初花期冷害對綠豆葉片生理的損傷及烯效唑的緩解效應

李 琬,項洪濤,何 寧,王雪揚,曾玲玲,劉 淼,姜連子,姜 輝,劉 佳

(1.黑龍江省農業科學院 耕作栽培研究所,哈爾濱 150086;2. 黑龍江省農業機械工程科學研究院綏化分院,黑龍江綏化 152054;3.黑龍江生物科技職業學院,哈爾濱 150025)

綠豆(Vignaradiata)是豆科菜豆族豇豆屬一年生草本植物,是中國重要的傳統食用豆類作物之一,在國內具有悠久的栽培歷史。綠豆籽粒具有高蛋白、低脂肪、藥食同源等特點,是現代功能性食品開發的重要資源[1]。綠豆生育期短、抗旱耐瘠薄、適應性強,在農業供給側結構性改革中具有重要作用[2]。綠豆起源于熱帶,屬于冷敏感作物,對生長環境中的溫度具有較高要求,低溫環境下會遭受冷害損傷。尤其是初花期,綠豆對溫度極為敏感,作為營養生長和生殖生長的并存關鍵期,初花期發生冷害會減少柱頭的花粉粒數量和質量,導致花莢脫落,產量降低[3]。

在生育進程中,作物會不可避免地受到低溫的影響,這也是抑制作物生長發育及產量的最主要逆境之一[4]。低溫脅迫對作物的生理代謝活動具有明顯的影響,使作物產生復雜的生物化學和生理學上的響應[5]。低溫脅迫能夠引起作物體內活性氧類物質、抗氧化酶活性、滲透調節物質含量等發生變化[6]。一般而言,冷害可以導致作物氧化應激反應劇烈增強,導致活性氧類物質異常累積,并引發細胞膜質過氧化,進而引起細胞膜結構蛋白和酶的空間結構改變,打亂細胞正常的生理功能和代謝活動,質膜透性增大、胞內電解質外滲,最終可能使得細胞死亡[7]。

低溫條件下,脅迫起初誘發超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性提高,以清除過量積累的活性氧類物質(ROS),進而起到抵御低溫損傷的作用;可溶性糖、脯氨酸等滲透調節物質含量提高,以維持細胞結構、細胞運輸和調節滲透壓,具有一定的抗性和保護作用[4]。在低溫脅迫下,植物自身會產生對逆境的適應性反應,隨著溫度降低,植物體內的SOD、POD和CAT活性在一定范圍內都呈上升趨勢,可溶性糖和可溶性蛋白含量也呈上升的趨勢。SOD、POD和CAT活性的提高是作物應對低溫逆境時的自我保護行為,以增強作物對低溫的耐受力[8]。但隨著低溫強度的增加,植物的自我保護機制遭到破壞,導致生理代謝受損,諸如抗氧化酶活性急速降低、ROS大量積累,并對細胞膜系統、脂類、蛋白質和核酸等大分子產生強烈的破壞作用,最終誘發作物的生理機制遭到不可逆破壞并引起減產。研究表明,苗期低溫可導致小豆百粒質量下降2.58%～10.61%[9],花期低溫可引起綠豆產量下降10.29%～30.88%[10]。

當前,國內關于低溫脅迫的研究主要集中在大宗糧食作物上,對食用豆類作物的低溫脅迫研究較少,尤其是關于植物生長調節劑緩解綠豆花期低溫脅迫的生理響應研究較少。因此本試驗于初花期對綠豆進行低溫脅迫,開展冷害及預噴施S3307對綠豆葉片抗逆生理及產量的影響研究,重點從活性氧類物質積累-抗氧化酶活性-滲透調節物質含量-產量這一主線進行試驗,旨在分析S3307抵御綠豆花期低溫的作用,以期為綠豆抗冷栽培及保產和豐產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試綠豆品種為‘綠豐5號’(本文用L5表示)和‘綠豐2號’(本文用L2表示),由國家食用豆產業技術體系齊齊哈爾試驗站饋贈。供試植物生長調節劑為S3307,由黑龍江八一農墾大學化控研究中心提供。

1.2 試驗設計

試驗于2020年在黑龍江省農業科學院耕作栽培研究所盆栽場(N 45°75′, E 126°63′)及人工氣候室內進行。試驗共設4個處理,每個處理設3次重復,具體設計見表1。試驗采用盆栽方式,盆高23 cm、直徑25 cm,每盆裝自然風干壤土 5.5 kg,播種后覆土200 g,每盆播種15株 (5穴×3株),待植株長至V2期時,每盆定苗5株,其中每處理使用30盆,指定15盆用于生理取樣,剩余15盆用于測產。待所有植株生長至初花期,即50%以上植株現蕾開花時,于處理當天 9:00,葉面噴施濃度為50 mg·L-1的S3307(該濃度系本課題組前期濃度比較試驗篩選所得),折合用液量為22.5 mL·m-2。翌日上午9:00進行低溫處理,處理溫度平均為15 ℃,溫度24 h變化趨勢見圖1。低溫24 h后,開始第一次取樣,之后每24 h進行取樣,本試驗共取樣5次,記為取樣 1～5 d。同時各處理在取樣期間每天解除低溫脅迫3盆,恢復正常氣溫條件。盆栽全生育期根據實際氣溫和降雨情況,適時澆水直至成熟測產。

圖1 24 h溫度變化Fig.1 Change of temperature in 24 hours

表1 試驗設計方案Table 1 Experiment design

1.3 測定指標與方法

1.3.1 取樣方法 各處理分別取樣,將綠豆植株葉片(每盆4株,倒3葉)迅速剪下裝入事先標記好的自封袋內,并立即放入液氮中,充分冷凍后置于-80 ℃冰箱中保存,供測定生理指標使用。將每盆剩余1株植株的倒三葉片剪取1.0 cm2的方塊,然后用去離子水清洗,放入盛有去離子水的試管中,以備測定電解質滲透率。

1.3.2 測定方法 過氧化氫(H2O2)含量使用試劑盒測定,主要采用氧化硫酸鈦比色法。采用羥胺氧化法測定超氧陰離子產生速率,具體操作方法參照高俊鳳[15]的方法。采用氮藍四唑(NBT)法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用愈創木酚法測定過氧化物酶(POD)活性,采用分解過氧化氫含量速率法測定過氧化氫酶(CAT)活性,具體操作規程按照李合生等[16]的方法。采用茚三酮比色法測定脯氨酸含量,可溶性糖含量測定采用硫酸蒽酮比色法,具體操作規程按照張憲政[17]的方法。

表2 不同品種、不同處理和不同取樣時間下葉片H2O2含量的方差分析(F值)Table 2 Variance analysis of leaf H2O2 content on rate under different varieties, different treatments and different sampling times(F value)

1.4 數據處理

利用Excel 2010處理試驗數據并作圖,使用DPS軟件選擇新復極差法進行顯著性差異檢驗。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫及噴施S3307對綠豆葉片活性氧類物質積累的影響

2.1.1 對葉片過氧化氫(H2O2)含量的影響 由圖2可知,正常條件下,預噴施S3307對綠豆葉片內H2O2含量的積累影響較小,經過方差分析可知,僅L5品種處理第5天時,T1較CK顯著低 2.42%。低溫處理引起葉片內H2O2含量迅速積累,方差分析結果表明,不論是L5還是L2,各取樣時間內,T2處理的H2O2含量均顯著高于CK。噴施S3307可有效降低低溫條件下綠豆葉片內H2O2含量,L5在處理1～5 d時,T3較T2分別降低8.54%、8.11%、7.95%、6.45%和6.09%,方差分析結果表明T3均顯著低于T2。L2在處理1～5 d時,T3較T2分別降低3.04%、 2.51%、4.81%、6.47%和4.30%,方差分析結果表明T3均顯著低于T2。由表2可知,不同品種(A)、不同處理(B)和不同取樣時間(C)對H2O2含量達極顯著影響(F值分別為845.98、1318.76和228.79),雙因素A×B(F=34.45)、A×C (F=11.48)和B×C(F=87.25)互作效應對H2O2含量具有極顯著影響,而三因素A×B×C交互作用(F= 2.15)對H2O2含量達到顯著影響。

不同小寫字母表示同一天內不同處理間差異在P<0.05水平具有顯著性,誤差線所示為標準誤差。下同

圖3 不同處理下綠豆葉片的超氧陰離子產生速率 Production rate in leaves of mung bean under different treatments

表3 不同品種、不同處理和不同取樣時間下綠豆葉片產生速率的方差分析(F值)Table 3 Variance analysis of leaf production on rate under different varieties, different treatments and different sampling time(F value)

2.2 低溫脅迫及噴施S3307對綠豆葉片抗氧化酶系統的影響

2.2.1 對葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響 從圖4可以看出,正常溫度條件下,預噴施S3307對綠豆葉片內SOD活性沒有顯著性影響。低溫處理對SOD活性具有明顯的提高作用,方差分析結果表明,不論是L5還是L2,各取樣時間內,T2均顯著高于CK。預噴施S3307可進一步有效提高低溫條件下綠豆葉片內SOD活性,就L5來說,處理1～5 d時,T3較T2分別提高 11.17%、 8.53%、12.40%、16.63%和16.62%,經方差分析可知T3均顯著高于T2。就L2來說,處理1～5 d時,T3處理的SOD活性均高于T2處理,方差分析結果表明T3較T2分別顯著提高 35.47%、60.89%、69.02%、29.57%和 22.04%。由表4可知,不同品種、不同處理和不同取樣時間對綠豆葉片SOD活性均具有極顯著影響,且雙因素交互和三因素交互作用對SOD活性也達極顯著影響。

圖4 不同處理下綠豆葉片的SOD活性Fig.4 SOD activity in leaves of mung bean under different treatments

表4 不同品種、不同處理和不同取樣時間下綠豆葉片SOD活性的方差分析(F值)Table 4 Variance analysis of leaf SOD activity under different varieties, different treatments and different sampling time(F value)

2.2.2 對葉片過氧化物酶(POD)活性的影響 從圖5可以看出,正常條件下,預噴施S3307對綠豆葉片POD活性具有一定影響,不同品種間差異較大,就L5來說,方差分析結果表明T1與CK之間差異不顯著。就L2來說,處理后1～2 d表現為T1較CK高3.05%和6.01%,方差分析結果表明差異均達到顯著水平。低溫處理引起POD活性增強,就L5來說,方差分析結果表明T2與CK之間的差異均達到顯著水平。就L2來說,處理后 4～5 d表現為T2較CK高48.26%和37.69%,方差分析結果表明差異均達到顯著水平。噴施S3307可進一步提高綠豆葉片POD活性,呈線性升高的變化趨勢。方差分析結果表明,不論是L5還是L2,各取樣時間內,T3均顯著高于T2。另外,由表5可知,不同品種、不同處理和取樣時間及其雙因素和三因素交互作用對綠豆葉片POD活性均存在極顯著影響。

圖5 不同處理下綠豆葉片的POD活性Fig.5 POD activity in leaves of mung bean under different treatments

表5 不同品種、不同處理和不同取樣時間下綠豆葉片POD活性的方差分析(F值)Table 5 Variance analysis of leaf POD activity under different varieties, different treatments and different sampling time(F value)

2.2.3 對葉片過氧化氫酶(CAT)活性的影響 由圖6可知,正常溫度下,預噴施S3307對綠豆葉片活性影響不大,經方差分析可知,僅L5處理的第3天、L2處理的第4天,T1顯著高于CK,這可能與取樣誤差有關。低溫處理對綠豆葉片CAT活性影響較大。就L5來說,與CK相比,T2分別提高了66.67%、16.00%、178.57%、95.45%和 144.44%,經方差分析可知,除處理第2天外,其他取樣時間,T2均顯著高于CK。就L2來說,與CK相比,T2分別提高了10.00%、33.33%、 105.88%、241.67%和178.57%,經方差分析可知,處理后2～5 d時,T2均顯著高于CK。噴施S3307具有提高CAT活性的調節效應,方差分析結果表明,處理后2～5 d時,L5和L2均表現為T3顯著高于T2。由表6可知,不同品種、不同處理、不同取樣時間和不同處理×不同取樣時間對綠豆葉片CAT活性達極顯著影響,不同品種、不同處理、取樣時間的三因素互作對CAT活性具有顯著影響,而不同品種×不同處理和不同品 種×不同取樣時間的交互作用對CAT活性影響不顯著。

圖6 不同處理下綠豆葉片的CAT活性Fig.6 CAT activity in leaves of mung bean under different treatments

表6 不同品種、不同處理和不同取樣時間下綠豆葉片CAT活性的方差分析(F值)Table 6 Variance analysis of leaf CAT activity under different varieties, different treatments and different sampling time(F value)

2.2.4 對葉片SOD/POD的影響 由表7可知,正常氣溫條件下噴施S3307,SOD/POD整體呈降低的變化趨勢,有利于提高根系對逆境的抗性,但方差分析結果表明,各品種內的T1和CK之間無顯著性差異。低溫引起綠豆葉片內SOD/POD整體呈升高趨勢,就L5來說,處理后1 d、 3～5 d時均表現為T2>CK;就L2來說,處理后1～5 d均表現為T2>CK;這不利于作物對低溫的抵抗,但方差分析結果表明,各品種內的T2與CK之間的差異未達到顯著差異水平。噴施S3307對不同品種SOD/POD值的調控效應不同,就L5來說,處理1～5 d時,T3均低于T2,方差分析結果表明,處理2～5 d時,T3顯著低于T2(P<0.05)。就L2來說,處理1～3 d時,表現為T3>T2,但方差分析結果表明T3與T2之間未達到顯著差異;處理4～5 d時,T3均低于T2,方差分析結果表明T3與T2之間達到顯著差異水平(P<0.05)。

表7 不同處理下綠豆葉片的SOD/POD值Table 7 SOD/POD value in leaves of mung bean under different treatments

2.3 低溫脅迫及噴施S3307對綠豆葉片滲透調節物質含量的影響

2.3.1 對葉片脯氨酸含量的影響 從圖7可以看出,預噴施S3307對綠豆葉片脯氨酸含量具有一定的調控效應。就L5來看,處理1～5 d時,與CK相比,T2分別增加了3.73%、18.27%、 37.29%、23.59%和3.49%,方差分析結果表明,處理2～4 d時,T1顯著高于CK。就L2而言,處理1～5 d時,與CK相比,T2分別增加了 11.72%、43.77%、79.68%、72.66%和50.19%,方差分析結果表明,處理3～5 d時,T1顯著高于CK。整體來看,預噴施S3307對綠豆葉片脯氨酸含量具有調增的效應,這對綠豆抵御低溫有利。低溫引起綠豆葉片內脯氨酸含量增加,就L5來看,處理1～5 d時,T3較CK分別增加了 1.07%、7.41%、9.20%、9.65%和5.49%,但方差分析結果表明各取樣時期T3與CK之間差異均不顯著。就L2而言,處理1～5 d時,T3較CK分別增加了26.37%、49.06%、74.10%、19.48%和0.77%,方差分析結果表明,處理1～3 d時,T3與CK之間差異達到顯著水平。低溫條件下噴施S3307可進一步提高脯氨酸含量,就L5來說,經方差分析可知,處理1～5 d時,T3較T2分別顯著增加了31.13%、14.25%、36.36%、 42.54%和6.62%;就L2而言,經方差分析可知,處理1～5 d時,T3與T2之間未達到顯著差異水平。由表8可知,除不同品種和不同取樣時間對脯氨酸含量影響不顯著外,不同品種、不同處理、不同取樣時間及其雙因素和三因素交互作用對脯氨酸含量均具有極顯著影響。

圖7 不同處理下綠豆葉片的脯氨酸含量Fig.7 Proline content in leaves of mung bean under different treatments

表8 不同品種、不同處理和不同取樣時間下綠豆葉片脯氨酸含量的方差分析(F值)Table 8 Variance analysis of leaf proline content under different varieties, different treatments and different sampling time(F value)

2.3.2 對葉片可溶性糖含量的影響 由圖8可知,預噴施S3307對可溶性糖含量具有一定的調節作用。對L5來說,處理1～5 d時,T2較CK分別增加了9.25%、3.92%、0.86%、6.51%和 2.43%,方差分析結果表明,處理1 d和3 d時,T1顯著高于CK。對L2而言,經方差分析可知僅在處理2 d時,T1顯著高于CK,其他取樣時期二者無顯著差異。低溫引起綠豆葉片內可溶性糖含量增加,就L5來看,處理1～5 d時,T3較CK分別增加了7.57%、8.71%、29.05%、40.60%和 25.00%,經方差分析可知,除處理2 d外,其他取樣時期T3與CK之間差異均達到顯著水平。就L2而言,處理1～5 d時,T3較CK分別增加了5.25%、14.37%、16.94%、31.21%和5.63%,方差分析結果表明,處理2～5 d時,T3與CK之間差異達到顯著水平。低溫條件下噴施S3307可進一步提高可溶性糖含量,就L5來說,經方差分析可知,處理1～5 d時,T3較T2分別顯著增加了9.43%、15.01%、9.41%、8.32%和8.88%;就L2而言,處理1～5 d時,T3較T2分別增加 5.50%、6.22%、4.26%、11.82%和6.67%,方差分析結果表明,處理2～5 d時,T3與T2之間差異達到顯著水平。由表9可知,不同品種、不同處理和取樣時間對可溶性糖含量具有極顯著影響,不同品種×不同處理和不同處理×不同取樣時間的雙因素交互作用以及不同品種×不同處理×不同取樣時間的三因素交互作用對可溶性糖含量具有極顯著影響。

圖8 不同處理下綠豆葉片的可溶性糖含量Fig.8 Soluble sugar content in leaves of mung bean under different treatments

表9 不同品種、不同處理和不同取樣時間下綠豆葉片可溶性糖含量的方差分析(F值)Table 9 Variance analysis of leaf soluble sugar content under different varieties, different treatments and different sampling time(F value)

2.4 低溫脅迫及噴施S3307對綠豆產量的影響

由表10可知,正常條件下,初花期噴施S3307具有提高綠豆盆栽產量的效應,‘綠豐5號’表現為T1較CK高出1.49 g·盆-1,增幅為 5.67%,經方差分析可知達到顯著差異水平(P<0.05);‘綠豐2號’的T1較CK高出2.33g·盆-1,增幅為8.73%,方差分析結果表明二者之間差異顯著(P<0.05)。初花期冷害引起綠豆產量下降,方差分析結果表明‘綠豐5號’處理 1～5 d時,T2較CK相比均顯著降低P<0.05);單盆產量降幅分別為11.58%、17.78%、27.19%、33.24%和46.27%;‘綠豐2號’處理 1～5 d時,T2較CK相比均顯著降低P<0.05);單盆產量降幅分別為12.74%、18.82%、 28.04%、36.58%和44.75%。冷害條件下預噴施S3307具有提高產量的調控效應,就‘綠豐5號’來說,處理1～5 d時,T3較T2每盆分別增加了1.88 g、1.69 g、1.56 g、1.20 g和1.31 g,增幅分別為8.10%、7.83%、8.16%、 6.85%和 9.28%,方差分析結果表明T3與T2之間達到顯著差異水平(P<0.05);就‘綠豐2號’來說,處理 1～5 d時,T3較T2每盆分別增加了 2.27 g、 2.35 g、1.80 g、2.33 g和2.36 g,增幅分別為 9.75%、10.85%、9.38%、13.77%和 16.01%,方差分析結果表明T3與T2之間達到顯著差異水平(P<0.05)。由表11可知,不同品種、不同處理和取樣時間對單盆產量具有極顯著影響,不同品種×不同處理和不同處理×不同取樣時間的雙因素交互作用對單盆產量也具有極顯著影響,而不同品種×不同時間和不同品種×不同處理×不同取樣時間的三因素交互作用對單盆產量影響不顯著。

表10 不同處理下綠豆的單盆產量Table 10 Yield per pot of mung bean under different treatments

表11 不同品種、不同處理和不同取樣時間下綠豆產量的方差分析(F值)Table 11 Variance analysis of mung bean yield under different varieties, different treatments and different sampling time(F value)

3 討 論

低溫作為農作物生長發育過程中不可避免的自然災害,是影響作物生長發育、產量和品質的重要非生物脅迫之一[18-19]。低溫可導致植物體內活性氧代謝失衡、自由基積累、細胞膜透性增加、代謝紊亂,及蛋白質變性、核苷酸損傷等,嚴重時可致細胞死亡[20],從而造成植物嚴重受損甚至絕產。

滲透調節是植物抵御低溫逆境的另一種重要生理機制[8]。脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內重要的滲透調節物質,在提高植物抗性方面發揮著重要作用[28]。可溶性糖和脯氨酸是植物應對低溫脅迫重要的滲透調節物質,耐寒性強的種質在低溫下能迅速積累可溶性糖和脯氨酸,以提高細胞液濃度,降低冰點溫度,保持細胞不至于遇冷凝固。植物可溶性糖含量與耐寒性總體上呈正相關關系,而脯氨酸含量與耐寒性的關系尚無統一定論[29]。本研究結果表明,低溫脅迫引起綠豆葉片可溶性糖含量顯著提高,這與趙晶晶[3]的研究結果類似。但脯氨酸含量的變化因品種而異,低溫脅迫對‘綠豐5號’葉片內脯氨酸含量沒有顯著影響,但可顯著提高‘綠豐2號’葉片內的脯氨酸含量,這可能與兩個品種的抗冷基因的誘導表達不同有關,因為逆境脅迫下,植物體內脯氨酸的積累主要由其生物合成降解共同作用調控,有報道指出低溫脅迫下脯氨酸的積累與脯氨酸合成酶基因——鳥氨酸轉氨酶基因(OAT)和△′-吡咯林-5-羧酸合成酶基因(P5CS)基因表達的提高,以及脯氨酸脫氫酶基因(ProDH)表達的下降有關[30]。本研究表明低溫條件下,噴施S3307能進一步提高滲透調節物質含量,顯著提高可溶性糖的含量,這與趙晶晶[3]、項洪濤等[14]的研究結果相同。可溶性糖含量的提高有利于提高植物的抗逆性,因為可溶性糖是植物體內的重要代謝產物,能與水結合,促進細胞束縛水含量積累并增強細胞液的流動性,維持細胞的正常功能[31],并且可溶性糖含量的增加能夠提高細胞滲透壓濃度[19],這也是S3307提高植物抗逆性的生理原因之一。

低溫脅迫導致豆科作物產量下降,趙晶晶等[10]、王新欣[23]研究表明,開花期低溫降低了大豆產量,項洪濤等[14]指出苗期低溫降低了紅小豆產量,本研究得出相同結論,低溫處理1～5 d導致‘綠豐5號’單盆產量顯著下降11.58%～ 46.27%,‘綠豐2號’顯著下降12.74%～ 44.75%。預噴施S3307能緩解冷害引起的產量損失[4,9],本研究也得到相同結果,噴施S3307能有效緩解冷害對綠豆產量的影響,‘綠豐5號’處理1～5 d時,單盆產量顯著提高6.85%～ 9.28%,‘綠豐2號’處理1～5 d時,單盆產量顯著提高9.38%～ 16.01%。

4 結 論