Anle138b對oAβ1-42誘導海馬神經元突觸毒性作用影響

孫琳,王炳超,朱天立

(青島大學基礎醫學院生理學教研室,山東 青島 266071)

阿爾茨海默病(AD)是一種以記憶喪失、認知障礙以及癡呆的行為和心理癥狀為特征的神經退行性疾病[1-2]。β淀粉樣蛋白寡聚體(oAβ)在細胞內蓄積和神經元過度興奮是 AD早期的兩個重要事件[3]。oAβ的主要形式為oAβ1-40和oAβ1-42,并且后者的毒性最強。對AD神經元功能障礙和毒性的最早解釋之一是由ARISPE等[4]提出的通道假說,該假說假設不受調控的β淀粉樣蛋白(Aβ)離子通道會導致離子穩態的喪失(主要是通過升高細胞內鈣離子),最終觸發神經元功能障礙和細胞死亡[5]。二苯基吡唑化合物Anle138b是一種低聚物調節劑,其毒性低,口服生物利用度高,血-腦脊液屏障通透性好[6]。Anle138b能夠阻斷Aβ通道并挽救淀粉樣變性小鼠模型的疾病表型,是治療AD非常有希望的新型藥物,但是該藥在原代海馬神經元的細胞模型上研究較少。本研究應用單細胞膜片鉗技術檢測自發性興奮性突觸后電流(sEPSCs),分析Anle138b對慢性oAβ1-42誘導的海馬神經元細胞突觸毒性作用影響,為AD新型藥物的開發提供可行的思路。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 選擇出生24 h之內的SD乳鼠40只,由青島大任富城畜牧有限公司提供。

1.1.2主要實驗試劑及儀器 葡萄糖酸鉀、二甲基亞砜(DMSO)、KCl、NaCl、MgCl2、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、Mg2ATP、NaGTP以及KOH均購自美國Sigma公司;DMEM/F12培養基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司;青霉素-鏈霉素購自中國北京索萊寶科技有限公司;B27無血清添加劑購自美國Gibco公司;Anle138b、人源Aβ1-42粉末、六氟異丙醇(HFIP)、荷包牡丹堿(Bicuculline)均購自中國MCE公司;CO2細胞培養箱;玻璃微電極拉制儀;防震臺;三維微操縱器;膜片鉗放大器;倒置熒光顯微鏡。

1.1.3主要溶液配制 ①海馬神經元細胞培養液:在無菌操作臺中,將10 mL神經元專用添加物B27、5 mL青霉素-鏈霉素溶液加入500 mL的DMEM/F12基礎培養液中,混勻后分裝于50 mL離心管中,置4 ℃冰箱中保存。②oAβ1-42:將Aβ1-42粉末和HFIP置于冰上,取1 mg的Aβ1-42和222 μL的HFIP裝入離心管中,渦旋混勻,室溫孵育1 h直到液體澄清。將Aβ1-42-HFIP分裝到4個無菌的EP管中,放到通風櫥揮發過夜,至EP管底部產生透明的Aβ1-42-HFIP膜, -80 ℃冰箱保存。使用前加入11 μL DMSO渦旋混勻,再加入539 μL PBS渦旋混勻,置于4 ℃冰箱中直立孵育24 h后,4 ℃、1 400 r/min離心10 min,取上清即為oAβ1-42,分裝保存于-20 ℃冰箱中。③電極內液:將130 mmol/L葡萄糖酸鉀、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L濃度MgCl2、1 mmol/L EGTA、2 mmol/L Mg2ATP、10 mmol/L KCl、500 μmol/L NaGTP溶液混勻,用1 mol/L KOH 調節pH值為7.3,分裝后-20 ℃儲存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組及處理 參考本實驗室方法培養原代海馬神經元細胞[7],細胞發育成熟后分為對照組(A組,不進行任何處理)、Anle138b組(B組,50 nmol/L Anle138b處理2 d)、oAβ1-42組(C組,100 nmol/L oAβ1-42處理7 d)、oAβ1-42+Anle138b組(D組,100 nmol/L oAβ1-42+50 nmol/L Anle138b共處理7 d)、oAβ1-42+Anle138b 2 d組(E組,100 nmol/L oAβ1-42處理7 d,在oAβ1-42處理最后2 d加用50 nmol/L Anle138b),各組處理結束后進行單細胞膜片鉗記錄。

1.2.2單細胞膜片鉗記錄海馬神經元細胞sEPSCs幅值、頻率和半衰減時間 細胞外液37 ℃水浴鍋中溫浴后,將各組細胞培養液更換為細胞外液。在顯微鏡下找到胞體飽滿、邊界清晰、表面無凹陷的細胞做好標記,點擊“offset”,進行單細胞膜片鉗記錄。將拋光好的玻璃電極(電阻為5～10 MΩ)注入合適體積的電極內液,使用三維微操縱器控制電極慢慢接近細胞,直到接觸到細胞表面,方波越來越低,電阻有所增加。此時可以觀察到電極尖端和細胞都清晰可見并且細胞表面被電極壓出“酒窩”。釋放正壓,給電極負壓輕輕吸吮細胞,使電阻迅速增加至1 GΩ,待封接電阻穩定于1 GΩ、1 min后,給予少量負壓破膜。破膜完成后進行串聯電阻及膜電容補償,在電壓鉗模式下觀察sEPSCs的變化,記錄采用gap free模式,鉗制電壓為-70 mV,記錄前加入Bicuculline(20 μmol/L),在Igor pro軟件上選擇程序進行實驗記錄。用Igor pro軟件采樣,clampfit軟件分析數據。

1.3 統計學處理

2 結 果

各組海馬神經元細胞sEPSCs幅值、半衰減時間比較差異無統計學意義(F=2.215、1.043,P>0.05)。各組sEPSCs頻率比較差異有統計學意義(F=15.490,P<0.001),兩兩比較顯示,oAβ1-42組細胞sEPSCs頻率較對照組明顯增加(q=6.507,P<0.001),oAβ1-42+Anle138b組和oAβ1-42+Anle138b 2 d組細胞sEPSCs頻率較oAβ1-42組明顯降低(q=9.517、9.471,P<0.001),其他組間比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 各組細胞sEPSCs幅值、頻率、半衰減時間比較

3 討 論

隨著社會經濟的發展及人類壽命的不斷增加,AD的患病率不斷升高,預計到2050年AD的患病人數將達到1.0億～1.3億人[8-9]。雖然目前有多種假說,但是AD的分子病因學仍然不清楚。有研究表明,oAβ是AD主要的毒性物質[10]。oAβ可以通過突觸驅動機制導致超興奮性的產生和傳播[11],對大鼠和小鼠模型的初級神經元產生毒性作用,抑制海馬突觸長時程增強,并導致記憶障礙[12-14]。oAβ是由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)經過β-分泌酶和γ-分泌酶異常加工和Aβ積累產生的[15-16]。oAβ主要包括oAβ1-40和oAβ1-42兩種形式,其中以oAβ1-42毒性最強[17]。有研究表明,oAβ能夠破壞細胞膜,導致離子通道的形成[10]。oAβ形成離子通道以后導致神經細胞內鈣離子代謝異常,改變了細胞內鈣離子的動態平衡,最終導致神經毒性[18-19]。因此,尋找一種Aβ離子通道小分子阻斷劑將會為AD的治療提供一種新的思路[20]。而Anle138b能夠在不改變膜嵌合抗體齊聚物結構的情況下阻斷Aβ離子通道的活性,并且Anle138b是首個被報道能夠在oAβ形成離子通道后將其阻斷并改善Aβ病理的化合物[5,21]。但是該藥物在海馬神經元細胞突觸上的研究非常少,能否在Aβ通道形成前后均降低慢性oAβ1-42誘導的突觸毒性作用以保護海馬神經元細胞仍不清楚。

本文研究應用單細胞膜片鉗技術檢測海馬神經元細胞sEPSCs幅值、頻率、半衰減時間3個指標,結果顯示,Anle138b對海馬神經元細胞突觸功能不產生影響,oAβ1-42處理7 d會誘導原代培養的海馬神經元細胞突觸的sEPSCs頻率增加從而產生神經毒性作用,而Anle138b能降低oAβ1-42通道形成前后所導致的頻率升高,但是各組的幅值和半衰減時間差異無統計學意義。說明Anle138b不僅可以預防oAβ1-42誘導的海馬神經元細胞突觸毒性,還可以消除慢性oAβ1-42誘導的已經形成的海馬神經元細胞突觸毒性。提示oAβ1-42誘導海馬神經元細胞突觸毒性的機制可能為:海馬神經元細胞突觸前膜離子通道形成后導致鈣離子穩態失調,突觸前膜遞質釋放增多,對突觸產生毒性[22]。已有研究證明海馬神經元細胞突觸前膜釋放的神經遞質是谷氨酸[23],而這個過程可以被Anle138b所阻斷。動物模型研究結果顯示,Anle138b對帕金森病(PD)、多系統萎縮病、阮病毒和AD等蛋白聚集相關疾病治療有效[24-27]。關于Anle138b抑制PD的發病進展機制已在健康志愿者中測試成功,目前正在PD病人中進行Ⅰb期測試(NCT04685265)[28]。

綜上所述,Anle138b可以降低oAβ1-42誘導的海馬神經元細胞突觸毒性作用,其可能的機制是減少突觸前膜神經遞質釋放,并且Anle138b不僅可以預防慢性oAβ1-42誘導的突觸毒性作用,還可以消除慢性oAβ1-42誘導的突觸毒性作用。因此,Anle138b類小分子阻斷劑可能在AD的治療中有非常大的潛力,值得進一步研究。