇、安徽、河南、湖北等多省份開始暴發性流行HHS疫情,病禽死亡率達20%～80%,主要發生于3～5周齡肉雞,后期報道了5～11周齡的雞、鴨、鵝、鴿、鴕鳥等禽類均可感染發病[6-8]。該病毒既可水平傳播,亦可垂直傳播,嚴重威脅中國養禽業可持續健康發展。

禽腺病毒為無囊膜的雙股DNA病毒,分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個群,Ⅰ群FAdV可分為5個種(A～E)及12個血清型(1～7、8a、8b、9～11)。FAdV-4屬于C種成員,其基因組全長為43～45 kb[1-2]。2015年以來,學者先后報道中國FAdV-4流行株的分離與全基因組序列,國內FAdV-4流行株與國外經典毒株存在基因組多處差異以及1 966 bp基因缺失的顯著特征[4-6]。安徽省最早報道亳州的FAdV-4CH/AHBZ/2015株全基因組序列,隨后又報道了AHHN、AH712、AH726、AH-F18、AH-F19等毒株序列,其全長均為43.7 kb,但分離自120日齡蛋雞群的AH-F19株在非結構蛋白100 ku上已出現11個氨基酸突變,該蛋白具有協助病毒組裝和提高增殖效率作用[6,9-11]。FAdV-4編碼主要外部衣殼蛋白為六鄰體(Hexon)、五鄰體(Penton)和兩種纖突蛋白(Fiber-1和Fiber-2),其中Hexon蛋白具有種型特異性抗原決定簇,也是中和抗體的靶標,Fiber-2蛋白通過識別細胞受體輔助病毒侵入細胞,二者均是毒力關鍵蛋白[12-14]。根據毒力差異,FAdV-4可分為致病性的HHS毒株(MX-SHP95、AG234、JSJ13、HB1510株等)和不致病的HHS弱毒株(ON1、KR5、B1-7株等),FAdV-4致病株的不同途徑感染也可造成禽群的死亡率差異[15]。本研究以2015-2020年安徽地區引發HHS疫情的6株FAdV-4毒株為研究對象,通過病毒全基因組測序分析,以及人工感染與自然感染對10日齡SPF雞的致病性分析,旨在分析FAdV-4安徽株的遺傳特征和不同感染途徑的致病性差異,為該病的科學防控提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 毒株及主要材料

CH/AHMC/2015株(蒙城縣海蘭褐蛋雞場,55日齡)、CH/AHHQ/2016株(霍邱縣黑鳳雞場,52日齡)、CH/AHWH/2018株(五河縣青腳麻黃雞場,92日齡)、CH/AHMG/2018株(明光市青腳麻雞場,62日齡)、CH/AHMG/2019株(明光市黃羽雞場,50日齡)和CH/AHMC/2020株(蒙城縣麻雞場,35日齡)均由家禽疫病防控監測安徽省重點實驗室分離、純化并保存;SPF雞種蛋購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司;10日齡SPF雞由安徽科技學院SPF實驗動物中心孵化并飼養于禽用隔離器內;E.Z.N.A.TMViral DNA Kit購自OMEGA公司;TaqDNA聚合酶、dNTP、10×TaqBuffer、DNA Marker均購自TaKaRa公司。

1.2 病毒增殖與核酸提取

將6株FAdV-4種毒分別經尿囊腔途徑接種9日齡SPF雞胚各5枚,0.1 mL/枚。孵化、觀察并收集24 h后死亡雞胚肝臟,肝組織勻漿后 16 000×g離心5 min,取上清液按E.Z.N.A.TMViral DNA Kit說明書提取病毒核酸,并測定核酸濃度。

1.3 病毒全基因組測序與組裝

將所提取的6株FAdV-4安徽流行株病毒核酸送至上海探普生物科技有限公司進行核酸片段化和文庫構建,并利用illumina二代測序技術進行病毒基因組測序,應用SPAdes和MEGAHIT軟件對測序數據進行分析和組裝。由于FAdV-4具有保守的末端序列,因而設計并合成4對引物(表1)進行末端序列PCR擴增。PCR產物經電泳鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,采用SeqMan程序拼接獲得6株病毒全基因組序列。

1.4 序列比對與遺傳進化分析

對6株病毒全基因組序列采用MegAlign程序與已公布的HB1510、JSJ13、ON1、MX-SHP95等代表毒株序列進行核苷酸和結構蛋白氨基酸序列比對分析。采用MEGA 6.0.6分析軟件Neighbor- joining法對6株病毒及C群FAdV毒株進行hexon和fiber-2基因構建進化樹。

1.5 ELD50的測定

對FAdV-4 CH/AHMC/2015株種毒用滅菌PBS作10倍系列稀釋成6個梯度(10-1～10-6),經卵黃囊途徑接種8日齡SPF雞胚,每個梯度接種6枚,0.1 mL/枚。孵化并觀察記錄雞胚死亡數量和病變情況,按Reed-Muench方法計算其ELD50。

1.6 FAdV-4不同感染途徑對SPF雛雞的致病性試驗

在安徽科技學院SPF實驗動物中心(實驗動物使用許可證:SYXK(皖)2013-007)孵化出雛并飼養至10日齡的90只SPF雞,隨機分成4個攻毒組(皮下注射組20只、口服組20只、點眼組10只、滴鼻組10只),攻毒組每只雞接種103.0ELD50/0.1mL的CH/AHMC/2015毒株,同時,在各攻毒組中另置5只健康雞與之同群混養;對照組10只,每只頸背部皮下注射0.1 mL PBS。將試驗雞按組飼養于屏障系統中的5臺禽用負壓隔離器內,每日觀察雞只精神狀態和死亡數量,持續觀察28 d,計算發病率和死亡率,對病死雞剖檢觀察并記錄病變。

2 結果與分析

2.1 6株FAdV-4毒株的核酸濃度測定

CH/AHMC/2015、CH/AHHQ/2016、CH/AHWH/2018、CH/AHMG/2018、CH/AHMG/2019和CH/AHMC/2020株經增殖后提取病毒核酸DNA,質量濃度分別為196.5、255.3、 271.4、266.4、241.1和183.4 ng/μL。

2.2 6株FAdV-4毒株全基因組序列與特征

經illumina測序組裝獲得CH/AHMC/2015、CH/AHHQ/2016、CH/AHWH/2018、CH/AHMG/2018、CH/AHMG/2019、CH/AHMC/2020株FAdV-4病毒基因組序列為 43 445、43447、43 463、42 089、43 612、43 608 nt,另對6株病毒基因組保守的兩端部分序列進行PCR擴增與測序,最終組裝6株病毒全基因組序列,分別為43 721、43 721、43 723、43 721、43 723、43 719 nt,上傳至GenBank,登錄號分別為MG148335、MG148334、MN606302、MN606303、MZ020785和MZ066624。

6株病毒基因組G+C含量均為54.87%,末端倒置重復序列(ITR)均為56 bp,編碼43個開放閱讀框,其核苷酸同源性達99.97%,與國內主要流行株同源性為99.56%～100%,其中CH/AHHQ/2016株與HB1510株100%同源。6株病毒與國外經典毒株ON1、KR5、B1-7、MX-SHP95株基因組同源性為98.45%～98.78%,與同處C種的FAdV-10型C2-B-FAdV-10株同源性為98.5%。對比代表株HB1510株,6株病毒在13個核苷酸位點存在變異(表2),其中5個核苷酸突變導致編碼氨基酸的變化,即ORF24(L127V)、100K(S115F)、Fiber-1(A46T)、Fiber-2(F44Y)以及ORF16(T119A)突變。對比早期分離的江蘇JSJ13株ORF29基因發現,國內毒株在ORF29基因上存在多種差異,6株病毒及國內主要流行株均缺失33 nt,山東SDSX1株(KY636400)缺失100 nt,黑龍江HLJ/151118株(KX061750)、河南HN/151025株(KU245540)和HN/151029株(KX090424)均缺失144 nt。

多序列比對分析顯示,國外ON1、KR5、B1-7、MX-SHP95、AG234株在19518位GA重復均為4～5個,而國內毒株主要為8～11個;除廣西GX2019-014株外,國內毒株在非編碼區1 822位點插入10個堿基(TAACTGATTG),在33 ku蛋白aa76位缺失CCCCCT(編碼2個脯氨酸),在ORF43的aa198位插入ATA(編碼異亮氨酸),另有1 966 bp(ORF19/ORF48/ORF27)基因缺失,提示中國FAdV-4主要流行株具有獨特的基因遺傳標志。

對27株FAdV-4毒力關鍵蛋白Hexon和Fiber-2分析顯示(表3),在是否引發HHS方面,Hexon蛋白aa188、Fiber-2蛋白aa219和aa380 3 個位點的氨基酸具有一定特征性,19株致HHS毒株的3個位點氨基酸主要為R、D、T,僅個別差異毒株,如中國廣西GX2019-014株(R、G、A)和GX-1株(R、A、T),韓國Kr-Andong和Kr-Changnyeong株(I、D、A),俄羅斯Krasnodar株(R、D、D),提示致病性FAdV-4毒株在此3 個位點存在變異株。非致HHS毒株主要為I/V、G、A,僅墨西哥弱毒疫苗INT4-ATTENUATED-AG234株為R、R、T。

表3 本研究毒株與參考毒株Hexon和Fiber-2蛋白的3 個氨基酸位點特征Table 3 Characteristics of three amino acid sites of Hexon and Fiber-2 inisolated and reference strains

2.3 hexon和fiber- 2基因遺傳演化分析

FAdV-C種hexon基因324～951位進化樹顯示(圖1-A),C種FAdV可區分為FAdV-4和FAdV-10兩個血清型,6個毒株均屬于FAdV-4型,與國內HB1510、JSJ13株及巴基斯坦PARC-1/98株(LC504494)處于同一分支,其與2007年印度KC株(EU177545)hexon全基因同源性高達99.8%;6個毒株與韓國、俄羅斯、墨西哥分離株以及不致HHS弱毒株遺傳距離較遠。fiber-2基因51～1 390位進化樹顯示(圖1-B),6個毒株與巴基斯坦K31、科威特K99-97、印度IV37株遺傳關系相近。上述結果表明,國內FAdV-4流行株與巴基斯坦、印度分離的毒株遺傳關系最近。

A.hexon;B.fiber- 2

2.4 CH/AHMC/2015株ELD50的測定結果

FAdV-4 CH/AHMC/2015株種毒以10倍稀釋經卵黃囊接種8日齡SPF雞胚后,雞胚死亡時間集中在接種后第6～10天,按Reed-Muench方法計算其ELD50為105.3ELD50/0.1mL。

2.5 雛雞致病性試驗結果

試驗期間,對照組雞均無異常。皮下注射組2 dpi開始發病,3 dpi達到發病高峰并出現死亡,4 dpi出現死亡高峰,總發病率和死亡率分別達100%和90%;口服組5 dpi開始發病,6 dpi死亡3只,7 dpi死亡1只,總發病率和死亡率分別為55%和20%;點眼組5 dpi開始發病,7 dpi死亡3只,8 dpi死亡1只,總發病率和死亡率分別50%和40%;滴鼻組5 dpi開始發病,6 dpi死亡3只,7 dpi死亡1只,9 dpi死亡1只,總發病率和死亡率分別為60%和50%(表4、圖2)。皮下注射組同群混養雞總發病率和死亡率分別為40%和20%(8 dpi死亡1只),其余3組同群混養雞發病率均在20%,但均未出現死亡,可見自然接觸感染雞的發病率、死亡率均顯著低于相應人工感染組(表4)。各組發病雞均表現為精神沉郁,廢食呆立或臥地,羽毛粗亂,拉黃綠色稀糞。病死雞剖檢可見心包積有淡黃色澄亮液體(圖3-A),心房內有血凝塊;腎臟尿酸鹽沉積呈花斑色(圖3-B);胰腺有白色壞死點,個別雞胰腺有液化壞死灶(圖3-C)。

圖2 FAdV-4 CH/AHMC/2015株不同途徑攻毒SPF雞的死亡情況Fig.2 Death of SPF chickens infected by different ways of FAdV-4 CH/AHMC/2015 strain

A、B、C.攻毒組病變;A.皮下注射組雞心包積液;B.滴鼻組雞腎臟尿酸鹽沉積;C.皮下注射組雞胰腺液化壞死灶;D、E、F.對照組

表4 FAdV-4 CH/AHMC/2015株攻毒10日齡SPF雞發病率和死亡率Table 4 Morbidity and mortality of 10-day-old SPF chickens infected with FAdV-4 CH/AHMC/2015 strain

3 討 論

本研究測定的2015-2020年安徽地區6株FAdV-4流行株及已報道的CH/AHBZ/2015、AHHN、AH712、AH726、AH-F18和AH-F19株基因組全長均在43 719～43 725 nt,其核苷酸同源性達99%以上,僅AH-F19株在非結構蛋白100 ku上存在一定差異,其余11株與國內流行代表株HB1510株僅有個別氨基酸變化,表明2015-2020年安徽地區FAdV-4流行株具有國內主要流行致病株特征。國內主要流行株與早期分離的JSJ13株相比均存在ORF29基因缺失33 nt,但已有SDSX1、HLJ/151118、HN/151025和HN/151029毒株在該基因上缺失更多核苷酸。另有研究報道,貴州分離的GZ-BJ株基因組全長為43 352 nt,比國內主要流行株短371 nt,少6個ORF(22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF42、ORF28、ORF17)[16];秦皇島致病株QHD2021株全基因組長為44 225 nt,比國內主要流行株長約500 nt,與HB1501株核苷酸同源性僅 94.3%[17];廣西分離株GX2019-014不同于國內主要流行株的遺傳特征,而與國外ON1、B1-7、MX-SHP95等經典株更為相似[18]。出現基因缺失或插入的FAdV-4變異株是病毒與宿主協同進化的表現,但其基因組差異可能造成的生物學特性改變需要更深入的綜合評估。

研究表明,中國流行的FAdV-4為新型高致病性毒株,其1 966 bp片段缺失、替換弱毒fiber-1及penton基因均不影響其毒力,而hexon和fiber-2基因是毒力關鍵基因,Hexon和Fiber-2蛋白上均有中和性表位[13,19-20]。本研究發現Hexon蛋白aa188、Fiber-2蛋白aa219和aa380 3個位點的氨基酸存在一定特征性,致病毒株主要為R、D、T。Zhang等[21]驗證了Hexon蛋白aa188位R→I突變株完全喪失了對SPF雞的致病性,然而,存在差異的有韓國報道的4個致病株Hexon蛋白aa188位卻均為I[22],弱毒INT4-ATTENUATED-AG234株卻為多數致病株特征的R[23]。致病株Fiber-2蛋白aa219D和aa380T也存在差異性毒株,如中國GX2019-014、GX-1,韓國Kr-Andong、Kr-Changnyeong、Kr-Yeoju、Kr-Gunwi和俄羅斯Krasnodar株[18,22,24]。進而提示,FAdV-4的毒力關鍵蛋白和氨基酸位點存在毒株差異性,應對主要優勢毒株進行疫苗免疫防制,同時對此3個位點變異株進行流行病學監測與研究。雛雞致病性試驗結果顯示,以直接突破動物機體物理屏障的皮下注射法致死雛雞最快且死亡率最高,而經消化道黏膜、眼結膜、呼吸道黏膜等天然免疫防御屏障人工感染的雛雞發病和死亡時間較皮下注射組均推遲約3 d,死亡率為20%～50%;以模擬自然接觸傳播的各組同群混養雞發病率和死亡率最低,僅皮下注射組的混養雞死亡率為20%,可能由皮下注射組環境中短期內FAdV-4活病毒載量高于其他3組,進而該組混養雞接觸感染病毒劑量相對較高。趙玉杰等[15]對21日齡SPF雞采用皮下注射、口服、滴鼻感染FAdV-4的死亡率分別為80%、20%、50%,與本研究結果相似。Li等[25]建立FAdV-4氣溶膠傳播模型證實該病毒可經空氣傳播,但經空氣傳播感染病毒的劑量不足以引起雞群發病和死亡,這符合本研究同群混養雞自然接觸感染劑量相對較低,其水平傳播相對有限。值得注意的是,本研究中3種黏膜途徑感染FAdV-4,其發病率相近,但點眼、滴鼻兩組均比口服組雞病死率高出一倍,這與人的腺病毒最初分離部位及“腺樣-咽-結膜病原”命名相類似,因此建議在FAdV-4疫苗研究方面應更加注重禽的眼鼻黏膜免疫。

2015年中國養禽場廣泛性流行HHS疫情且表現出較高的致病性,結合本研究FAdV-4流行株全序列信息及人工感染與自然感染的致病性差異,筆者認為,除了流行毒株的本身致病性和傳播特性外,禽用活疫苗中的FAdV-4污染不容忽視。有研究表明,在新城疫活疫苗中檢出了外源性致病性FAdV-4的污染,并推測這可能是導致中國雞群大面積感染和高致病性流行HHS的原因之一[26-27]。因此,在HHS的綜合防制中,活疫苗類生物制品的外源性FAdV-4污染監測不可忽缺。