水稻CRISPRa系統的優化及驗證

楊 柳,姚毅菲,劉林麗,蘇顏琦,劉華偉

(西北農林科技大學 生命科學學院,陜西楊凌 712100)

通常采用組成型啟動子超表達基因研究其功能[1],但有些基因難以克隆,如編碼序列15 kb的擬南芥BIG基因[2]。此外,改善作物品質通常需要同時上調多個基因表達,如在番茄中同時過表達SlWRKY35和SlLCYE基因相較于單獨表達單個基因,可以顯著提高果實中的葉黃素含量[3]。但同時表達多個內源基因時,需要克隆多個基因、啟動子和終止子,增加載體構建難度。

ZFP-TADs和TALE-TF能夠激活內源基因,但均設計復雜、成本高且難進行多基因激活。近年來,基于CRISPR衍生出CRISPRa等多種技術[4-5],其中CRISPRa[6-9]相較于ZFP-TADs和TALE-TF,只需合成多個sgRNA,可快速、低成本地同時上調多個內源基因表達。

水稻作為中國主要農作物之一,對于保障糧食安全具有重要意義,而提高其產量、品質的關鍵在于育種技術創新[10-11]。CRISPRa與CRISPR相比,不造成DNA雙鏈斷裂,安全性更高;與轉基因相比,無需引入外源基因即可上調多個基因表達。目前已有植物的CRISPRa系統,如CRISPR Act2.0、CRISPR Act3.0、dCas9-TV及CCTV等[6-9]。本研究對dCas9進行點突變減少其與DNA的非特異性結合、增強其對標準PAM(NGG)的識別,并對基因序列進行水稻密碼子優化,旨在開發特異性更強、激活效率更高的水稻CRISPRa系統,為水稻及其他作物分子設計育種提供新的技術方案。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質粒 大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京博邁德基因技術有限公司;質粒pYLgRNA-OsU6a由華南農業大學劉耀光院士惠贈;質粒HBT-dCas9-CCTV-2由中山大學李劍峰教授惠贈;質粒pGL3-Basic由西北農林科技大學趙天永教授惠贈;質粒p35S-eGFP、pGR107、pUC19-dCas9、pUC19-TV、pUC19為實驗室保存。

1.1.2 材料與試劑 植物材料為日本晴(OryzasativaL. japonica cv. nipponbare,NPB);限制性內切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ)、RNAiso Plus、TB Green○RPremix ExTaqTMⅡ購自Takara公司;限制性內切酶BsaⅠ、T4DNA連接酶購自NEB公司;高保真聚合酶2×HiProof 2G PCR Master Mix、無縫克隆酶2×SmartSeamless Cloning Mix購自陜西楊凌杰一生物技術有限公司;反轉錄試劑盒UEIris RT mix with DNase購自蘇州宇恒生物;CellulaseR-10、MacerozymeR-10購自Yakult公司;PEG4000購自Biotopped公司。原生質體制備溶液配方參照文獻[11]。

1.1.3 引物合成及測序 引物合成及測序委托北京擎科生物科技有限公司西安分部完成。

1.2 方 法

1.2.1 點突變dCas9為HFdCas9 利用表1引物對dCas9中N497A、R661A、Q926A、D1135E進行四重點突變得到HFdCas9。以pUC19-dCas9質粒為模板進行擴增,PCR體系如下:2×HiProof 2G PCR Master Mix 25 μL,引物各 1 μL,pUC19-dCas9質粒1 μL,加ddH2O至50 μL。反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火25 s,72 ℃延伸2 min 30 s,32個循環;72 ℃延伸5 min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,對目標條帶進行膠回收。

表1 點突變dCas9為HFdCas9 所用引物Table 1 Primers used for HFdCas9 as point mutation dCas9

利用無縫克隆的方式構建載體,體系如下: 2×Smart Seamless Cloning Mix 5 μL,N497A片段0.5 μL,R661A片段0.5 μL,Q926A片段0.5 μL,D1135E片段0.5 μL,加ddH2O至10 μL。55 ℃連接30 min,65 ℃失活10 min,連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞,涂至氨芐抗性平板。37 ℃過夜培養后挑取單克隆搖菌,提取完質粒并進行測序驗證。

1.2.2 水稻原生質體HFdCas9-TV表達載體構建 利用表2引物構建原生質體HFdCas9表達載體。從pGL3-Basic質粒擴增2×35S片段,從上文所構建的pUC19-HFdCas9質粒擴增HFdCas9片段,從p35S-eGFP質粒擴增NOS-Ori-Amp片段,用無縫克隆的方式構建HFdCas9表達載體。PCR體系和程序同“1.2.1”。無縫克隆體系:2×SmartSeamless Cloning Mix 5 μL, 2×35S片段0.5 μL,HFdCas9片段2 μL,NOS-Ori-Amp片段1 μL,加ddH2O至10 μL。無縫克隆程序及轉化驗證同“1.2.1”。

表2 HFdCas9表達載體構建所用引物Table 2 Primers for construction of HFdCas9 expression plasmid

利用表3引物構建原生質體HFdCas9-TV表達載體,在dCas9序列后插入TV結構域和HA標簽。從pUC19-TV質粒擴增TV片段,從pGR107質粒擴增2×HA片段,將構建的2×35S-HFdCas9質粒用BamHⅠ單酶切。進行瓊脂糖凝膠電泳,膠回收TV片段、HA片段、線性化的2×35S-HFdCas9片段。利用無縫克隆的方式構建載體,體系如下:2×SmartSeamless Cloning Mix 5 μL,線性化的2×35S-HFdCas9 2 μL,TV片段1 μL,HA片段1 μL,加ddH2O至10 μL。無縫克隆程序及轉化驗證同“1.2.1”。

表3 HFdCas9-TV表達載體構建所用引物Table 3 Primers for construction of HFdCas9-TV expression plasmid

1.2.3 pUC19-sgRNA載體構建 將表4中OsGW7sgRNA-F/R干粉引物濃度稀釋至100 μmol/L,吸取ddH2O 8 μL,OsGW7sgRNA-F/R引物各1 μL。95 ℃加熱2 min,緩慢降溫至25 ℃。吸取1 μL的sgRNA引物退火產物,1 μL的pYLgRNA-OsU6a質粒,0.5 μL的BsaⅠ-HF限制性內切酶,1 μL的T4DNA Ligase,1 μL的 10×T4DNA Ligase Buffer,1 μL的10×CutSmart Buffer,加ddH2O至10 μL,進行金門組裝。金門組裝程序:37 ℃酶切5 min,20 ℃連接5 min,10個循環。將上述產物作為PCR模板,以U6a-F/R引物進行擴增。PCR體系:2×HiProof 2G PCR Master Mix 25 μL,模板1 μL,引物U6a-F/R各1 μL,加ddH2O至50 μL。反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性25 s,51 ℃退火25 s,72 ℃延伸20 s,共35個循環;72 ℃延伸5 min。進行瓊脂糖凝膠電泳與膠回收。以pUC19質粒為載體,U6a-F/R擴增產物為片段,均用EcoRⅠ和SalⅠ進行酶切和膠回收后,于22 ℃連接2 h,轉化驗證同“1.2.1”。OsF3HsgRNA載體構建方法同OsGW7。

表4 pUC19-sgRNA載體構建所用引物Table 4 Primers for construction of pUC19-sgRNA plasmid

1.2.4 水稻原生質體的制備與轉染 參照孫鶴等[12]的方法進行部分改動。取培養10 d的水稻幼苗,剪去根部和葉片,保留葉鞘部分,用水沖洗干凈。用濾紙吸干水分,用刀片將葉鞘切成 0.5 mm的小段,轉移至有50 mL 0.6 mol/L甘露醇溶液的錐形瓶中,置于搖床中25 ℃、60 r/min緩慢搖動30 min。用200目的尼龍膜過濾除去錐形瓶中甘露醇溶液,加入15 mL酶解液,在搖床中25 ℃、60 r/min緩慢搖動4 h。

吸取10 μL酶解液至載玻片,用光學顯微鏡觀察酶解程度和原生質體狀態。酶解充分后,加入等體積預冷的W5溶液,置于搖床,加大轉速至80 r/min搖動5 min。用雙層尼龍膜過濾殘渣,收集原生質體至50 mL離心管中。將離心機設置為加速度a=3 200 g離心7 min,收集原生質體。棄上清,重新加入10 mL W5溶液,將原生質體懸浮,顯微鏡下檢驗。200 g離心7 min,收集原生質體,再次棄上清,加入10 mL W5溶液,懸浮原生質體,放置于冰上,避光靜置40 min。 200 g離心7 min,收集原生質體,棄上清。加入2 mL MMG溶液,取10 μL溶液用血細胞計數板計數,將原生質體濃度稀釋到2×106個/mL,即可用于后續原生質體轉染。

HFdCas9-TV質粒和sgRNA質粒各取 16 μg至2 mL離心管底,加入200 μL原生質體,輕輕混勻。加入220 μL PEG4000轉染溶液,將其混勻。黑暗環境下,室溫靜置25 min。加入 800 μL W5溶液,緩慢顛倒混勻。將離心機加速模式設置為soft模式,200×g離心5 min,收集原生質體。加入1 mL W1溶液,輕輕混勻,黑暗環境下室溫靜置12 h。

1.2.5 水稻原生質體RNA的提取及RT-qPCR 將過夜培養的原生質體200×g離心10 min收集于管底,棄上清。加入1 mL RNAiso Plus,轉移至RNase-free的1.5 mL離心管中,冰上靜置10 min。加入500 μL的氯仿,用力晃動至呈現乳白色,冰上靜置10 min。4 ℃,12 000 r/min離心15 min,取出離心管,管內液體分為三層,吸取上清至另一離心管中。加入等體積的異丙醇,顛倒混勻后,-20 ℃冰箱沉淀4 h。4 ℃,12 000 r/min離心15 min,棄上清,管底可見白色沉淀。加入RNase-free水配置的75%乙醇,洗滌沉淀, 4 ℃,12 000 r/min離心10 min,棄上清。重復上步操作一次,放置于超凈臺中,吹干乙醇。加入20 μL的RNase-free水溶解沉淀,用Nandrop測定RNA濃度,取部分樣品進行瓊脂糖電泳檢測其質量。

參照反轉錄試劑盒UEIris RT mix with DNase說明書進行反轉錄,參照TB Green○RPremix ExTaqTMⅡ說明書進行qRT-PCR,引物見表5。OsUBQ作為內參基因,利用2-ΔΔCt法計算目的基因表達量變化。

表5 qRT-PCR所用引物Table 5 Primers used for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 CRISPRa載體構建

2.1.1 HFdCas9-TV表達載體構建 通過引物引入dCas9的N497A、R661A、Q926A、D1135E 4個氨基酸位點突變,經測序驗證,成功獲得連接在pUC19上的4個點突變的HFdCas9(圖1-a)。經PCR擴增得到啟動子2×35S片段、HFdCas9片段以及NOS-Amp-Ori片段,大小分別為909 bp、4 223 bp、1 973 bp(圖1-b)。通過無縫克隆構建 2×35S-HFdCas9載體,經測序驗證,載體構建成功。

a:dCas9中N497A、R661A、Q926A、D1135E 4個位點突變后的測序峰圖;b:M.Marker;1.HFdCas9;2.NOS-Amp-Ori; 3.2×35S;c:M.Marker;1.TV;2.2×HA

將上步所得質粒用BamHⅠ單酶切,擴增TV結構域和2×HA標簽片段。因TV結構域含有較多重復序列,擴增產物出現多個條帶,取大小正確的1 404 bp條帶用于載體構建;2×HA片段大小為93 bp(圖1-c)。通過無縫克隆構建2×35S-HFdCas9-TV載體,經測序驗證,載體構建成功。

2.1.2 pUC19-sgRNA載體的構建 HFdCas9-TV表達載體大小為8 588 bp,質粒過大會影響轉染效率。因此將轉錄sgRNA的質粒和表達dCas9-TV的質粒共轉原生質體(圖2-a)。利用金門組裝將sgRNA連接至pYLsgRNAU6a載體,反向PCR獲得順序正確的sgRNA表達盒,連接至pUC19載體。sgRNA表達盒的片段大小約為608 bp(圖2-b)。

a:HFdCas9-TV表達載體和pUC19-sgRNA載體示意圖

2.2 CRISPRa激活能力的驗證

原生質體制備完成后,轉染前需在光學顯微鏡下檢驗(圖3-a)。經檢驗,本研究所制備的水稻原生質體細胞數量充足,形態完整,可用于后續CRISPRa質粒轉染。使用Nandrop測定提取的RNA樣品A260/280比值,均在1.9左右。進一步通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量(圖3-b),結果顯示其RNA質量合格。

a:原生質體鏡檢圖(10倍物鏡、10倍目鏡的光學顯微鏡)

利用所構建HFdCas9-TV靶向激活OsGW7,通過RT-qPCR分析,發現基因OsGW7表達量上調至對照組的95倍;利用CCTV系統在相同情況下,OsGW7表達量可上調至對照組43倍,激活效率提升至CCTV的2.2倍(圖4-a)。進一步利用HFdCas9-TV靶向激活OsF3H,OsF3H表達量上調至對照組的46倍(圖4-b)。經OsGW7和OsF3H激活驗證,證明所構建CRISPRa系統具有激活能力。將OsGW7、OsF3HsgRNA質粒同時與HFdCas9-TV質粒共轉至水稻原生質體,OsGW7、OsF3H分別被激活至對照組的33倍、26倍(圖4-c),證明所構建CRISPRa系統具有多重激活能力。

a. OsGW7的轉錄激活;b. OsF3H的轉錄激活;c. OsGW7和 OsF3H同時轉錄激活;* *代表在P=0.01水平有顯著差異

3 討 論

高效sgRNA的設計和篩選是CRISPRa成功激活目的基因的關鍵,其靶點通常選擇在轉錄起始位點前250 bp內[6,8]。OsGW7的靶點[6]位于轉錄起始位點前的[-73,-93]位置,OsF3H的靶點[8]與常規的設計不同,其位于[+91,+72](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/browser/gene/?id=9270463),在轉錄起始位點后的5′UTR,仍具有激活能力。后續可研究5′UTR位置靶點是否普遍具有激活能力,進一步拓展靶點設計范圍。

本研究構建由HFdCas9-TV、pUC19-sgRNA組成的水稻CRISPRa系統。前者大小為8.3 kb,其中HFdCas9-TV片段為5.6 kb。為了優化其表達采用2×35S強啟動子且進行水稻密碼子優化。采用文獻[6,8]中OsGW7和OsF3H的sgRNA,在水稻原生質體水平對所構建CRISPRa系統進行功能驗證,兩個基因表達均被成功上調。相較于CCTV系統[9],對OsGW7激活效率提高至其2.2倍,從43倍提升至95倍。相較于CRISPR-Act 3.0系統[8]激活OsF3H至對照組120倍,本研究構建的CRISPRa系統激活至對照組46倍。分析原因可能是CRISPR-Act3.0利用Suntag招募到更多轉錄激活域,覆蓋更廣的啟動子區域。后續將對本研究構建CRISPRa系統進一步優化并提高其效率。

目前已將基因編輯技術應用于水稻、小麥等作物改良[6,13]。運用CRISPR技術敲除感病基因“做減法”雖可使作物抗病但出現了早衰、產量下降等負面表型[14],CRISPRa技術可快捷地對作物“做多重加法”,通過同時激活抗逆、抗病、產量相關基因獲得聚合性狀的優良作物。此外,對于作物育種,控制目標基因的轉錄強度至關重要。如關鍵抗病基因表達需要適當水平上調,過度轉錄會引發細胞的程序性死亡甚至影響植物的正常發育[15-16]。CRISPRa技術通過在基因啟動子區招募RNA聚合酶以提高其轉錄水平的表達,相較于超表達更接近生理水平,調控更自然,避免能量浪費及代謝損害。因此,調控自然的“做多重加法”更適合于作物性狀改良。