雙殼貝類CK1 基因家族的鑒定及表達分析*

孫鳳芝 呂珍立 劉福云 邢 強 連姍姍 王 師,2,3 包立隨

(1.中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室 山東青島 266003; 2.嶗山實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室 山東青島 266237; 3.中國海洋大學熱帶海洋生物種質資源開發與種業工程中心 海南三亞 572000; 4.中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所 山東青島 266003)

酪蛋白激酶1 (Casein kinase 1,CK1)是生物體內一種絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶家族, 是最早鑒定的激酶之一, 其在多種動物類群中均有報道。在脊椎動物中, 哺乳類共鑒定出7 種CK1家族成員(α、αlike、γ1、γ2、γ3、δ 和ε)以及α、δ、ε 和γ3 的幾種剪接變體(Grossetal, 1998; Knippschildetal, 2005; Fulcheretal, 2020)。在斑馬魚(Daniorerio)中存在6 個成員(α、γ1、γ2a、γ2b、δ 和ε) (Albornozetal, 2007), 但在無脊椎動物秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中發現了52 個CK1基因, 其中可能含有很高比例的假基因, 并不行使功能(Manningetal, 2002a, 2002b; Hirstetal, 2020)。所有CK1家族成員在其激酶結構域序列都表現出高度保守性, 經典的CK1蛋白激酶基序由序列Ser/Thr-X-X-(X)-Ser/Thr 構成(Flotowetal, 1990;Meggioetal, 1992)。它們的差異存在于N 端和C 端的非催化結構域, 其中N 端分子量較小且主要由β-轉角組成, C 端分子量較大且主要是由α-螺旋組成。盡管在組織分布和亞細胞定位方面存在差異, 但CK1基因家族各成員在功能上具有一定的相似性, 主要參與DNA 損傷應答和修復、細胞增殖和凋亡、胚胎發育和穩態等重要的生物學過程(Cheongetal, 2011)。

CK1激酶家族是面對應激源時介導細胞快速、充分進行應激反應的重要介質(Knippschildetal, 1997;Xuetal, 2019)。有研究表明, 極端溫度下CK1可以介導Hsp70 和Hsp90 的磷酸化參與組織穩態調控(Mulleretal, 2013) , 同時CK1α還參與細胞程序性凋亡的過程(Zelenaketal, 2012); 在杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani)中,CK1可以磷酸化Hsp23 以維持其溫度應激敏感性(Kr?ber-Boncardoetal, 2020);在布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)中,CK1能夠與RNA結合蛋白ZC3H11 發生作用以應對溫度應激和維持細胞生長(Miniaetal, 2016)。哺乳動物在缺氧應激狀態下,CK1δ能夠將缺氧誘導因子(HIF-1α)磷酸化, 以控制HIF-1 的活性從而維持穩態(Kalousietal, 2010)。另外有研究表明, 細胞處于基因毒性應激狀態時,CK1通過對腫瘤抑制因子 p53 的磷酸化作用介導DNA 損傷的修復(Huartetal, 2009), 這對于調控細胞生長和基因組完整性具有重要作用(Winteretal, 2004;MacLaineetal, 2008)。

扇貝、長牡蠣等雙殼貝類是我國的重要經濟貝類,適宜的環境溫度是維持其正常生命活動的必要條件,近年來夏季海水溫度上升引起高溫應激成為導致雙殼貝類出現大規模死亡的重要原因(Saidetal, 2022)。作為機體高溫應激時重要的調節激酶, 開展雙殼貝類CK1基因的鑒定和研究, 明確其在高溫應激時的表達規律, 有助于深入了解其在機體高溫應激的調節機制, 為雙殼貝類良種選育與養殖提供理論基礎。因此, 本研究對蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)、長牡蠣(Crassostreagigas)和侏儒蛤(Mulinialateralis)等4 種雙殼貝類物種的CK1基因家族進行了全基因組鑒定和特征分析。通過結構比對和時空表達分析探究雙殼貝類中CK1蛋白結構、表達模式和高溫應激反應規律。這是首次對雙殼貝類動物中CK1基因家族的系統篩查和特征描述研究, 為深刻理解雙殼貝類CK1的基因特性、進化關系和調控功能提供了重要的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 雙殼貝類CK1 基因家族鑒定

為了鑒定雙殼貝類CK1家族成員基因, 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Uniprot (https://www.uniprot.org/)和ENSEMBL (http://ensemblgenomes.org/)數據庫中下載代表性的脊椎動物: 人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、斑馬魚(D.rerio)和無脊椎動物秀麗隱桿線蟲(C.elegans)的全長CK1 蛋白序列(表1), 將以上蛋白序列與四種雙殼貝類的基因組和轉錄組進行比對以鑒定CK1家族基因(e<1×10–5) (Altschuletal, 1990)。為了確保CK1基因家族鑒定的完整性, 通過HMM 搜索方法(http://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer) 進行序列分析, 并對所有潛在的雙殼貝類CK1 蛋白的保守結構域進行了比對。

表1 分析所用蛋白序列注冊號Tab.1 The accession numbers of proteins used for analysis

1.2 序列分析

將候選的雙殼貝類CK1家族成員序列提交給ORF Finder 程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測ORF (開放閱讀框), 并將預測的ORF 翻譯成氨基酸序列。使用SMART (Letunicetal, 2021)程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)對翻譯后的蛋白質序列進行CK1 保守結構域的識別。Sequence Manipulation Suite 工具(http://www.bioinformatics.org/sms2/color_align_cons.html)用于序列比對分析, ProtParam(Wilkinsetal, 1999)工具(https://web.expasy.org/ protparam/)用來預測等電點(PI)、分子量(MV)不穩定指數(Instability index)和疏水性(Gravy)。用IBS1.0.3(Liuetal, 2015)軟件繪制了所有已鑒定的CK1 基因家族成員的蛋白結構。使用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org)對所有雙殼貝類CK1 基因家族成員進行蛋白質三級結構的預測。

1.3 系統發育分析

在NCBI 數據庫、Uniprot 數據庫和Ensembl 數據庫中下載人(H.sapiens)、小鼠(M.musculus)、非洲爪蟾(X.laevis)、青鳉 魚(Oryziaslatipes)、斑馬魚(D.rerio)、海鞘(Cionaintestinalis)、文昌魚(Branchiostoma floridae)、光滑雙臍螺(Biomphalariaglabrata)、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)、秀麗隱桿線蟲(C.elegans)和柱狀珊瑚(Stylophorapistillata)共11 個物種的CK1蛋白全長序列(表1), 與鑒定到的4 種雙殼貝類的CK1 蛋白全長序列共同用于構建系統發生樹, 使用MEGA7(Kumaretal, 2016)軟件中的ClustalW(Larkinetal, 2007)方法進行多序列比對, 使用NJ 方法對CK1 進行系統發生樹構建, Bootstrap 法進行重復檢驗,重復1 000 次。使用iTOL 進行優化與展示。

1.4 雙殼貝類CK1 基因家族時空表達分析

為了進行表達分析, 從已發表的蝦夷扇貝(Wangetal, 2017)、櫛孔扇貝(Lietal, 2017)、長牡蠣(Zhanget al, 2012)和侏儒蛤(實驗室未發表數據)的不同胚胎發育階段和成體組織的轉錄組數據中計算CK1基因家族的表達量TPM (Transcript per Million)值。其中胚胎發育階段包括受精卵、多細胞、囊胚、原腸胚、擔輪幼蟲、D 型幼蟲、殼頂幼蟲前期、殼頂幼蟲中期、殼頂幼蟲后期、匍匐幼蟲、稚貝; 成體組織包括肝胰腺、鰓、外套膜、肌肉、雄性性腺和雌性性腺。為了可視化CK1基因家族在四種雙殼貝類動物中的表達模式,通過R 軟件包進行繪制熱圖。

1.5 雙殼貝類胚胎發育基因共表達網絡構建

利用R 中的WGCNA 軟件包(Langfelderetal,2008)構建了雙殼貝類個體發育的基因共表達網絡,蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、長牡蠣和侏儒蛤分別有20 418、22 179、23 573、22 941 個基因參與構建基因共表達網絡, 基因模塊最小基因數為300。基因共表達網絡不同模塊使用不同顏色進行標記, 未分配的基因用灰色標記, 模塊中基因的關鍵程度通過計算模塊內基因連通度來決定, 并對CK1家族成員所在模塊進行連通度以及KEGG 富集分析。

1.6 高溫應激實驗

采集活性好的40 只2 齡蝦夷扇貝個體進行高溫應激實驗。實驗前, 將所有個體隨機平分成兩個平行組, 并在實驗室分開暫養7 d, 使其適應實驗室養殖環境, 期間水溫維持在10 °C, 每天換水1/2, 投喂扁藻等單胞藻, 投餌量為5×104ind./mL。實驗時, 將兩個平行組個體由10 °C 暫養水體分別同時迅速轉移至兩個23 °C 水體當中(充足供氧)。在溫度驟變后的0、3、6、12 和24 h 分別從兩個平行組中隨機取3 只蝦夷扇貝, 迅速解剖并收集其鰓, 組織分離后立刻使用液氮冷凍, –80 °C 保存以備總RNA 的提取。

1.7 RNA 提取和實時定量PCR (qPCR)分析

使用實驗室前期發表RNA 提取方法(Huetal,2006), 從采樣的蝦夷扇貝的鰓中提取總RNA, 然后用DNaseI 消化。使用Nanovue Plus 分光光度計測定RNA 的濃度和純度, 通過瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的完整性。使用莫洛尼小鼠白血病病毒(MMLV)逆轉錄酶在20 μL 的體系中合成第一鏈cDNA, 每個樣本總RNA 含量 2 μg 作為模板, 0.5 mg 的Oligo(dT)18作為引物。混合體系在65 °C 下變性5 min, 然后在冰上立即冷卻。加入反轉錄酶、反應緩沖液和dNTPs 后,在以下條件下擴增 cDNA: 42 °C 90 min, 72 °C 10 min。將cDNA 稀釋至10 ng/μL, 保存在–20 °C, 作為qPCR 的模板。EF1A被用作反應所需的內參基因(Santerreetal, 2013; Lietal, 2016), 所有引物都是用Primer 5.0 軟件設計的, 使用BLASTN (1×10–10)將所設計的引物與蝦夷扇貝基因組進行比較以驗證其特異性, 并列于表2。使用LightCycler 480 實時定量PCR 儀(Roche)進行擴增。

表2 蝦夷扇貝CK1 基因及內參基因引物序列Tab.2 Sequences of primers for CK1 gene and internal reference gene of P.yessoensis

實時定量PCR 反應過程如下: 取2 μL cDNA 作為反應模板, 加入10 μL SYBR Green I Real-time PCR Master Mix, 上、下游引物(2 μmol/L)各4 μL, 最終得到20 μL 的反應體系。反應程序如下: 95 °C 10 min; 95 °C 15 s, 53 °C 60 s, 40 個循環; 95 °C 15 s, 1 個循環。進一步通過熔解曲線驗證引物特異性, 使用2–ΔΔCt的方法計算CK1基因的相對表達量。基于各基因的相對表達水平,使用SPSS 軟件進行數據的統計分析, 使用獨立t 檢驗的統計軟件包, 分析各CK1基因表達變化的規律。

2 結果

2.1 雙殼貝類CK1 基因家族全基因組的鑒定和結構分析

通過多物種、多組學的系統比對策略, 從蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、長牡蠣、侏儒蛤的全基因組中均鑒定出4 個CK1家族成員, 包括CK1α,CK1αlike,CK1δ,CK1γ3, 并發現CK1ε,CK1γ1,CK1γ2在雙殼貝類中發生了丟失。根據CK1 蛋白結構(表3), CK1δ 和CK1γ3氨基酸序列長度(>400 aa)明顯大于CK1α 和CK1αlike(300～400 aa)。各CK1 家族成員均是疏水性蛋白質且穩定性較好。另外, 蛋白質的二級結構信息顯示, 除了CgCK1δ 中的α-螺旋數目最多,其他的蛋白二級結構中的無規卷曲的數目最多, 其次是α-螺旋數目, β-折疊和β-轉角的數目相似。通過對雙殼貝類CK1 的保守結構域的多重序列比對發現CK1 最佳的磷酸化基序均為T-G-T (圖1)。

圖1 雙殼貝類CK1 蛋白序列比對Fig.1 CK1 protein sequences alignment in four bivalve species

表3 雙殼貝類CK1 基因家族特征總結Tab.3 Summary in characteristics of CK1 gene family in four bivalves

4 種雙殼貝類動物的CK1 均包括一個分子量較小的N 端, 主要由β-折疊組成, 和一個分子量較大的C端、主要由α-螺旋狀組成。其中N-末端的分子量范圍0.95～5.80 kDa, C-末端的分子量范圍4.57～22.77 kDa。保守結構域分子量范圍28.20～31.16 kDa, 其中雙殼貝類CK1α 保守結構域分子量范圍為30.87～30.92 kDa,CK1αlike 保守結構域分子量范圍為30.87～30.99 kDa,CK1δ 保守結構域分子量范圍為 29.99～31.16 kDa,CK1γ3 保守結構域分子量范圍為28.2～29.97 kDa, 是保守結構域分子量最小的家族成員(圖2)。各CK1 蛋白的序列存在差異, 但它們的蛋白質三級結構具有相似性(圖3)。

圖2 雙殼貝類CK1 蛋白結構域Fig.2 Structure of CK1 proteins in four bivalve species

圖3 雙殼貝類CK1 蛋白三級結構預測Fig.3 Tertiary structure prediction of CK1 proteins in four bivalve species

2.2 雙殼貝類CK1 基因家族的系統發生分析

為了確定雙殼貝類CK1基因的系統發生關系,我們構建了15 種物種的CK1系統發生樹(圖4)。系統發育分析表明, 所有的CK1基因被細分為7 個成員簇, 包括CK1α,CK1αlike,CK1δ,CK1ε,CK1γ1,CK1γ2,CK1γ3, 且都按照成員分類聚在一起。在每個成員聚類過程中, 原口動物與后口動物分別產生了獨立進化枝, 其中在軟體動物形成的相對獨立的進化枝中,蝦夷扇貝的CK1基因和櫛孔扇貝的CK1基因都具有最近的親緣關系, 同時與長牡蠣、侏儒蛤存在相對較近的親緣關系, 符合物種之間的系統發生關系。

圖4 CK1 基因家族系統發生樹Fig.4 The phylogenetic tree of CK1 gene family

2.3 雙殼貝類CK1 基因家族時空表達分析

基于雙殼貝類胚胎發育各時期的轉錄組數據分析(圖5a), 所有雙殼貝類CK1基因均在擔輪幼蟲時期之前呈現出不同水平的高表達。其中PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1δ、CfCK1γ3、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1α、MlCK1δ、MlCK1γ3、主要在受精卵到多細胞期具有相對較高的表達量, 并在囊胚期的表達量下降;CgCK1α、MlCK1αlike在多細胞期開始具有較高的表達量,CgCK1α在原腸胚期表達量開始下降, 而MlCK1αlike在囊胚和原腸胚期的表達量相對較低, 在擔輪幼蟲期表達量再次上升;PyCK1α、CfCK1α在囊胚期至擔輪幼蟲期具有相對較高的表達量, 其中原腸胚時期達到最高, 從擔輪幼蟲期開始其表達量開始逐漸下降;CfCK1αlike、CgCK1αlike從囊胚到擔輪幼蟲期有相對較高的表達量, 在原腸胚時期具有最高表達量。

圖5 雙殼貝類CK1 基因家族時空表達譜Fig.5 Spatio-temporal expression profiles of CK1 family genes in four bivalve species

對CK1家族基因在雙殼貝類成體組織中的表達分析顯示(圖5b),不同的基因在成體組織中的表達模式較為多樣, 其中PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1αlike、CfCK1δ、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1αlike、MlCK1δ、MlCK1γ3在雙殼貝類的鰓中表達量明顯高于其他組織。另外PyCK1α、CfCK1α、CfCK1γ3、CgCK1α和MlCK1α表達模式相似, 均在雙殼貝類的雄性性腺中具有最高的表達量。而值得注意的是,CgCK1αlike在長牡蠣的肌肉中具有最高的表達量。

2.4 雙殼貝類胚胎發育基因共表達網絡及功能富集

我們構建了蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、長牡蠣和侏儒蛤個體發育時期的基因共表達網絡(圖6a), 網絡模塊數目分別為12、14、9 和10 個, 將模塊中的前10% 連通度的基因定義為關鍵基因。在蝦夷扇貝中PyCK1αlike、PyCK1δ和PyCK1γ3劃分在turquoise 模塊(PyM1), 其中PyCK1δ是該模塊的關鍵基因,PyCK1α在yellow模塊(PyM2); 在櫛孔扇貝中CfCK1α和CfCK1αlike在brown 模塊(CfM1),CfCK1δ和CfCK1γ3分別被劃分至yellow (CfM2)和pink (CfM3)模塊, 均為關鍵基因;在長牡蠣中CgCK1α和CgCK1αlike劃分在blue 模塊(CgM1)且為關鍵基因,CgCK1δ和CgCK1γ3在yellow模塊(CgM2)。在侏儒蛤中MlCK1α、MlCK1δ和MlCK1γ3劃分在yellow 模塊(MlM1),MlCK1αlike是侏儒蛤網絡turquoise 模塊(MlM2)的關鍵基因。對CK1為關鍵基因的模塊(PyM1、CfM2、CfM3、CgM1、MlM2)進行KEGG 功能富集分析結果顯示,PyCK1δ、CfCK1δ、CgCK1α和CgCK1αlike在胚胎發育時期除了DNA 復制、RNA 轉運和降解等基本生物過程, 還參與了堿基切除修復、核苷酸切除修復以及錯配修復等與DNA 損傷修復相關的過程。CfCK1γ3主要參與了核糖體過程,MlCK1αlike參與調控蛋白質轉運、MAPK 信號通路、鈣信號通路和Wnt 信號通路。

圖6 雙殼貝類個體發育的基因共表達網絡及KEGG 富集Fig.6 Gene co-expression network and KEGG enrichment in individual development

2.5 高溫應激條件下CK1 的表達分析

本研究采用qPCR 方法, 在蝦夷扇貝受到高溫應激后0、3、6、12 和24 h 檢測鰓中CK1基因的表達水平變化(圖7), 其中誤差線表示平均值±SE (n=6)。結果顯示,PyCK1α、PyCK1αlike和PyCK1δ在高溫應激后總體表達趨勢相似, 均在應激3 h 時顯著上調(分別為0 h 的1.08、1.50、2.39 倍,P<0.05),PyCK1α在應激6 h 時持續上調達到最高值, 隨后表達量開始下降并于24 h 時顯著低于0 h (P<0.05)。而PyCK1αlike和PyCK1δ從應激3 h 后表達量開始有所下降, 12 h和24 h 時相對表達量均低于0 h, 在24 h 時下調最為顯著(PyCK1αlikeP<0.05,PyCK1δP<0.01)。值得注意的是PyCK1γ3 顯示出不同的響應模式, 在應激后不同時間點的相對表達量均呈現了下調趨勢, 3 h、6 h、12 h 和24 h 的相對表達量均低于0 h, 并在12 h 和24 h 時顯著下調(P<0.05)。

圖7 高溫應激后CK1 基因在蝦夷扇貝鰓中表達情況Fig.7 Gene expression profiling of CK1 genes in the gill after heat stress treatment

3 討論

本研究聯合基因組和轉錄組數據對4 種雙殼貝類CK1基因家族進行了全基因組鑒定, 并探究了其時空表達特征和高溫應激條件下的表達規律。雙殼貝類CK1基因均在擔輪幼蟲時期之前有相對較高的表達, 其中PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1δ、CfCK1γ3、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1α、MlCK1δ、MlCK1γ3在受精卵中呈現相對較高的表達量, 可能是來自于母源性mRNA, 并在囊胚或原腸胚時期基本降解完全;PyCK1α、CfCK1α、CfCK1αlike、CgCK1α、CgCK1αlike、MlCK1αlike在多細胞或囊胚時期開始具有相對較高的表達量, 具有合子表達特征。Albornoz等(2007)在研究CK1基因家族在斑馬魚胚胎發育時期的表達模式中也發現類似規律, 除了CK1ε,其他CK1基因在胚胎發育的早期階段普遍表達, 并且具有母源和合子表達的特征。

PyCK1δ、CfCK1δ、CgCK1α、CgCK1αlike顯著富集到修復DNA 損傷的相關通路, 暗示了雙殼貝類胚胎早期細胞分裂與DNA 復制活動旺盛,CK1家族基因的高表達可能對于其維持正常細胞周期活動、DNA 修復等具有重要作用。Puigvert 等(2013)研究發現CK1α可以通過磷酸化作用調控促凋亡和抗凋亡信號途徑競爭以響應DNA 損傷來調節細胞存活。另外,CK1δ在DNA 修復和細胞周期調節中起著重要作用(Knippschildetal, 2014), Greer 等(2017)研究發現CK1δ的表達有助于DNA 損傷的有效修復和維持有絲分裂檢查點的正常功能。另外有研究表明,CK1α可以通過磷酸化Wnt 受體相關蛋白Dvl 增加與Wnt受體的親和力來完成對細胞行為和細胞命運的嚴格控制, 從而維持正常的胚胎發育(Cruciat, 2014;Banerjeeetal, 2019; Lauetal, 2019)。而MlCK1αlike在Wnt 相關通路的顯著富集也印證了以上發現。

在成體組織中,PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1αlike、CfCK1δ、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1αlike、MlCK1δ和MlCK1γ3在鰓中有較高的表達。纖毛是雙殼貝類動物的鰓行使呼吸、營養吸收等重要生理功能的結構基礎(Gómez-Mendikuteetal,2005)。有研究表明,CK1激酶能夠通過調節I1 dynein的保守調節因子維持纖毛的正常活動(Fuetal,2018)。CK1在雙殼貝類鰓中普遍的高表達現象可能對維持其纖毛的正常生理活動有重要的作用。另一方面,CK1基因家族在細胞應激反應中具有突出貢獻,雙殼貝類生存環境復雜, 鰓絲作為雙殼貝類與外界直接接觸的器官之一, 外界的有害刺激會直接影響鰓細胞的狀態和活力(Nogueiraetal, 2013)。故推測CK1在鰓中的高表達可能對于其抵御外界不良刺激具有重要的意義。PyCK1α、CfCK1α、CfCK1γ3、CgCK1α和MlCK1α在雄性性腺中具有最高的表達量。有研究表明,CK1可以通過磷酸化作用促進減數分裂過程的同源重組(Sakunoetal, 2015)。它們可能在雙殼貝類精子細胞的減數分裂過程中調節染色體行為。值得注意的是, 雖然4 種雙殼貝類之間整體CK1基因的表達趨勢相似, 但仍存在強烈的物種特異性, 這可能反映了4 個物種的適應性差異。例如,雖然CgCK1αlike在長牡蠣肌肉中表達最高, 但在其他貝類的肌肉中幾乎沒有表達。這可能與長牡蠣在潮間帶中的附著生活方式密切相關,CgCK1αlike或參與氧化應激反應以避免肌肉萎縮(Ohetal, 2021)。

Nielsen 等(2021)通過對北極潮間帶貽貝(Mytilus edulis)高溫應激實驗明確了高溫可以激發細胞產生熱休克蛋白以增加細胞抵抗能力, Muller 等(2013)發現CK1基因可以磷酸化Hsp70 和Hsp90 維持細胞蛋白的折疊和降解的平衡。這或許暗示著PyCK1α、PyCK1αlike 和PyCK1δ參與磷酸化熱激蛋白來響應高溫應激反應。另一方面, 也有研究表明高溫應激會導致DNA 損傷(Chengetal, 2018),PyCK1α、PyCK1αlike和PyCK1δ可能參與高溫應激引起的DNA 損傷反應。有研究表明,CK1γ3活性的下降, 能夠減少細胞壞死性凋亡(Leeetal, 2019), 故推測PyCK1γ3在高溫應激條件下的表達下調, 有利于維持鰓細胞的穩態從而避免細胞發生壞死性凋亡。持續的高溫應激條件下,會使蝦夷扇貝的細胞生存狀態遭到破壞,PyCK1表達量開始下降。以上結果暗示了CK1是參與細胞應激反應的重要基因, 參與了蝦夷扇貝處于高溫環境時的應激反應。

4 結論

本研究首次系統鑒定了蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、長牡蠣和侏儒蛤4 種雙殼貝類中的CK1基因, 包括CK1α、CK1αlike、CK1δ和CK1γ3, 并全面分析了其蛋白結構、蛋白質性質以及系統發生關系。通過胚胎、組織轉錄組分析和高溫應激實驗探究了雙殼貝類CK1基因家族的時空表達和高溫應激條件下的表達規律。結果表明, 雙殼貝類CK1可能參與維持早期胚胎發育的基因組穩定性和成體組織穩態。此外,CK1基因家族在高溫應激反應中的潛在響應機制也得到了細致的描述。本研究結果為更好地理解雙殼貝類動物CK1基因家族的進化關系、發育調節和應激反應機制奠定重要研究基礎。