三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CTL 基因SNP 位點E4-205 C/T 與抗溶藻弧菌相關性分析*

郝貴杰 林 鋒 母昌考 雷 寧 黃愛霞 崔雁娜沈亞芳 張海琪① 文 菁

(1.嶺南師范學院生命科學與技術學院 廣東湛江 524048; 2.農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室 浙江省魚類健康與營養重點實驗室 湖州市水產品品質提升與加工技術重點實驗室 浙江省淡水水產研究所 浙江湖州 313001; 3.寧波大學應用海洋生物學教育部重點實驗室 浙江寧波 315211)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隸屬甲殼綱(Crustacea), 十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae),梭子蟹屬(Portunus), 廣泛分布于中國、日本等海域,因生長速度快、味道鮮美而深受消費者青睞。早在20 世紀80 年代被列為我國海洋水產養殖對象, 是我國重要的一種海洋漁業資源。隨著育苗和養殖技術的日臻成熟, 梭子蟹養殖面積與產量逐年增加, 目前已成為沿海各省海水養殖的主導產品。隨著養殖規模的擴大及集約化發展, 對三疣梭子蟹的生存環境產生較大的影響, 與此同時養殖環境的污染等因素也對其免疫防御系統產生了一定程度的損害, 導致其自身的抗病力下降, 對病害的易感性增加, 病害頻發,例如弧菌引起的“乳化病”。由溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)引起的“乳化病”給三疣梭子蟹養殖業帶來了重大的經濟損失。因此, 研究三疣梭子蟹的免疫機制, 篩選與抗病相關的分子標記進行人工輔助育種, 選育優良抗病品系具有重要意義。

分子標記輔助選擇(molecular maker assisted selection, MAS)育種是利用分子標記與決定目標性狀的基因緊密連鎖的特點, 通過檢測所篩選的分子標記, 判定目的基因的存在, 從而進行目標性狀的選擇,與傳統的選育費時費力相比, 具有時間短、準確性高、而且受環境干擾較小等優點(Dekkerset al, 2002;Collardet al, 2005; Masoudiet al, 2007)。而C-型凝集素(C-type lectin, CTL)是甲殼類動物體液免疫中重要的免疫因子之一(McGrealet al, 2004), 是重要的模式識別受體之一(Wanget al, 2013a), 其對外來病原菌以及復雜的碳水化合物具有選擇性凝集作用, 同時具有調理素的作用, 介導血細胞對外來物質的吞噬,和機體其他免疫因子一起抵御外來病原的入侵(Wanget al, 2009a; Weiet al, 2012; Wanget al, 2013b)。課題組前期通過克隆CTL基因的DNA 全長, 并在其四個外顯子和三個內含子上共篩選到4 個SNP 位點及一個三堿基的缺失, 通過制備三疣梭子蟹易感群體及抗性群體, 分析了各多態性位點的基因型與抗溶藻弧菌的相關性, 結果發現CTL第四外顯子 SNP E4-205 C/T 具有三種基因型C/C、C/T 和T/T, 其T等位基因在抗病群體中出現的頻率(53%)顯著高于敏感群體(33.3%), T/T 基因型在易感群體中頻率為6.1%,在抗性群體中頻率為 21.2%, 具有顯著性差異(P=0.022) (Haoet al, 2015)。為初步闡明SNP E4-205 C/T 位點T/T 基因型三疣梭子蟹抗溶藻弧菌的分子機理, 本文對該位點非同義突變(ACT-AT T)導致的一個氨基酸改變(Thr-Ile)的兩種蛋白進行了體外重組表達與純化, 并從體內外研究了CTL的T/T 基因型梭子蟹在抗溶藻弧菌感染中的作用。以期為三疣梭子蟹免疫防御機制研究及抗病品系的選育提供基礎數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 耗材與試劑 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) (45～60 g)購自寧波鑫億鮮活水產有限公司, 正常投喂冰鮮小雜魚?；蚍中秃筠D至小池塘中的塑料筐內飼養備用。

溶藻弧菌由寧波大學海洋學院王國良教授惠贈;副溶血弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌由本實驗室保存。

TIANamp Genomic DNA Kit、TIANamp Blood DNA Kit、RNAsimple Total RNA kit、FastQuant cDNA RT Kit (with gDNA)、SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司; SsoFast EvaGreen supermix 購自Bio-rad 公司; T-vector pMD19(Simple)、TaKaRa LA Taq、質粒提取試劑盒、BamHI、XhoI、T4DNA 連接酶等購自TaKaRa 公司; 卡那霉素、Trans1-T1、pET-30a(+)、BL21(DE3)購自北京全式金公司; Agarose Gel DNA Purification Kit 購自Axygen 公司; Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司; Bradford 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所; 其他試劑為國產分析純。

1.1.2 儀器設備 Mx3005P 熒光定量 PCR 儀(Stratagene 公司); Rotor-Gene 6000 熒光定量PCR 儀(德國Qiagen 公司); Biometra TGradient PCR 儀購(華粵行儀器有限公司); JY920-IIN 超聲波裂解器(寧波新芝); 全波長酶標儀SpectraMax 190 (美國MD 公司);Smart Spec 3000 核酸蛋白測定儀(美國Bio-Rad 公司);Q-Exactive 質譜儀(Thermo Scientific 公司)。

1.2 活體三疣梭子蟹SNP 基因分型

隨機選取300 只健康三疣梭子蟹, 抽取少量血淋巴后繼續喂養。血淋巴樣品DNA 提取按照TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒說明書進行, 核酸濃度統一稀釋至20～30 ng/μL 備用。采用小片段擴增法進行HRM 分型(Liewet al, 2004), 并以標準基因型樣品為對照。根據實驗室前期篩選到的 CTL 基因 SNP E4-205 C/T 位點序列, 設計并篩選1 對特異性、靈敏性 均 優 的 引 物, HRM-124 F: 5′-AAATGCCTACT GGAGGAGAGAAACA-3′和HRM-124 R: 5′-TTTCCT CGTTACTTC TCACAAATCG-3′, 片段大小為124 bp。PCR 反應體系: 10 μL SsoFast EvaGreen supermix、0.8 μL HRM-124F (10 μmol/L)、0.8 μL HRM-124R(10 μmol/L)、1 μL DNA 模板(20 ng/μL)、雙蒸水補足20 μL。采用帶有HRM 分析功能的Rotor-Gene 6000熒光定量PCR 儀進行PCR 擴增, 擴增條件為: 98 °C 2 min, 40 個循環(98 °C 5 s, 58 °C 20 s)。利用儀器自帶的HRM 分析軟件進行結果分析, 分析閾值設為90%, 比較已知基因型樣品和待測樣品的標準視圖和差異視圖, 對待測樣品進行SNP 分型, 每個樣品4 個平行。引物合成及PCR 擴增產物測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3 T/T 和C/C 基因型CTL 編碼蛋白的原核表達及純化

根據實驗室前期獲得的CTL 基因序列(GenBank:JX195096.1), 設計PCR 擴增引物: CTL-BD-F: 5′-CC CATATGACTGGCTTCAGGCTGCTGT-3′(含Nde I 酶切位點), CTL-BD-R: 5′-CGGATTCCTCACAAATCG GACTTACA-3′ (含BamH I 酶切位點), 預計產物大小為438 bp, 引物由南京金斯瑞生物公司進行合成。以SNP E4-205 T/T 和C/C 基因型的梭子蟹cDNA 樣品為模板進行擴增, 目的片段分別命名為CTL-ACT 及CTL-ATT, 代表密碼子變異(ACT-ATT)導致所編碼氨基酸改變(Thr-Ile)。PCR 擴增體系: 5 μL 10×Ex Taq buffer、0.5 μL Ex Taq 酶、4 μL dNTP Mixture、1 μL CTL-BD-F、1 μL CTL-BD-R、1 μL cDNA、ddH2O 補至50 μL。PCR 擴增條件: 94 °C 5 min; 94 °C 50 s,54 °C 50 s, 72 °C 1 min, 33 個循環; 72 °C 10 min, 4 °C 10 min, 1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR 產物鑒定。

采用購自Axygen 公司的柱式DNA 膠回收試劑盒切膠回收PCR 產物。將目的片段克隆至T 載體, 進行 PCR、酶切及測序鑒定, 將構建原核表達質粒PET-CTL-ATT 及PET-CTL-ACT, 并轉化BL21 感受態細胞, 挑取單克隆進行鑒定、保存。將含CTL-ATT及CTL-ACT 的重組表達菌轉接到LB 培養基中過夜培養。次日, 按1︰100 比例接種到新鮮LB 液體培養基(含Kan 50 μg/mL), 37 °C, 250 r/min 恒溫搖至OD600達到0.6～0.8 時, 加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 誘導, 同時設置未誘導組。低溫離心收集菌體沉淀, 對菌體進行超聲破碎后采用咪唑梯度洗脫法進行蛋白純化, 經透析濃縮后再測定濃度, 蛋白進行 SDSPAGE 電泳檢測, 純化產物保存于–20 °C 備用。

1.4 重組蛋白CTL-ACT 及CTL-ATT 的質譜鑒定

將膠塊剪成1～2 mm3大小, 純水漂洗兩次, 依次進行脫色(25 mmol/L NH4HCO3, 50%乙腈水溶液)、脫水(先50%乙腈溶液, 后100%乙腈溶液)、還原(含10 mmol/L DTT 和25 mmol/L NH4HCO3的水溶液)、烷基化(含50 mmol/L IAM 和25 mmol/L NH4HCO3的水溶液)處理; 加入25 mmol/L NH4HCO3清洗10 min,后依次用 50%乙腈溶液、100%乙腈溶液脫水處理30 min; 吸出多余液體, 加入10 μL 酶解工作液(含0.02 μg/μL 胰蛋白酶的酶解覆蓋液)吸脹30 min, 再加入20 μL 酶解覆蓋液, 37 °C 水浴酶解16 h, 將上清轉至新離心管; 加入50 μL 肽段萃取液(含5%甲酸, 67%乙腈的水溶液)于剩下的膠中, 37 °C 水浴20 min 后低速離心, 合并上清, 揮干后脫鹽。將揮干的多肽樣品溶解Buffer A (含0.1%甲酸-水溶液)中, 后進行液相分離, 液相A 液為0.1%甲酸-水溶液, B 液為0.1%甲酸-乙腈溶液; 色譜柱Trap column 以100%的A 液平衡, 樣品由自動進樣器上樣, 并吸附到Trap column柱上, 再經 Analysis column 色譜柱分離, 流速為300 nL/min; 樣本間用空白溶劑30 min 流動相梯度清洗一次; 酶解產物經毛細管高效液相色譜分離后用Q-Exactive 質譜儀(Thermo Scientific)進行質譜分析。

1.5 不同基因型三疣梭子蟹的溶藻弧菌感染實驗

將T/T、C/T 及C/C 三種基因型梭子蟹分為三個組, 各組均設有感染組和對照組, 溶藻弧菌7.8×106CFU/mL (預實驗結果)注射量為0.2 mL/只。感染后不同時間(0、3、6、12、24、48、72、96 h)進行血淋巴及肝胰腺細菌分離, 冰上采取梭子蟹的肝胰腺和肌肉組織并迅速置于液氮罐中, 后轉入–80 °C 保存待用。

1.6 溶藻弧菌在三疣梭子蟹組織中的復制

根據溶藻弧菌的膠原蛋白酶基因序列, 設計特異性擴增引物: JY142-F: 5′-TTTGGCAAGGTCTGT TTGGTTAC-3′, JY142-R: 5′-GTGGCTTACACGTT GGAATGATC-3′, 并構建含溶藻弧菌膠原蛋白酶基因片段的重組質粒pMD19-JY142。根據質粒提取試劑盒抽提pMD19-JY142 質粒DNA, 并測定其濃度和純度, 根據公式: 質粒拷貝數(單位: copies/μL) =(6.02×1014×質粒濃度) / [(T 載體DNA 長度+目的基因片段長度)×660], 計算質?？截悢怠＠秒p蒸水將標準質粒稀釋成102～1098 個梯度備用, 提取感染后不同時間點的組織樣品 DNA, 定量后作為待測樣品模板, 與質粒標準品一起進行AQ-PCR (absolute quantitative PCR)反應, 每個樣品測定 3 次。根據SuperReal Premix Plus (SYBR Green)說明書配制PCR反應體系, 熒光定量PCR 儀Mx3005P 進行擴增, 反應結束后系統自動生成標準曲線。

1.7 兩種重組蛋白的凝集活性檢測

1.7.1 小鼠紅細胞凝集活性 健康小鼠進行心臟采血, 保存于4 °C 冰箱中, 臨用前3 000 r/min 離心3 min, 取血細胞以0.85%生理鹽水洗三次后, 配成2% (V/V)血細胞懸液備用。于96 孔微量血凝板中進行凝集實驗, 每孔加入25 μL 的TBS-?, 取25 μL 兩種重組蛋白各做連續2 倍稀釋, 再加入25 μL 的2%血細胞, 室溫靜置1～2 h, 按文獻觀察并記錄紅細胞凝集情況(戴華生, 1983)。

1.7.2 細菌凝集活性 所用菌株為金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌以及酵母菌為代表。具體步驟如下: 各菌經過夜培養后, 8 000 r/min 離心5 min; 棄去培養基后, 加入TBS 緩沖液, 重新懸起菌體再次離心, 按此重復清洗菌體三次, 徹底去除培養基成分。使用TBS-I 重懸菌體, 并通過測定菌液濃度將其稀釋至1.5×109cell/mL; 取20 μL 重組蛋白至酶標板孔中,20 μL BSA (1 mg/mL)溶液作為對照組, 再取10 μL 菌懸液加入并混勻, 室溫下孵育45 min 后, 取10 μL 至載玻片上, 在顯微鏡下觀察。

1.8 兩種重組蛋白對溶藻弧菌的抑菌活性

采用液體生長方法檢測重組蛋白CTL-ACT 及CTL-ATT 對溶藻弧菌的抑制作用。將溶藻弧菌在TSB液體培養基中培養過夜, 將菌液用TSB 稀釋濃度至OD550為0.001 左右, 在96 孔細胞培養板中分別加入50 μL 菌液和 50 μL 梯度稀釋的重組目的蛋白(64 μg/mL 倍比稀釋至 2 μg/mL); 陰性對照組為50 μL 菌液和50 μL BSA (64 μg/mL)的混合溶液; 陽性對照組為50 μL 菌液和50 μL Kana (64 μg/mL)的混合溶液?？傮w積為100 μL, 每個濃度設置3 個重復;將培養板置30 °C、100 r/min 的搖床培養, 分別在0、1、2、4、6、8、10、12、24 h, 將細胞板置酶標儀測定OD550值。

1.9 兩種重組蛋白與溶藻弧菌的結合活性

本實驗以篩選CTL SNP 的溶藻弧菌作為所用的包被菌, 將菌株培養到OD600為1.0 左右, 并用包被液重懸使其終濃度為5×108個/mL。按100 μL/孔將菌液加入96 孔酶標板, 4 °C 孵育過夜, PBST 洗滌3 次,3～5 min/次; 然后每孔加入200 μL 含3% BSA 的PBS,37 °C 封閉3 h, 同上洗滌; 各孔加入不同濃度的重組蛋白CTL-ACT 及CTL-ATT (16 μg/mL 倍比稀釋至0.5 μg/mL) 100 μL, PBS 作為陰性對照, 30 °C 孵育2 h,同上洗滌; 每孔加入100 μL 一抗His-tag 抗體(1︰1 000,V/V), 37 °C 溫育1 h, 同上洗滌; 再加入100 μL辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L) (1︰250,V/V), 37 °C 溫育1 h, 同上洗滌; 每孔加入200 μL TMB 顯色液, 避光孵育10～30 min, 然后每孔加入50 μL 2 mol/L 硫酸溶液中止反應, 于450 nm 測定吸光度, 當樣品OD450值/陰性對照OD450值≥2 時判定為陽性。

1.10 兩種重組蛋白與細菌PAMP 的結合活性研究

參考Wang 等(2016)的方法略作修改, 目的是用ELISA 方法測定兩種重組蛋白與病原相關分子模式PAMPs 結合活性的差異。所用的PAMPs 有脂多糖、菌肽聚糖、葡聚糖 G 及脂磷壁酸。用包被液將各PAMP 稀釋至200 μg/mL, 按100 μL/孔將菌液加入96孔酶標板, 4 °C 孵育過夜; 配制含0.5 mL/L Tween20的PBS 即PBST 洗液, 滿孔加液洗滌, 每次3～5 min,共洗滌3 次; 然后每孔加入200 μL 含3% BSA 的PBS,置于37 °C 水浴鍋封閉3 h, 同上洗滌; 加入不同濃度的重組蛋白CTL-ACT 和CTL-ATT (64 μg/mL 倍比稀釋至2 μg/mL) 100 μL, PBS 作為陰性對照, 30 °C 孵育2 h, 同上洗滌; 后續步驟同1.8。

2 結果與分析

2.1 溶藻弧菌感染后不同基因型三疣梭子蟹的死亡率

通過HRM 分析對300 只三疣梭子蟹進行了基因分型(表1), 結果顯示C/T 基因型共140 只, 占46.7%;T/T 基因型共49 只, 占16.3%; C/C 基因型共111 只,占37%。不同基因型梭子蟹感染溶藻弧菌后的死亡情況(表1, 圖1), C/T、T/T 和C/C 基因型梭子蟹的累積死亡率分別為81.4%、57.1%和82%, 結果表明T/T基因型三疣梭子蟹的累積死亡率極顯著低于其他基因型(P=0.001)。

圖1 CTL SNP E4-205 C/T 位點不同基因型梭子蟹感染溶藻弧菌的死亡率Fig.1 Cumulative mortality of swimming crabs expressing SNP genotypes at the CTL E4-205 locus upon V. alginolyticus infection

表1 三種基因型在E4-205 位點的分布及感染溶藻弧菌后的死亡率Tab.1 Distribution of the three genotypes at the E4-205 locus, and its mortality after infected with V. alginolyticus

2.2 溶藻弧菌在不同基因型三疣梭子蟹體內的拷貝情況

根據各模板的熒光值變化規律自動生成溶藻弧菌的標準曲線, 標準曲線為Y= –3.691×lg(X)+41.36,其中Y為CT 值,X為起始模板的拷貝數, 相關系數為0.999, 說明在質粒模板濃度范圍內其線性關系較好,可以用于檢測分析溶藻弧菌的拷貝。按照建立的溶藻弧菌AQ-PCR 方法, 測定不同基因型三疣梭子蟹感染溶藻弧菌后不同時間肝胰腺和肌肉中溶藻弧菌的拷貝情況(見圖2)。發現肝胰腺中12 h 前T/T 組細菌拷貝數極顯著低于C/C 和C/T 組(P<0.01), 之后的時間內細菌拷貝數差異不明顯; 肌肉中3 h 時T/T 組細菌拷貝數極顯著低于C/C 和C/T 組(P<0.01), 6 h 時T/T組顯著低于C/C 和C/T 組(P<0.05), 12 h 時各組細菌拷貝數無顯著差異, 而24 h 時T/T 組細菌拷貝數極顯著低于C/C 和C/T 組(P<0.01), 且感染12 h 之后肌肉中的細菌拷貝數明顯高于肝胰腺。結果表明三疣梭子蟹CTL 基因SNP 位點E4-205 C/T 的變異與其體內溶藻弧菌的復制存在相關性, 存在于T/T 基因型梭子蟹肌肉組織中或肝胰腺組織中的細菌拷貝數在一定時間內均顯著低于其他基因型。

圖2 三疣梭子蟹不同基因型肝胰腺、肌肉組織中的溶藻弧菌拷貝數Fig.2 Copies of V.alginolyticus in different genotype P.trituberculatus infected by V.alginolyticus

2.3 重組蛋白CTL-ACT 及CTL-ATT 的表達、純化及鑒定

成功構建原核表達質粒 PET-30a/CTL-ACT、PET-30a/CTL-ATT 并進行重組表達。陽性重組菌經IPTG 誘導表達后, 利用SDS-PAGE 檢測重組蛋白CTL-ACT 和CTL-ATT 的表達。結果表明, 兩個蛋白在37 °C 誘導4 h 時后以包涵體形式存在, 蛋白分子量約為17.6 kDa (如圖3)。以BSA 為標準的Bradford法測定純化的目的蛋白得率約為CTL-ACT 0.8 mg/L,CTL-ATT 0.6 mg/L。

圖3 SDS-PAGE 鑒定目的蛋白純化Fig.3 Purification of the target fusion protein

對純化蛋白譜帶進行膠內酶解及MALDI- TOF/TOF 質譜分析鑒定(見圖4), 結果表明所切下的兩種重組蛋白有多個肽段與三疣梭子蟹C 型凝集素PtLP的氨基酸序列完全匹配(GenBank 登錄號ACC86854.1),由此可以判定, 上述蛋白條帶即為重組表達的目的蛋白, 兩個差異蛋白成功獲得了體外重組包涵體表達, 可用于后續實驗研究。

2.4 重組蛋白的凝集活性分析

按照常規方法分別測定了兩種重組蛋白對小鼠紅細胞及相關細菌的凝集活性, 結果表明兩者均有凝集小鼠紅細胞的活性, 且CTL-ATT 比CTL-ACT 活性稍強, 但兩者凝集效價均較低, 僅為21(見圖5)。檢測兩種重組蛋對金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌以及酵母菌的凝集作用, 結果表明即使在一定Ca2+存在的條件下, 兩種重組蛋白均不能凝集任何一種細菌, 呈現的溶藻弧菌凝集見圖6。

圖5 兩種重組蛋白小鼠紅細胞凝集活性Fig.5 Hemagglutinating activity of two kinds of recombinant proteins

圖6 兩種重組蛋白對溶藻弧菌的凝集活性(400×)Fig.6 The agglutination activity of V. alginolyticus induced by two kinds of recombinant proteins

2.5 重組蛋白的抑菌活性結果

利用酶標儀測定經作用的溶藻弧菌最佳吸光度OD550的吸光值, 繪制兩種重組蛋白以及 Kana 與BSA 對照均在64 μg/mL 濃度作用不同時間, 對溶藻弧菌生長抑制的作用曲線。結果如圖7, Kana 具有強烈的抑菌作用, 細菌吸光度保持在0.2 以下; 兩種重組蛋白和BSA 組在前4 h 內未見明顯的細菌吸光度增加, 從6 h 開始, 隨著細菌繁殖的增加吸光度逐漸增加;與BSA 對照組相比較, 兩種重組蛋白對細菌生長均具有一定的抑制作用, 且CTL-ATT 蛋白比CTL-ACT 蛋白具有更強的抑菌活性。應用SPSS 19.0 單因素方差分析各組在培養24 h 時的吸光值, 結果表明各組吸光值差異極顯著(P<0.01), 說明24 h 時CTL-ATT 蛋白的抗溶藻弧菌活性顯著高于CTL-ACT 蛋白。

圖7 兩種重組蛋白不同時間的抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of two kinds of recombinant proteins in different hours

2.6 重組蛋白的溶藻弧菌結合活性

用ELISA 方法檢測兩種重組蛋白與溶藻弧菌的結合活性(圖8), 發現隨著重組蛋白濃度的增加, 各組吸光值也隨之升高, 說明兩種重組蛋白與溶藻弧菌的結合也是濃度依賴性模式; 而在同樣濃度下,CTL-ATT 與溶藻弧菌的結合活性要高于CTL-ACT 與溶藻弧菌的結合活性。

圖8 兩種重組蛋白與溶藻弧菌的結合活性Fig.8 ELISA analysis of the binding activity between two kinds of recombinant proteins and V. alginolyticus

2.7 重組蛋白的PAMPs 結合活性

為了檢測兩種重組蛋白與病原相關分子模式PAMPs 的相互作用, 我們利用不同濃度的重組蛋白與脂多糖、肽聚糖、葡聚糖及脂磷壁酸進行孵育, 后進行ELISA 檢測。檢測結果見圖9, 發現CTL-ATT蛋白與四種PAMPs 的結合活性均高于CTL-ACT 蛋白, 兩個重組蛋白與四種PAMPs 結合強弱依次為LPS>GLU>LTA>PGN; 兩種重組蛋白與四種PAMPs的結合均具有濃度依賴性, 即隨著蛋白濃度的升高與PAMPs 結合活性更強。應用SPSS 19.0 中單樣本T檢驗分析兩種重組蛋白分別與各PAMP 結合的差異性, 結果表明均為差異極顯著(P<0.01), 說明CTL-ATT蛋白與四種PAMPs 的結合活性顯著高于CTL-ACT蛋白。

圖9 兩種重組蛋白與四種PAMPs 的結合活性Fig.9 ELISA analysis of the binding activity of two kinds of recombinant proteins and four kinds of PAMPs

3 討論

分子標記輔助選擇育種相較于與傳統選育, 具有準確、快速、不受環境條件干擾的優點(Dekkerset al, 2002; Masoudiet al, 2007)。但目前眾多的研究報道仍局限于分子標記的篩選, 而真正將其應用于標記輔助選擇育種并取得成功的例子仍較少, 主要原因是尚未弄清楚分子標記的作用機制。根據實驗室前期從三疣梭子蟹免疫基因 C-型凝集素中篩選到的SNP E4-205 C/T 位點, 本研究利用PCR-HRM 方法對三疣梭子蟹進行基因分型, 后以溶藻弧菌感染不同基因型的三疣梭子蟹, 探究不同基因型梭子蟹體內細菌復制的差異性, 以期初步闡明該抗病分子標記抗溶藻弧菌的作用機理。根據實驗結果, 溶藻弧菌感染后T/T 基因型組的三疣梭子蟹死亡率顯著低于C/T和C/C 基因型組; 可初步表明篩選的SNP E4-205 C/T位點與三疣梭子蟹抗病性存在一定關聯。進一步的AQ-PCR 分析結果表明, 溶藻弧菌感染后12 h 前T/T組三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉中的細菌拷貝數顯著低于C/C 和C/T 組, 12 h 之后肌肉中的細菌拷貝數明顯高于肝胰腺, 說明細菌已突破肝胰腺的免疫防線, 在肌肉中大量復制, 進而產生“肌肉乳化病”的癥狀(王國良等, 2006; 劉淇等, 2007)。同時也說明T/T 基因型梭子蟹抗溶藻弧菌的能力明顯高于另外兩個基因型,可與三疣梭子蟹死亡情況相佐證。以上研究表明從三疣梭子蟹CTL 基因中篩選出的SNP E4-205 C/T 位點與抗溶藻弧菌相關, 初步說明可應用于三疣梭子蟹分子標記輔助選擇育種工作。

為了進一步闡明易感及抗性基因型梭子蟹抗溶藻弧菌的差異性, 對該位點非同義突變(ACT-ATT)導致的一個氨基酸改變(Thr-Ile)的兩種蛋白進行了體外重組表達與純化, 并對兩種重組蛋白進行活性分析。凝集活性結果表明, 兩者均有較弱的凝集小鼠紅細胞的活性, 且CTL-ATT 比CTL-ACT 活性稍強, 但不能凝集所測定的任何一種細菌。這與已報道的一些C-型凝集素不同, 例如中華絨螯蟹重組C-型凝集素EsCTLDcp、EsCTL1、EsCTL2 能夠凝集G+菌金黃色葡萄球菌S.aureus, G-菌嗜水氣單胞菌A.hydrophila以及副溶血弧菌V.parahaemolyticus(Huanget al,2014a); 中國對蝦的 FcLec2、FcLec4, 日本對蝦的PjLec, 南美白對蝦的LvLec 等均能夠凝集一種或多種細菌(Wanget al, 2009b; Zhanget al, 2009)。這可能與該包涵體表達蛋白純化復性時活性丟失, 或者該蛋白本身就不具有體外凝集細菌的活性有關。此外,兩種重組蛋白對溶藻弧菌的生長均具有一定抑制作用, 其具有濃度依賴性, CTL-ATT 蛋白比CTL-ACT蛋白的抑菌活性更強。這一結果從體外證明了三疣梭子蟹CTL 抗感染能力及T/T 基因型可作為抗病品系篩選的分子標記。

C-型凝集素作為一類模式識別受體, 主要是通過對微生物表面糖類的識別即病原相關分子模式PAMP 而參與先天免疫, 有關的研究在蝦蟹C-型凝集素已有許多報道(Guoet al, 2011; Zhanget al, 2013;Huanget al, 2014b)。本研究中, 我們分別使用不同濃度的兩種重組蛋白與LPS、PGN、GLU 及LTA 進行孵育, 然后進行ELISA 檢測, 結果表明, 兩種重組蛋白均能夠結合不同的 PAMPs, 結合強弱依次為LPS>GLU>LTA>PGN, 這種廣譜的結合活性說明三疣梭子蟹CTL 在抵抗多種病原微生物中發揮重要的免疫作用。就濃度依賴性來看, 兩種重組蛋白與四種PAMPs 的結合均具有濃度依賴性, 即它們與PAMPs的結合活性隨著蛋白濃度的升高而更強。但同濃度的CTL-ATT 與四種 PAMPs 的結合活性均高于CTL-ACT 與相應PAMPs 的結合。進而ELISA 方法測定了兩種重組蛋白與溶藻弧菌的結合活性, 結果表明兩者的結合活性同樣具有濃度依賴性, 且同濃度下CTL-ATT 的結合活性要高于CTL-ACT, 該結果表明SNP E4-205 C/T 位點非同義突變改變了編碼蛋白的生物學功能, 增強了機體抗感染的能力, 因此更進一步證明了T/T 基因型與抗溶藻弧菌的相關性。上述研究結果將為SNP E4-205 C/T 標記的輔助選擇應用, 加速三疣梭子蟹抗病品系育種進程提供有力的科學依據, 同時將對其他水產動物抗病分子標記的機制研究提供有用的借鑒手段。

4 結論

本研究對三疣梭子蟹C-型凝集素即CTL 基因SNP E4-205 C/T 位點非同義突變(ACT-ATT)導致的一個氨基酸改變(Thr-Ile)的兩種蛋白進行了體外重組表達與純化, 并從體內外研究了CTL 的T/T 基因型梭子蟹在抗溶藻弧菌感染中的作用, 結果表明T/T 基因型三疣梭子蟹抗感染能力明顯優于C/C 基因型, 該結果為選擇T/T 基因型作為抗溶藻弧菌的分子標記培育三疣梭子蟹抗病品系提供了科學依據。