CTA1-DD蛋白在枯草芽胞桿菌中的分泌表達

張元鵬，侯立婷，杜露平，于曉明，李蘭，楊利，張浩明，王義偉，喬緒穩，程海衛，秦竹，3，4，5*，陳瑾 ，3，4，5*，鄭其升，3，4，5*

(1. 江蘇省農業科學院動物免疫工程研究所，江蘇 南京 210014；2. 江蘇省農業科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京 210014；3. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009；4. 江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇 南京 210014；5. 獸用生物制品(泰州)國泰技術創新中心，江蘇 泰州 225300)

黏膜系統不但是病毒侵入宿主機體的主要位點，同時也是宿主對抗病毒感染的免疫反應的重要場所。黏膜免疫能夠刺激機體產生多種類型的免疫反應：促進分泌型IgA(sIgA)的產生，血清中產生IgG中和抗體和細胞介導的免疫反應[1]。盡管黏膜免疫具有很多的優點，但是由于黏膜系統具有免疫屏障，往往單純的免疫抗原并不能引起足夠的免疫反應。為了增強抗原的免疫原性，免疫的過程中往往要添加免疫佐劑?；魜y毒素(CT)作為當前最熱門的黏膜佐劑之一，當與抗原混合使用進行口服或者滴鼻免疫時，能夠引起強烈的黏膜免疫和系統免疫，因此被認為是最有應用前景的佐劑之一[2]，但是由于其具有神經毒性，限制了開發和利用[3-5]。為了解決這個問題，Agren等[6]通過把CTA1亞基與葡萄球菌G蛋白的D肽偶聯在一起，構建了基因融合蛋白CTA1-DD。葡萄球菌G蛋白的D肽通過與免疫球蛋白的Fc和Fab片段結合，可以將CTA1導向免疫球蛋白，而且還能夠導向B細胞受體。融合蛋白CTA1-DD保留了具有ADP-核糖基轉移酶活性的CTA1亞基，而CTB亞基和與GM1神經節苷脂受體結合的能力被去除。廣泛的研究表明，CTA1-DD融合蛋白具有與完整CT分子相當的全身和黏膜免疫的佐劑功能[7]。CTA1-DD提供了相當的佐劑效果，大大增強了機體對與佐劑聯合免疫的特異性免疫原的細胞和體液免疫力[8]。

本研究采用枯草芽胞桿菌分泌表達CTA1-DD基因，旨在獲得胞外分泌的CTA1-DD蛋白，并初步驗證其黏膜佐劑活性，為大規模生產應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

流感病毒HA抗原由江蘇省農業科學院劉青濤副研究員惠贈；6周齡ICR小鼠購自揚州大學比較醫學中心；枯草芽胞桿菌WB600、重組穿梭載體pHT43、pMDT-18T-CTA1-DD-His載體、大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；ExTaq酶 、T4 DNA連 接 酶 、 DNA Marker、限制性內切酶購自大連寶生物科技有限公司；蛋白Marker購自Thermo公司；氨芐青霉素、氯霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程公司；瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Axygen公司；Ni-IDA瓊脂糖純化樹脂購自中科森輝微球技術公司；凝膠法鱟試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；鼠抗His單克隆抗體、HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗購自南京翼飛雪生物科技有限公司；HRP標記的羊抗小鼠IgA二抗購自北京普利萊基因技術有限公司；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 重組表達載體pHT43-CTA1-DD構建

用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切pMDT-18T-CTA1-DD-His對CTA1-DD基因片段進行膠回收，然后用 T4連接酶與同樣雙酶切后膠回收的pHT43載體連接。將連接產物轉化進入DH5α感受態細胞，涂布于含有氨芐青霉素的固體LB培養基中37 ℃培養過夜。挑選單克隆提取質粒進行雙酶切鑒定，陽性克隆送入南京擎科生物科技有限公司測序。

1.3 CTA1-DD在枯草芽胞桿菌WB600中的轉化及誘導表達

將重組載體pHT43-CTA1-DD通過化學轉化法[9]轉入枯草芽胞桿菌WB600中，涂布于含有終濃度為10 μg/mL氯霉素的固體LB培養基中，37 ℃培養過夜。挑取陽性克隆，在含有氯霉素LB培養基的搖瓶中培養至OD值為0.5～1.0時，加入1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導24 h后離心取上清液進行SDS-PAGE分析。

1.4 3L發酵罐培養

將菌液按照5%體積分數接種到3L發酵罐中，培養條件：溫度37 ℃，pH=7.2，攪拌轉速為500 r/min，溶氧為30%，通氣量為1.0 (V/V·min)，添加1.0 mmol/L的IPTG，分別在6、12、24、36 h取樣進行SDS-PAGE分析。

1.5 重組蛋白的純化

將發酵液離心取上清液，加入終濃度為20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl后按照Ni-IDA 說明書進行層析純化，收集洗脫蛋白并用脫鹽柱進行脫鹽。然后參照凝膠法鱟試劑盒說明書檢測蛋白的內毒素含量，并用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行定量分析。

1.6 重組蛋白的Western blot鑒定

將純化后的樣品經處理后進行SDS-PAGE，電泳結束后電轉移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂乳37 ℃封閉2 h，PBST洗滌5次；用1∶1 000稀釋的鼠抗His單克隆抗體作為一抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次；放入1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗中，37 ℃作用30 min，PBST 洗滌5次后，DAB進行顯色。

1.7 CTA1-DD重組蛋白佐劑活性的測定

將30只雌性6周齡的ICR小鼠隨機分成3組：第1組，生理鹽水；第2組，生理鹽水+5 μg流感病毒HA抗原；第3組，10 μg CTA1-DD蛋白+5 μg流感病毒HA抗原，每只小鼠免疫的體積為20 μL。將疫苗分別于第0、14天對小鼠進行滴鼻免疫，在免后4周眼眶采血分離血清，小鼠處死后用200 μL的PBS對支氣管肺泡進行灌洗并收集灌洗液。采用終點稀釋ELISA法檢測特異性IgG和IgA抗體的滴度[10]，具體步驟如下：ELISA板包被HA抗原(200 ng/孔)，用含有3%的PBST封閉1 h后，再用PBST清洗3次。制備2倍連續稀釋的血清和黏膜樣品，分別加入孔中。37 ℃孵育1 h后，PBST洗3次，加入1∶3 000稀釋的HRP標記羊抗小鼠IgG二抗或者HRP標記羊抗小鼠IgA二抗，37 ℃孵育1 h，洗3次后加入底物液顯色15 min后，加入2 mol/L的硫酸終止反應，酶標儀測定吸光值A450 nm。樣品的抗體滴度為樣品孔A450 nm-空白孔A450 nm≥0.2的最大稀釋倍數。

1.8 數據統計分析

數據采用獨立樣本t檢驗進行統計學分析，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 重組表達載體pHT43-CTA1-DD的構建

將連接產物轉化、涂板，挑取單克隆菌落，提取質粒，用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切鑒定。如圖1所示，重組質粒被切成2個片段，分別得到一個約8 000 bp的條帶，與pHT43載體大小相等；另一個片段約1 000 bp，與目的片段(CTA1亞基和DD亞基大小分別為585 bp和576 bp)大小相符。

M.5000 DNA Ladder；1. pHT43-CTA1-DD雙酶切產物。

2.2 CTA1-DD重組蛋白在枯草芽胞桿菌中的表達驗證

將空載體pHT43重組菌和含重組質粒pHT43-CTA1-DD重組菌WB600經IPTG誘導培養24 h后終止，離心取上清液進行SDS-PAGE，如圖2所示。與對照組相比，試驗組上清液在43 kDa處出現明顯的外源蛋白條帶，該蛋白分子量大小與CTA1-DD融合蛋白預期的分子量一致。Western blot結果(圖3)也證明CTA1-DD基因在枯草芽胞桿菌中已成功表達，其表達量約占上清液總蛋白的60%。

M. 預染Marker；1. pHT43空載體發酵液上清液；2. pHT43-CTA1-DD發酵液上清液。

M.蛋白Marker；1. pHT43空載體發酵液上清液；2～3. pHT43-CTA1-DD發酵液上清液。

2.3 CTA1-DD重組蛋白的發酵表達及蛋白的純化

使用發酵罐來表達CTA1-DD重組蛋白，分別在6、12、24、36 h取樣進行SDS-PAGE分析(圖4)，可以發現隨著時間的推移蛋白的表達量越高，最終在36 h達到最高，產量約為700 μg/mL。收集上清液通過鎳離子柱親和層析純化的方法進行純化，經過100 mmol/L咪唑的沖洗后，再用500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后即可獲得較高純度的CTA1-DD蛋白(圖5)。純化的蛋白經過脫鹽柱脫鹽后，BCA法檢測蛋白濃度為0.15 mg/mL，內毒素含量低于10 U/mL。

1～4. 發酵時間分別為6、12、24和36 h；M.蛋白Marker。

2.4 CTA1-DD重組蛋白佐劑活性

為了驗證枯草芽胞桿菌表達的CTA1-DD重組蛋白佐劑活性，將10 μg的CTA1-DD蛋白與5 μg流感病毒HA抗原混合后滴鼻免疫小鼠(第3組)，分別設生理鹽水組(第1組)和HA對照(第2組)，28 d后收集血清和鼻腔灌洗液分別檢測IgG和IgA抗體。血清IgG抗體檢測結果顯示免疫HA組只能誘導很低的IgG抗體，而添加CTA1-DD蛋白組能夠誘導更高的IgG抗體水平；黏膜IgA抗體檢測結果顯示添加CTA1-DD蛋白也能夠顯著提升IgA抗體水平(圖6)，說明枯草芽胞桿菌表達的重組CTA1-DD蛋白具有佐劑活性。

3 討論

CTA1-DD蛋白作為黏膜佐劑在預防傳染病疫苗方面的功效得到了充分驗證，科研人員證明CTA1-DD可用于人類免疫缺陷病毒(HIV)，人類乳頭瘤病毒(HPV)，埃博拉病毒(EBOV)、甲型流感病毒(H1N1)和輪狀病毒(RV)等病毒疫苗的顯著保護[11-15]。同時科研人員也發現CTA1-DD佐劑鼻內免疫可以增強對幽門螺桿菌和結核分枝桿菌的保護性免疫[16-17]。根據這些報道和建議，我們相信它在其他黏膜疫苗中也是有效的。因此，CTA1-DD作為黏膜佐劑是非常理想和安全的。當前獸用疫苗中，禽流感病毒(AIV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等病毒疫苗都需要強有力的黏膜佐劑來提高黏膜免疫的效力。但是文獻報道的CTA1-DD蛋白多由大腸桿菌表達，蛋白產量低，還需要進行細菌破碎、純化等復雜工藝，并且革蘭陰性菌表達系統會伴有大量的內毒素，處理過程繁瑣、成本高，限制了其在獸用疫苗上的應用。

原核表達系統中大腸桿菌表達系統應用最為廣泛，操作簡單，生產成本低廉，體系也非常成熟和完善。但其最大缺點是目的蛋白只能表達于胞內和周質空間，不能像其他真核表達系統在胞外分泌表達，雖然也有一些信號元件可以實現這個功能，但是遠遠沒有芽胞桿菌容易和高效?？莶菅堪麠U菌表達系統作為原核表達系統的一種，是一種對環境無害的革蘭陽性細菌且能分泌表達已廣泛應用于醫藥和食品行業[18]?？莶菅堪麠U菌表達系統相對于大腸桿菌表達系統，其優勢如：非致病性、細胞壁組成簡單、重組表達的蛋白內毒素低、較低密碼子偏愛性、表達蛋白可溶性高、生物活性好[19]。本試驗采用枯草芽胞桿菌表達系統，其一是蛋白能夠直接分泌到培養基中，省去了大腸桿菌所需的菌體的離心、破碎等過程；其二是枯草芽胞桿菌不含有內毒素，不會引起動物的不良反應。本試驗選用枯草芽胞桿菌表達系統高效表達了可溶性蛋白CTA1-DD，證明它是一種很有優勢的表達系統。使用發酵罐發酵36 h蛋白的產量就能夠達到700～1 000 mg/L，目的蛋白能占到上清液總蛋白的60%以上。將發酵液經過簡單的離心后，上清液就可以直接進行親和層析純化，并且能夠獲得很純的目的蛋白。蛋白經過檢測，不含有內毒素，可直接進行動物試驗，極大地精簡了蛋白的處理步驟，為大規模應用奠定了基礎。

為了驗證枯草芽胞桿菌表達的CTA1-DD蛋白是否具有佐劑活性，本研究將CTA1-DD蛋白與HA抗原混合滴鼻后，顯著提高了小鼠血清中的IgG抗體水平及肺泡黏膜中的sIgA抗體水平，表明CTA1-DD很好地發揮了黏膜佐劑作用，顯著提升了小鼠呼吸道局部黏膜免疫應答。本試驗說明枯草桿菌表達系統表達的CTA1-DD蛋白是一種有效的黏膜佐劑，并且具有產量高、易于純化等特點，為以后的大規模生產應用奠定了基礎。