單增李斯特菌單克隆抗體制備及免疫磁珠分離方法的建立

葉方鈺，謝雨芮，王權(quán)，劉爽，張海洋，韓先干*，蔣蔚*

(1. 塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

單增李斯特菌是引起食物中毒的主要致病菌，該菌導(dǎo)致的李斯特菌病是最嚴(yán)重的食源性疾病之一，主要感染免疫功能低下的個體，表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、腦炎、心內(nèi)膜炎[1]。孕婦感染侵襲性李斯特菌的風(fēng)險會更高，主要發(fā)生在妊娠晚期并會導(dǎo)致流產(chǎn)。胎兒或新生兒感染的后果極為嚴(yán)重，包括早產(chǎn)、肺炎和腦膜炎[2]。李斯特菌病導(dǎo)致的腦部感染死亡率為22%[3]。許多食品都涉及到李斯特菌病的暴發(fā)或散發(fā)病例，其中包括未滅菌的牛奶、真空包裝的肉制品、奶酪和鮮切水果[4]。

牛奶介質(zhì)中的乳脂、蛋白質(zhì)等成分以及黏稠度會影響目標(biāo)細(xì)菌的分離與富集[5]。傳統(tǒng)分離方法步驟繁多，需要3～5 d才能完成分離[6]，已不適用于食品工業(yè)的發(fā)展需求，因此建立高效的前處理技術(shù)對于食品微生物的檢測至關(guān)重要。免疫磁分離技術(shù)是一種理想的樣品前處理技術(shù)，充分利用抗體與具有磁響應(yīng)性能的納米磁珠結(jié)合，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌株的分離和濃縮，具有特異性好和易于操作等優(yōu)點(diǎn)[7]。文湘郡等[8]建立了大腸桿菌O157：H7的免疫磁珠分離方法，對牛奶中的大腸桿菌O157：H7的捕獲率達(dá)到90%。王亞磊[9]建立了金黃色葡萄球菌的免疫磁珠分離方法，從牛奶中分離金黃色葡萄球菌的捕獲率在80%以上。

本研究使用甲醛滅活的單增李斯特菌全菌為免疫原，通過雜交瘤技術(shù)制備了鼠源單克隆抗體，并對抗體特性進(jìn)行分析，使用制備的單克隆抗體與羧基磁珠相結(jié)合，通過最佳條件的優(yōu)化，以及對免疫磁珠特異性和模擬樣品應(yīng)用的分析，制備出能特異且高效捕獲單增李斯特菌的免疫磁珠，從而為牛乳中單增李斯特菌的檢測、疾病診斷提供良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及菌株

BALB/c雌性小鼠和昆明雌性鼠，均購自上海杰思捷試驗動物有限公司。

單增李斯特菌(CICC21662、CICC21633、CICC21635),金黃色葡萄球菌(ATCC6538)，腸出血性大腸桿菌O157：H7(ATCC43889)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；阪崎腸桿菌(CICC21561)，肺炎克雷伯氏菌(CMCC46117)，購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；傷寒沙門菌(SL14028)由本實(shí)驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清購自BI生物公司；高糖DMEM、青鏈霉素(PS)和L-谷氨酰胺(LG)均購自美國Gibco公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇(PEG6000)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸、4-嗎啉乙磺酸(MES)和N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(NHS)均購自美國Sigma公司；SBAClonotypingSystem-HRP抗體亞型鑒定試劑盒購自SouthernBiotech公司；TSB-YE培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自ThermoScientific公司。超順磁性納米磁珠和磁分離架購自上海奧瑞微納新材料科技有限公司；旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器購自海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；乳化儀購自Amalgamator公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國BIOTEK公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國ThermoScientific公司。

1.3 抗原的制備

將3株不同來源的單增李斯特菌分別用TSB-YE液體培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)，5 000 r/min離心收集菌體，平板計數(shù)法進(jìn)行菌落計數(shù)，終濃度0.3%的甲醛溶液滅活8 h以上后各取1 mL菌液12 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用PBS離心洗滌5次。將菌液等量混合，用無菌PBS洗滌5次并調(diào)整濃度為1×109CFU/mL作為免疫原。

1.4 動物免疫

4只BALB/c小鼠免疫前觀察1周，分別眶下靜脈采血收集陰性血清。免疫程序：每只小鼠每次免疫200 μL乳化后的菌液。首次免疫將免疫原與弗氏完全佐劑等體積乳化混勻，足墊注射；二免、三免、四免皆為免疫原與弗氏不完全佐劑等體積乳化混勻，皮下多點(diǎn)注射。首免與二免間隔時間為1周，二免、三免、四免間隔時間均為2周，每次免疫7 d后對小鼠進(jìn)行采血，室溫放置1～2 h，5 000 r/min離心15 min，收集血清，用間接ELISA方法測定抗原免疫效果。以P/N值大于2.1判斷為陽性，選擇血清效價超過1∶32 000的小鼠用于細(xì)胞融合，融合前3 d對小鼠進(jìn)行腹腔注射加強(qiáng)免疫。本方法是在王亞磊[9]建立的方法上進(jìn)行少量修改。

1.5 雜交瘤細(xì)胞株的制備

取未免疫昆明小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，用含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞，選擇效價最高的小鼠處死并摘取脾臟，使用空白DMEM洗下脾細(xì)胞，將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，均勻滴加PEG6000融合劑進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞用含HAT的完全培養(yǎng)基重懸，按梯度滴加在鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本試驗方法參考龍夢瑤等[10]的研究。

1.6 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆

依據(jù)本試驗室前期摸索，以3種滅活單增李斯特菌菌體混合作為包被抗原包被酶標(biāo)板，細(xì)菌包被量為1×109CFU/mL。取細(xì)胞培養(yǎng)上清液用間接ELISA方法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞篩選，選擇效價高、細(xì)胞生長狀態(tài)好的細(xì)胞，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，之后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、鑒定并凍存。

1.7 單克隆抗體腹水的制備

采取動物體內(nèi)誘生法，給健康BALB/c小鼠分2次注射滅菌石蠟油0.5 mL/只，7～15 d后備用。收集細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的陽性克隆雜交瘤細(xì)胞，用生理鹽水重懸細(xì)胞，混勻，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106～2×106個/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL。8～10 d后收集腹水。

1.8 單克隆抗體效價及特異性的測定

用間接ELISA方法，設(shè)置陽性和陰性對照，以稀釋的單克隆抗體分別與5種常見食源性致病菌進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗，包括金黃色葡萄球菌、腸出血性大腸桿菌O157：H7、鼠傷寒沙門菌、副溶血弧菌和肺炎克雷伯菌，交叉反應(yīng)越少表明抗體特異性越高。采用間接ELISA方法測定腹水中單克隆抗體效價。判定標(biāo)準(zhǔn)為：OD450 nm值大于或等于2倍陰性對照OD450 nm值時的最高稀釋倍數(shù)為腹水效價。

1.9 單克隆抗體亞型的鑒定

使用SBAClonotypingSystem-HRP抗體亞型鑒定試劑盒測定抗體亞型，方法參照說明書。首先以甲醛滅活的單增李斯特菌菌體作為包被原包被酶標(biāo)板，一抗是含5% FBS的PBST稀釋1 000倍的腹水，試劑盒中的二抗用含1%BSA的PBST進(jìn)行300倍稀釋，判定標(biāo)準(zhǔn)為：OD450 nm值大于或等于2時為陽性。

1.10 單增李斯特免疫磁珠的制備

取200 μL磁珠(10 mg/mL)于磁力架上靜置1 min使磁珠完全分離，棄上清液。用500 μL活化緩沖液(MEST，pH=6.0)洗滌3次，將現(xiàn)配的EDC(5 mg/mL)和NHS(5 mg/mL)各加入200 μL，重懸磁珠，于搖床中37 ℃，180 r/min活化30 min；取出，加入500 μL緩沖液(MEST，pH=6.0)洗滌2次，再加入偶聯(lián)緩沖液(MEST，pH=7.0)500 μL洗滌1次，棄上清液。取新的EP管，將適量6-E6腹水加入500 μL偶聯(lián)沖液中，渦旋振蕩器混勻后加入上述活化的磁珠中偶聯(lián)3 h；PBST洗滌3次。加入1 mL 1%BSA封閉液，搖床37 ℃，180 r/min封閉30 min。取出瞬離，PBST洗滌4次，棄上清液。加入1 mL儲存液，重懸磁珠，待用。使用TSB-YE培養(yǎng)基增菌單增李斯特菌，調(diào)整菌液濃度為104CFU/mL。取100 μL菌液和100 μL磁珠分別加入800 μL PBST中，混勻后于旋轉(zhuǎn)儀30 r/min，室溫反應(yīng)45 min。捕獲完成后，置于磁力架分離。分別取上清液和磁珠各100 μL均勻涂布固體培養(yǎng)基平板計數(shù)，選擇103菌液作為對照組。計算免疫磁珠捕獲率，免疫磁珠捕獲率=磁珠捕獲的菌落數(shù)/(上清液捕獲的菌落數(shù)+磁珠捕獲的菌落數(shù))×100%。

1.11 免疫磁珠最佳條件的優(yōu)化

最佳偶聯(lián)緩沖液的確定：分別選擇MEST(0.025 mol/L，pH=7.0)、MEST(0.025 mol/L，pH=6.0)、PBST(0.01 mol/L，pH=7.0)和PBS(0.01 mol/L，pH=7.0)4種偶聯(lián)緩沖液，以直徑750 nm的磁珠制備免疫磁珠，捕獲單增李斯特菌，進(jìn)行3次平行試驗，計算捕獲率，以確定最佳偶聯(lián)緩沖液。最佳直徑的確定：選擇直徑180、750、1 150和2 000 nm的磁珠，分別制備免疫磁珠捕獲單增李斯特菌，試驗重復(fù)3次，確定免疫磁珠最佳的直徑。最佳捕獲時間的確定：按照最佳條件制備免疫磁珠，分別選擇捕獲時間為15、30、45、60和75 min進(jìn)行捕獲，重復(fù)試驗3次，確定最佳捕獲時間。

1.12 免疫磁珠捕獲細(xì)菌最佳細(xì)菌濃度分析

用TSB-YE培養(yǎng)基增菌單增李斯特菌，并梯度稀釋菌液至106、105、104、103和102CFU/mL，運(yùn)用單增李斯特菌免疫磁珠進(jìn)行捕獲，捕獲時間45 min，試驗重復(fù)3次，計算捕獲率，確定免疫磁珠捕獲的最佳細(xì)菌濃度。

1.13 免疫磁珠特異性分析

按優(yōu)化后的最適條件制備免疫磁珠。培養(yǎng)單增李斯特菌作為陽性對照。培養(yǎng)其他常見食源性致病菌株：金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門菌、腸出血型大腸桿菌O157：H7、副溶血弧菌和肺炎克雷伯菌作為被捕獲菌株，分析免疫磁珠特異性，分別計算捕獲率，試驗重復(fù)3次。

1.14 免疫磁珠在模擬樣品中的應(yīng)用

為驗證免疫磁珠在牛奶基質(zhì)中的捕獲率，用PBST(pH=7.4)稀釋菌液至1×106、1×105、1×104、1×103和1×102CFU/mL，分別加入到超市購買的巴氏殺菌牛奶中制備模擬臨床樣品。捕獲體系為200 μL磁珠+800 μL牛奶樣品，混合均勻后，置于渦旋培養(yǎng)儀上，30 r/min室溫捕獲45 min。選擇PBST緩沖液與牛奶樣品進(jìn)行對比。計算捕獲率，以確定單增李斯特菌免疫磁珠在牛奶中的捕獲性能。

2 結(jié)果

2.1 動物免疫效果

分別于二、三、四免后的第7天采集小鼠血清，用間接ELISA方法測定效價，結(jié)果顯示隨著免疫次數(shù)的增加效價逐步升高(圖1)。

圖1 動物免疫效果

2.2 細(xì)胞融合、篩選及克隆

選擇2號小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，在4～6 d后觀察到細(xì)胞團(tuán)長出，待細(xì)胞團(tuán)生長到足夠大時收集上清液進(jìn)行ELISA檢測。經(jīng)過3次亞克隆及篩選，共得到8株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞株，分別是1-A6、6-E6、2-A11、6-H10、3-F3、7-B4、4-C1和7-A3。

2.3 單克隆抗體效價及特異性測定

如圖2所示，8株單克隆抗體效價均能達(dá)到1∶1 024 000，效價較高。如圖3，結(jié)果顯示單克隆抗體的特異性良好，與其他常見食源性致病菌無交叉反應(yīng)。

圖2 單克隆抗體效價檢測

圖3 單克隆抗體特異性檢測

2.4 單克隆抗體亞型鑒定

抗體亞型鑒定試劑盒鑒定結(jié)果如表1，8株單抗輕鏈皆為Kappa型，重鏈皆為IgM型。

表1 單克隆抗體亞型檢測結(jié)果 OD450 nm

2.5 免疫磁珠最佳條件的優(yōu)化

4種偶聯(lián)緩沖液PBST、MEST(pH=6.0)、MEST(pH=7.0)和PBS對單增李斯特菌的捕獲率顯示，MEST(pH=7.0)作為偶聯(lián)緩沖液時捕獲率最高，達(dá)到68.46%，如圖4A，因此后續(xù)試驗選擇MEST(pH=7.0)作為偶聯(lián)緩沖液；選擇4種不同直徑的磁珠，分析在相同條件下對單增李斯特菌捕獲率的影響，如圖4B，捕獲率最高的是750 nm的磁珠，捕獲率為74.87%，因此后續(xù)的試驗選擇直徑為750 nm的磁珠；使用15、30、45、60和75 min 5個時間梯度來分析免疫磁珠的最佳捕獲時間，如圖4C，45 min時捕獲率達(dá)到76.29%，且隨著時間的增加捕獲率無明顯提高，后期試驗選擇45 min為最佳捕獲時間。

A.免疫磁珠偶聯(lián)緩沖液的選擇；B.最佳免疫磁珠直徑的選擇；C.最佳捕獲時間的確定。

2.6 免疫磁珠捕獲細(xì)菌敏感性

依據(jù)上述優(yōu)化的條件，將單增李斯特菌的濃度分別調(diào)整至1×106、1×105、1×104、1×103和1×102CFU/mL，對免疫磁珠的敏感性進(jìn)行分析。如圖5，免疫磁珠對上述濃度菌液的捕獲率依次分別為41.05%、50.85%、75.15%、71.89%和64.66%。結(jié)果表明磁珠在細(xì)菌濃度1×102CFU/mL時，捕獲率仍在60%以上，表明磁珠敏感性較好。

圖5 免疫磁珠的敏感性分析

2.7 免疫磁珠特異性

為了分析免疫磁珠的特異性，在之前的優(yōu)化基礎(chǔ)上制備免疫磁珠并進(jìn)行捕獲。如圖6所示，免疫磁珠對3株單增李斯特菌的捕獲率分別為77.26%、77.02%和76.83%，對其他常見食源性菌株的捕獲率均在5%以下。

注：1. 單增李斯特菌CICC21662；2. 單增李斯特菌CICC21633；3.單增李斯特菌CICC21635；4. 金黃色葡萄球菌；5. 鼠傷寒沙門菌；6. 腸出血型大腸桿菌O157：H7；7. 副溶血弧菌；8. 肺炎克雷伯菌。

2.8 免疫磁珠在模擬樣品中的應(yīng)用

在滅菌牛奶中加入單增李斯特菌模擬臨床感染樣本，利用單增李斯特菌免疫磁珠進(jìn)行富集，結(jié)果如圖7，在牛奶模擬樣品中捕獲濃度為1×106～1×102CFU/mL單增李斯特菌時，捕獲率依次為36.77%、47.84%、67.71%、65.72%和53.47%。

圖7 免疫磁珠的模擬樣品應(yīng)用

3 討論

單克隆抗體在免疫學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。本試驗以甲醛滅活單增李斯特菌為免疫原，制備了鼠源抗單增李斯特菌的單克隆抗體。由于顆粒性抗原的免疫原性大于可溶性抗原[11]，所以甲醛滅活的全菌作為顆粒性抗原可有效激活小鼠機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生效價較高的特異性抗體。本試驗利用來源不同的3種單增李斯特菌同時混合免疫，可有效增強(qiáng)單增李斯特菌種內(nèi)抗原表位的同一性，減少因單增李斯特菌個體間差異造成的抗原表位差異，由此制得的單克隆抗體可增加單增李斯特菌檢測的廣譜適用性。本試驗選擇8周齡BALB/c雌性小鼠，共免疫5次，免疫位置依次為足墊、皮下、皮下、肌肉和腹腔，后期試驗證實(shí)此免疫程序取得了較好的免疫效果。本研究在免疫5次后，采集小鼠血清，測得的效價均較高，說明甲醛滅活的全菌強(qiáng)烈刺激了機(jī)體的免疫系統(tǒng)，由此產(chǎn)生了針對全菌親和力較強(qiáng)的抗體。其中樣品小鼠2血清效價相對較高，因此，選擇樣品小鼠2的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，有更大的概率獲得效價較高的單克隆抗體。在雜交瘤細(xì)胞形成初期，細(xì)胞本身并不穩(wěn)定，極有可能發(fā)生變異，甚至死亡[12]。亞克隆可篩選出效價高、特異性強(qiáng)、生長能力穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株。經(jīng)過3次亞克隆后，獲得了8株分泌單克隆抗體的陽性細(xì)胞株，將這些細(xì)胞分別收集起來，注入小鼠腹腔，收集腹水，-80 ℃凍存。小鼠腹水的ELISA檢測結(jié)果顯示，8種單克隆抗體的效價均較高，并且不與其他常見的5種食源性病原微生物發(fā)生交叉反應(yīng)，提示其可以用于食源性單增李斯特菌免疫學(xué)檢測的開發(fā)。其中，6-E6的效價最高，可達(dá)到1∶2 048 000以上。

免疫磁珠作為重要的免疫學(xué)檢測技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分離和檢測。本研究利用制備的抗單增李斯特菌的鼠源性單克隆抗體6-E6進(jìn)行免疫磁珠的制備，進(jìn)而對基質(zhì)中的單增李斯特菌進(jìn)行捕獲和濃縮，取得了較高的捕獲效率。由于偶聯(lián)液的類型、濃度和pH值對于單克隆抗體的偶聯(lián)率有較大的影響，本試驗共選取了4種不同的偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行磁珠偶聯(lián)，結(jié)果顯示，偶聯(lián)液為MEST(0.025 mol/L，pH=7.0)時，磁珠的捕獲效率最高，可達(dá)到68.46%，因此后期選擇此偶聯(lián)緩沖液制備免疫磁珠。根據(jù)之前的研究[12]，免疫磁珠的直徑對特定細(xì)菌的捕獲率有較大的影響。本試驗選取4種不同直徑的磁珠進(jìn)行捕獲試驗，結(jié)果顯示，750 nm的捕獲率明顯高于其余3種，捕獲率達(dá)到74.87%，因此后期選擇750 nm制備免疫磁珠進(jìn)行捕獲試驗。為確定免疫磁珠的最佳捕獲時間，梯度設(shè)置細(xì)菌捕獲時間進(jìn)行試驗，可觀察到在45 min后延長捕獲時間，細(xì)菌的捕獲率沒有顯著的提升，因此選擇45 min為單增李斯特免疫磁珠的最佳捕獲時間。這低于劉燕艷[13]采用免疫磁珠-實(shí)時熒光PCR(IMS-RT-PCR)方法快速檢測單增李斯特菌所需的60 min捕獲時間。此外，試驗結(jié)果顯示，樣品中細(xì)菌群落總數(shù)高于1×104CFU/mL時捕獲率相對有所下降，是因為在磁珠的工作量不變時，隨著細(xì)菌群落總數(shù)的升高，納米磁珠附著面積已趨于飽和，需要增加磁珠的工作量，但是在樣本體積較少時不宜添加過多磁珠。原因是在強(qiáng)磁場細(xì)菌很容易被磁珠捕獲，但過量的免疫磁珠會誘導(dǎo)細(xì)菌表面產(chǎn)生更多抗原位點(diǎn)從而破壞細(xì)菌，從而導(dǎo)致捕獲率降低[14]。免疫磁珠的特異性對于后期的分子生物學(xué)檢測建立有重大影響。特異性試驗結(jié)果顯示，單增李斯特免疫磁珠對于3種來源不同的單增李斯特菌捕獲率均在75%以上，而對于其余5種常見的食源性病原微生物捕獲率均低于5%，這一點(diǎn)和徐金亭[15]的研究結(jié)果相吻合，說明單增李斯特免疫磁珠普適性和特異性較好。免疫磁珠對于目的細(xì)菌的分離與富集不僅可以提高細(xì)菌的濃度和檢出效率，而且可排除后期基質(zhì)對于分子生物學(xué)檢測的干擾，例如PCR、LAMP和重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)等，極大地提高檢出效率。

綜上，本試驗利用制備的抗單增李斯特菌鼠源性單克隆抗體制備免疫磁珠，通過優(yōu)化偶聯(lián)緩沖液、磁珠直徑等條件，制得的單增李斯特菌免疫磁珠特異性好、敏感性強(qiáng)、捕獲效率高，可用于后期分子生物學(xué)檢測的前樣品處理。