九龍江口肥水-縊蟶養殖塘厭氧氨氧化微生物活性研究*

蔡 露 翁鉑森① 詹力揚 張介霞 胡恭任 于瑞蓮 閆 鈺

(1.華僑大學化工學院 福建廈門 361000; 2.自然資源部第三海洋研究所海洋大氣化學與全球變化重點實驗室 福建廈門361000)

氮素是自然生態系統中重要的營養元素, 其生物地球化學循環是保證陸地和海洋環境安全的重要環節(祝貴兵, 2020)。隨著濱海養殖業迅猛發展, 過量施用含氮飼料影響了沉積物氮循環過程, 造成嚴重的生態環境問題, 如水體富營養化、生物多樣性喪失等(Wuet al, 1994)。反硝化和厭氧氨氧化作用是脫氮的兩個重要過程(Mulderet al, 1995), 但反硝化過程會產生中間產物氧化亞氮(N2O), 其對溫室效應的影響是二氧化碳(CO2)的298 倍(Liet al, 2021), 尤其是在高氮負荷河口(Wellset al, 2018)。厭氧氨氧化在脫氮過程中減少了NO、N2O 等溫室氣體的產生, 是一種更為經濟有效且環保的途徑(Suenagaet al, 2021)。因此, 探究濱海河口養殖塘沉積物厭氧氨氧化活性對提高水產養殖污染物控制和管理效率以及合理利用濱海濕地資源具有重要的理論意義。

目前, 共發現6 個厭氧氨氧化微生物屬(Schmidet al, 2005; Bonagliaet al, 2017), 包括Candidatus Brocadia、Ca.Scalindua、Ca.Kuenenia、Ca.Jettenia、Ca.Anammoximicrobium moscowii和Ca.Anammoxoglobus。雖然它們在生理、代謝和結構特征方面十分相似, 但其生存環境和生態位差異顯著, 具有高度的棲息地特異性(Daleet al, 2009)。例如, 在海洋生態系統中Ca.Scalindua的豐度更高, 在高鹽度環境中占絕對優勢(Awataet al, 2013)。有研究報道,海洋沉積物中厭氧氨氧化活性較強, 貢獻率占40%～60% (Thamdrupet al, 2002; Brandsmaet al,2011), 而淡水湖泊、河口和自然土壤中以Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia為主(Humbertet al, 2010), 其厭氧氨氧化相對貢獻僅10%～20% (Shenet al, 2017)。Ca.Jettenia則較多存在于生物反應器和污水處理廠中(Quanet al, 2008; Sonthiphandet al, 2014)。當前,對水產養殖塘也開展了一些研究, 養殖生態系統不同于自然環境, 受人為管理干擾較大, 氮負荷較高(楊雪琴等, 2018)。Shen 等(2016)對江蘇某淡水養殖塘沉積物厭氧氨氧化的研究中發現其速率為3.70～19.40 nmol/(g·d), 相對貢獻為 1.20%～15.30%, 并且Ca.Brocadia屬為其優勢屬。另外, 對菲律賓蛤仔海水養殖塘有貝區和無貝區沉積物研究發現有貝區厭氧氨氧化速率為0.000 92 μmol/(kg·h), 且埋棲型貝類的擾動會影響沉積物厭氧氨氧化反應(朱文君等, 2022)。因此, 受微生物對環境基質的反應不同, 厭氧氨氧化作用及其相對貢獻具有很強的不確定性(Teixeiraet al, 2016)。濾食性貝類灘涂養殖具有明顯的生態學效應, 其棲息在咸淡水交匯的河口附近和沿海砂泥底部, 能夠通過調整其生理活動以適應環境的改變(呂昊澤等, 2016), 并影響系統的物質循環和能量流動,進而影響微生物活性(柴欣如等, 2022)。目前, 對肥水-縊蟶養殖塘這一特殊養殖模式下沉積物厭氧氨氧化過程的研究還鮮見報道, 近海養殖區沉積物中厭氧氨氧化微生物的活性及分布需要更系統和深入地分析。

基于以上, 本文選擇福建近海九龍江口肥水-縊蟶養殖塘為研究對象, 采用15N 同位素示蹤技術和高通量測序技術揭示肥水-縊蟶養殖模式下沉積物中厭氧氨氧化速率及微生物群落結構, 并應用統計分析方法探討驅動厭氧氨氧化活性和微生物群落變化的主要環境因子, 對濱海養殖環境下的脫氮過程進行初步研究, 為保護近海水域生態環境、緩解全球氣候變暖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

九龍江口是福建典型的入海河口之一, 位于我國暖熱濕潤的亞熱帶東南沿海地區, 年均氣溫19.6～21.0 °C, 年均降水量1 400～2 000 mm (程金等,2023), 降水多集中在3～9 月, 是紅樹林的主要分布地區之一(Yanget al, 2018)。紅樹林能提供優質的自然餌料和良好的庇護場所, 為該沿海地區水產養殖提供優越的條件(Alongiet al, 2005; 王文卿等, 2021)。縊蟶養殖由兩個相鄰的池塘組成, 即肥水塘和縊蟶塘, 肥水塘體積是縊蟶塘的3～5 倍。較大的肥水塘主要用于施加肥料(碳酸氫銨肥料、有機無機復混肥等)以培養藻類作為餌料供縊蟶食用。縊蟶塘主要為蟶養殖場所, 接受肥水塘的肥水以及潮水中有機顆粒物。兩塘之間設置閘門以便向縊蟶塘注入肥水。養殖周期通常是10 月投放蟶苗, 次年5 月全部收獲, 5～7 月縊蟶塘會進行底泥整塘清淤。養殖期間, 每天凌晨將縊蟶塘水排干, 早上再打開閥門使肥水塘的肥水流入縊蟶塘, 流入量僅占整個肥水塘池水的1/3 或更低。肥水塘中水位下降至一定程度后打開閥門使對岸九龍江水流入灌滿肥水塘, 并投放肥料, 投放量根據縊蟶的生長及攝食情況調整。

1.2 樣品采集和處理

于2021 年4 月選擇了九龍江口紫泥紅樹林區周邊的縊蟶-肥水養殖塘(24°27′28″N, 117°54′45″E; 圖1),分別采集了5 個縊蟶塘(C1、C2、C3、C4、C5)和4個肥水塘(Z1、Z2、Z3、Z4)的沉積物(0～10 cm)和上覆水樣品共9 個。采樣時各池塘采集2 L 水樣于聚乙烯塑料瓶中密封, 并分別于每個塘中央及四周隨機選取表層沉積物充分混勻作為一個塘的沉積物樣品。混勻后立即置于聚乙烯密封袋中, 排盡空氣后密封,用冰盒儲存帶回實驗室。一部分樣品置于4 °C 冰箱保存, 并盡快進行理化參數的測定和同位素實驗, 另一部分置于-80 °C 冰箱保存, 用于提取DNA 進行分子生物學分析。

圖1 養殖塘采樣點分布Fig.1 Distribution of sampling site

1.3 樣品環境因子測定

選擇沉積物上覆水溶解氧(DO)、鹽度(S)和沉積物pH 值、氨氮(NH4+)、硝氮(NO3-)、亞硝氮(NO2-)、總氮(TN)、總碳(TC)和總硫(TS)為基本理化指標進行檢測。沉積物上覆水 DO 和 S 在采樣現場使用DZB-718L 型便攜式多參數分析儀測定。沉積物樣品采用《土壤農化分析》中的方法進行相應測定(鮑士旦, 2000), 沉積物pH 值采用酸度計測定(土水比1︰2.5)。NH4+、NO3-和NO2-的測定為采用2 mol/L 的KCl 溶液浸提沉積物樣品1 h, 將浸提液用0.45 μm 膜過濾后用連續流動分析儀(AAA3, Seal Analytical GmbH, 德國)測定, 沉積物TN、TC 和TS 利用元素分析儀(Elementar, Vario Micro, 德國)進行測定。沉積物總有機碳(TOC)采用總有機碳分析儀(TOC-LCPH,日本島津)測定。所有理化指標都選用3 組平行樣品進行測定, 結果取3 組平行樣品的平均值。

1.4 厭氧氨氧化速率和反硝化速率測定

采用15N 同位素示蹤來測定反硝化和厭氧氨氧化反應速率及對N2產生的貢獻。將50 g 沉積物樣品裝入1 L 的氣袋中, 并加入250 mL 經氦氣曝氣后的原位水, 混合制成均勻泥漿, 封口并將袋中空氣通過氣孔排盡。恒溫搖動培養3 天左右至氧氣和NO3-耗盡。按實驗分組在厭氧操作箱中分別加入5 mL 未標記或15N 標記溶液(15N 終濃度為100 μmol/L): ① 陰性對照, 只加(15NH4)2SO4; ② 陽性對照, (15NH4)2SO4和Na14NO3; ③ 實驗組: 添加Na15NO3。放入恒溫培養箱中反應并按0、3、6、9、12 h 時間點于厭氧操作箱內取樣至12 mL 真空玻璃管中, 并注入0.2 mL 7 mol/L 氯化鋅溶液終止反應。所加試劑均在配制時通過樣品瓶充氣抽真空清洗系統進行除氧。處理完的樣品避光倒置保存, 于膜進樣質譜儀(membrane inlet mass spectrometry, MIMS)上測定水中溶解的29N2和30N2的濃度,29N2和30N2濃度的計算公式如下(謝成軍等, 2020):

式中,D28、D29和D30分別表示反硝化中各N2產生量。用P29和P30分別表示MIMS 測得的各自N2總量, 結合公式(4)和(5), 且D30=P30, 從而可以得到:

Dtotal和Atotal分別為各樣品中反硝化和厭氧氨氧化反應的N2產生量, 并對采集時間點進行線性回歸, 即可得到該樣品的反硝化和厭氧氨氧化速率。

反硝化和厭氧氨氧化各自的脫氮貢獻率(Rd和Ra)可由下列公式計算得出:

1.5 DNA 提取及高通量測序

稱取 0.33 g 冷凍干燥的沉積物樣品, 使用FastDNA SPIN Kit for Soil 土壤DNA 提取試劑盒提取沉積物樣品中的總 DNA, 并用 Nano Drop 2000 UV-Vis Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific,USA)測定DNA 濃度。

厭氧氨氧化微生物特異性16S rRNA 基因(AMX)采用巢式PCR 擴增的方法(Wanget al, 2012; 王衫允等, 2012), 以提取的 DNA 為模板, 先利用引物pla46F(5'-GGATTAGGCATGCAAGTC-3')和630R(5'-CAKAAAGGAGGTGATCC-3')對浮霉菌門進行PCR擴增, 第二步擴增則以第一步PCR 產物為模板, 使用厭氧氨氧化微生物特異性引物 Amx368F(5'-TTC GCAATGCCCGAAAGG-3') 和 Amx820R(5'-AAAA CCCCTCTACTTAGTGC CC-3')進行厭氧氨氧化微生物特異性16S rRNA 基因的PCR 擴增。PCR 反應體系為30 μL, 其中, 2×Robust PCR Master Mix 15 μL,10 mmol/L 正反引物各1 μL, DNA 模板2 μL, 用無核酸酶純水補足至30 μL。擴增所得產物通過Hiseq 2500 平臺(Illumina, SanDiego, CA, USA)進行測序(派森諾生物有限公司, 上海)。高通量測序結果提交至GenBank(登錄號為PRJNA914860)。

1.6 數據處理與分析

高通量測序得到的原始序列經質控后, 利用Mothur 軟件(https://www.mothur.org/)去除低質量序列、及嵌合體, 過濾后得到高質量序列; 在97%相似度水平對高質量序列聚類, 并分別輸出代表序列和操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)表。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/)對序列進行物種分類注釋, 使用QIIME 程序計算厭氧氨氧化微生物特異性16S rRNA 基因的多樣性指數。

使用SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, III, USA)分析檢驗不同沉積物樣品環境因子及反硝化和厭氧氨氧化速率顯著性差異(P<0.05)。使用Canoco (V5.0)軟件進行去趨勢對應分析(DCA), 根據其結果判斷采用冗余分析(redundancy analysis, RDA)以評估環境因子對反硝化和厭氧氨氧化速率的影響。基于Bray-Curtis差異度指數采用主坐標分析(Principle Co-ordinate Analysis, PCoA)比較不同樣品厭氧氨氧化微生物群落結構差異; 利用R 語言(V4.1.3)進行Mantel tests相關性分析探究縊蟶塘和肥水塘厭氧氨氧化微生物群落結構與環境因子之間的相關性; 通過刪除不顯著路徑, 并比較AIC 值, 篩選出影響厭氧氨氧化速率和微生物群落的主要環境因子, 使用 R 語言piecewiseSEM 包構建結構方程模型(structural equation model; SEM)(Huanget al, 2020; 石亞飛等, 2022)。利用Origin 2021 軟件繪圖。

2 結果

2.1 養殖塘理化性質

養殖塘理化性質如表1 所示。縊蟶塘和肥水塘上覆水DO 水平在6.10～11.53 mg/L 之間, 肥水塘DO 水平顯著高于縊蟶塘(P<0.05)。縊蟶塘鹽度(26.80±0.26)顯著高于肥水塘(22.88±0.33)。所有沉積物樣品pH 值范圍為7.69～8.30, 偏堿性。沉積物中氮形態以NH4+為主, 含量為38.19～51.07 mg/kg, 且NH4+含量在縊蟶塘和肥水塘中差異顯著, 肥水塘中NH4+和NO3-含量平均值分別為(47.6±3.33)和(7.65±1.09) mg/kg, 均高于縊蟶塘(39.78±1.46)和(5.06±0.98) mg/kg (P<0.05)。各采樣點NO2-、TN 和TS 含量無明顯差異, 范圍分別為0.81～1.21 mg/kg、1.1～2.2 g/kg 和7.59～16.22 g/kg。縊蟶塘和肥水塘碳氮比無顯著差異, 但肥水塘 中 TC 含 量[(19.35±3.10) g/kg]和 TOC 含 量[(14.90±0.45) g/kg] 均 顯 著 高 于 縊 蟶 塘[TC:(14.08±1.48) g/kg; TOC: (9.60±0.73) g/kg;P<0.05],表明沉積物環境因子對養殖土地利用變化的響應十分敏感。

2.2 沉積物厭氧氨氧化和反硝化速率

縊蟶塘和肥水塘沉積物厭氧氨氧化和反硝化速率及厭氧氨氧化相對貢獻如圖2 所示, 縊蟶塘和肥水塘沉積物厭氧氨氧化速率范圍分別為0.94～1.26 和1.61～1.91 nmol/(g·h), 分別占總氮氣生成量的6.09%～8.06%和 8.73%～9.63%。肥水塘厭氧氨氧化速率[(1.76±0.20) nmol/(g·h)]顯著高于縊蟶塘[(1.07±0.11)nmol/(g·h)]。兩塘沉積物反硝化速率范圍為 12.06～18.26 nmol/(g·h)。縊蟶塘和肥水塘沉積物厭氧氨氧化速率和相對貢獻表現出顯著的養殖土地利用差異(P<0.05)。RDA 分析表明(圖3), DO、S、pH、NH4+、TC 和NO3-含量是影響縊蟶塘和肥水塘厭氧氨氧化速率的主要因素。

圖2 縊蟶塘和肥水塘沉積物厭氧氨氧化速率和相對貢獻(a)及反硝化速率(b)Fig.2 Potential anammox rates and relative contribution (a), and the denitrification rates (b) of sediments in the Sinonovacula constricta ponds and the breeding ponds

圖3 沉積物厭氧氨氧化速率與環境因子的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of anammox rate and environmental factors in sediments

2.3 沉積物厭氧氨氧化微生物群落結構

沉積物厭氧氨氧化微生物的所有序列進行聚類共得到2 945 個OTUs。對縊蟶塘和肥水塘沉積物樣品進行α多樣性指數統計分析, 通過Chao1、Shannon和Simpson 指數評估厭氧氨氧化微生物群落多樣性和豐富度, 結果見圖4。兩塘沉積物厭氧氨氧化微生物多樣性差異顯著(P<0.05)。并在OTU 水平上計算了縊蟶塘和肥水塘沉積物樣品的Bray-Curits 差異度矩陣, 進行厭氧氨氧化微生物的群落排序, PCoA 分析如圖5a 所示, 可以發現縊蟶塘和肥水塘的樣品距離較遠, 表明其厭氧氨氧化微生物的群落結構差異較大。根據每個OTU 的代表序列在系統發育樹中的位置, 對代表序列對應的OTU 的樣品序列進行物種注釋并計算每個樣品中屬水平上厭氧氨氧化微生物物種組成的相對豐度(圖5b), 結果顯示其序列隸屬于四個屬, 分別為Ca.Scalindua、Ca.Kuenenia、Ca.Brocadia和Ca.Anammoximicrobium。不同樣點的厭氧氨氧化微生物的物種組成差異不大,Ca.Kuenenia在所有樣品中所占比例最大, 為優勢菌屬。

圖4 縊蟶塘(CT)和肥水塘(ZT)沉積物樣品厭氧氨氧化微生物AMX 基因多樣性指數Fig.4 Diversity index of anammox 16S rRNA gene sequence of sediments in the Sinonovacula constricta ponds and the breeding ponds

圖5 縊蟶塘和肥水塘沉積物厭氧氨氧化微生物群落PCoA 分析圖(a)和物種組成圖(b)Fig.5 Principal Co-ordinates Analysis and species composition of anammox microbial communities in sediments of the Sinonovacula constricta pond and the breeding ponds

2.4 環境因子對厭氧氨氧化微生物的影響分析

選取厭氧氨氧化微生物屬水平組成相對豐度矩陣、多樣性指數矩陣及前120 個OTU 數據矩陣與環境因子進行Mantel tests 相關性分析, 以探究環境因子對沉積物厭氧氨氧化微生物群落的影響。由圖6 可知, 厭氧氨氧化微生物物種組成分布與NH+4(R=0.35,P=0.04)相關性顯著。厭氧氨氧化微生物多樣性與DO(R=0.24,P=0.04)和NO3-(R=0.45,P=0.03)顯著相關,與NH4+(R=0.53,P=0.002)呈極顯著相關。通過分析篩選得到影響厭氧氨氧化速率和微生物群落的主要環境因子構建結構方程(SEM)模型, 如圖7 所示, 養殖土地利用方式對DO 和NH4+濃度具有極顯著影響,同時NH4+含量是厭氧氨氧化微生物多樣性的主要影響因子。

圖6 沉積物厭氧氨氧化微生物與環境因子Mantel tests 相關性分析Fig.6 The mantel tests correlation analysis between community of anammox bacteria and chemical characters of sediments

圖7 使用piecewiseSEM 包進行環境因子對沉積物厭氧氨氧化微生物群落結構影響的結構方程模型分析Fig.7 The structural equation model (SEM) of the effects of environmental factors on anammox microbial community structure based on the piecewiseSEM package

3 討論

厭氧氨氧化微生物廣泛分布于自然生態系統中,其介導的脫氮過程能夠有效減少NO 和N2O 等溫室氣體的產生 (Suenagaet al, 2021), 對控制全球氣候變暖發揮著關鍵性作用。本研究區域沉積物厭氧氨氧化速率范圍為 0.94～1.91 nmol/(g·h), 相對貢獻范圍為6.09%～9.63%, 與農田土壤(Zhuet al, 2011)、潮白河沉積物(彭強等, 2021)的活性范圍相近, 但顯著低于九龍江口紅樹林濕地沉積物脫氮貢獻(Caoet al,2017)。另外, 經高通量測序分析發現縊蟶塘沉積物厭氧氨氧化微生物多樣性不高, 進一步證實了功能性較強的環境中微生物多樣性偏低(Loreauet al, 2001;劉璐, 2016)。另外, 適應于淡水環境中的Ca.Kuenenia屬在本研究中相對豐度占比最高, 表明了研究區域濱海河口養殖塘的特殊性, 連接著陸地和海洋(洪義國等, 2019; Yaet al, 2021)。養殖飼料中含有甲酸和丙酸, 作為抑制性飼料添加劑防止飼料腐敗, 其也是養殖動物腸道中蛋白質及碳水化合物發酵的主要產物,Ca.Anammoximicrobium屬存在于養殖塘中, 能夠氧化甲酸和丙酸(Kartalet al, 2007; 張亦弛等, 2022)。

養殖土地利用方式、DO、NH4+和NO3-等被認為是影響本研究沉積物厭氧氨氧化微生物的主要環境因素。蓄水養藻的肥水塘上覆水鹽度顯著低于縊蟶塘,推測可能由于周期性潮水鹽度變化和采樣時短期的降雨導致。縊蟶捕食以及擾動行為增加了水體濁度,降低了水體光合作用(丁維新等, 2020), DO 水平顯著低于肥水塘。另外, 肥水塘中藻類的光合作用以及縊蟶塘中縊蟶的擾動作用會促使兩塘中含氧的上覆水進入沉積物, 使得厭氧氨氧化在微厭氧的條件下發生(Chenget al, 2014), 與Zhu 等(2011)在水稻田的研究中發現DO 的可利用性是厭氧氨氧化發生的重要因素的結論一致。肥水塘沉積物厭氧氨氧化速率[1.61～1.91 nmol/(g·h)]和脫氮相對貢獻(8.73%～9.63%)顯著高于縊蟶塘。并且, 肥水塘沉積物中厭氧氨氧化微生物多樣性豐富, 群落結構復雜。有研究表明, 養殖動物擾動行為會改變沉積物性質和結構, 從而影響微生物群落(Kimet al, 2017)。厭氧氨氧化微生物對環境要求較高(Dalsgaardet al, 2005), 因此, 每日頻繁交換水、養殖動物擾動和養殖周期底泥翻新等活動可能使得縊蟶塘沉積物厭氧氨氧化微生物活性受抑制, 從而脫氮速率顯著低于營養鹽充足、微生物多樣性復雜且沉積環境相對穩定的肥水塘。NH4+濃度與厭氧氨氧化微生物群落呈顯著正相關。底物中NH4+的可利用性是影響厭氧氨氧化活性的關鍵控制因素(Risgaard-Petersenet al, 2004; Shenet al, 2014), 可為厭氧氨氧化反應的發生提供底物。Zhu 等(2011)對稻田土壤的研究中也證實較高的NH4+含量會促進厭氧氨氧化微生物活性。功能微生物與相應功能速率間的相關性并不顯著可能是由于河口養殖受人為影響大、環境條件波動范圍大, 限制了微生物生長活性和生物活動(Zhenget al, 2016)。

值得注意的是, 目前已有大量研究表明厭氧氨氧化具有較強的時空異質性(Shanet al, 2016; 毛鐵墻等, 2020; Wuet al, 2021)。 Zhang 等(2016)研究指出,陽澄湖淡水養殖塘養殖期沉積物厭氧氨氧化脫氮貢獻顯著低于非養殖期, 并且厭氧氨氧化微生物豐度隨養殖季節發生顯著變化。受養殖溫度、養殖時期、季節和養殖類型等因素的影響, 氮轉化速率及其相關功能微生物和功能基因的數量及群落結構對其的響應規律會受到取樣時間的影響。因此, 對于空間大尺度下研究養殖環境中氮轉化相關微生物動態變化規律有待進一步開展。

4 結論

(1) 縊蟶塘和肥水塘沉積物厭氧氨氧化速率范圍分別為0.94～1.26 和1.61～1.91 nmol/(g·h), 分別占總氮氣產生量的6.09%～8.06%和8.73%～9.63%。肥水塘厭氧氨氧化速率和相對貢獻顯著高于縊蟶塘。

(2) 縊蟶塘和肥水塘厭氧氨氧化微生物由Ca.Scalindua、Ca.Kuenenia、Ca.Brocadia和Ca.Anammoximicrobium四個屬組成。其中,Ca.Kuenenia為主要的優勢屬。肥水塘沉積物厭氧氨氧化微生物多樣性和脫氮活性顯著高于縊蟶塘(P<0.05)。

(3) 養殖動物擾動以及頻繁交換水等外界影響可能使得縊蟶塘沉積物厭氧氨氧化速率低于營養鹽充足、微生物多樣性復雜且沉積環境相對穩定的肥水塘。養殖塘中DO、NH4+和NO3-含量是影響厭氧氨氧化微生物脫氮的主要理化因子。