吳茱萸堿衍生物血管舒張活性評價及分子對接模擬研究

周 靜,高冬梅,張玫倩,高宇飛,聶禮飛,王 婷,王 川*

(1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院,陜西 咸陽 712046;2.楊凌職業(yè)技術學院藥物與化工系,陜西 楊凌 712100;3.陜西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,陜西 咸陽 712046;4.中國科學院新疆理化技術研究所,新疆 烏魯木齊 830011)

吳茱萸,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,為蕓香科植物吳茱萸及其變種石虎和疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實。吳茱萸苦辛,性溫熱,是一種應用廣泛的傳統(tǒng)中藥,更是溫中散寒、疏肝止痛常用藥[1]。目前,從吳茱萸中已分離得到20多種生物堿,其中,吳茱萸堿(evodiamine)是一種喹唑啉并咔啉類生物堿[2],具有廣泛的生物學活性,如促兒茶酚胺分泌[3]、抗炎[4]、鎮(zhèn)痛[5]、抗腫瘤[6]、調(diào)節(jié)體溫、收縮子宮[7]、舒張血管[8]等。但是,吳茱萸堿具有一定的細胞毒性,限制了其在藥學領域的應用。因此,通過結構修飾或改造,發(fā)展毒性低、藥效高的吳茱萸堿衍生物具有重要意義。

網(wǎng)絡藥理學融合了系統(tǒng)生物學、生物信息學、計算機網(wǎng)絡分析技術等,可以揭示藥物活性成分與疾病之間的相互關系[9];分子對接是通過受體特征研究蛋白受體與配體結合模式的強有力工具。為了尋找藥理作用更廣泛、活性更高、毒性更低的吳茱萸堿衍生物,基于噻吩結構存在于很多具有重要生理活性的藥物分子中[10],作者所在研究團隊[11]合成了6個含噻吩環(huán)的吳茱萸堿衍生物5a～5f(圖1)。在此,作者基于網(wǎng)絡藥理學,采用分子對接方法對衍生物5a～5f的血管舒張活性及細胞毒性進行研究,并對舒張血管作用機制進行探究,以期為治療高血壓提供理論依據(jù)。

圖1 吳茱萸堿衍生物的合成路線

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

SPF級雄性SD大鼠,質(zhì)量(200±20) g,6～8周齡,由西安交通大學實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)(使用)許可證號:SCXK(陜)2020-030。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學中藥藥理實驗室,室溫(23±2) ℃,光照周期12 h,飼養(yǎng)期間自由進食飲水。

GK10001型CCK-8試劑盒,GLPBIO;吳茱萸堿(純度≥98%,批號A-JA285),上海賢鼎生物科技有限公司;苯腎上腺素(PE,純度≥99%,批號84614),西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司;其它試劑均為市售分析純。

X-4型顯微熔點測定儀(溫度計未經(jīng)校正),北京泰克儀器有限公司;Bruker ARX-400/600型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標),瑞士Bruker公司;MP500Z型分析天平,上海恒平科學儀器有限公司;SZCL-4型數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器、電熱恒溫鼓風干燥箱,鞏義予華儀器有限公司;RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,西安予輝儀器有限公司;CODA型動物無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng),美國 Kent 公司;DMT 630M型離體微血管張力測定系統(tǒng),丹麥DMT公司;CO2培養(yǎng)箱,美國Thermo Fisher Scientific公司;肌張力描記記錄系統(tǒng),澳大利亞ADI公司;解剖顯微鏡,日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 血管環(huán)實驗

大鼠動脈血管環(huán)的制備:SD大鼠斷頸處死,無菌條件下迅速分離出大鼠腸系膜,浸泡于經(jīng)過濾除菌并預冷的Na+-PSS緩沖溶液(119 mmol·L-1NaCl、15 mmol·L-1NaHCO3、4.6 mmol·L-1KCl、1.2 mmol·L-1MgCl2、1.2 mmol·L-1NaH2PO4、1.5 mmol·L-1CaCl2和5.5 mmol·L-1葡萄糖)中,于解剖顯微鏡下分離出腸系膜動脈。將5 mL Na+-PSS緩沖溶液加入恒溫離體浴槽內(nèi),并將含95%O2和5%CO2的混合氣體不斷通入浴槽內(nèi);將分離的腸系膜動脈穿入2根20 μm的金屬絲,其中1根金屬絲與可調(diào)節(jié)預張力的張力微調(diào)裝置相連,另1根連接張力換能器。固定好的血管環(huán)平衡40 min后,每15 min施加0.5 mN的預張力,直至2 mN,加入60 mmol·L-1K+-PSS緩沖溶液檢驗血管環(huán)收縮活性,若血管環(huán)在2次K+-PSS緩沖溶液中的收縮幅度均大于5 mN并且2次收縮差低于10%時,可將該血管環(huán)用于后續(xù)實驗。

血管環(huán)給予10 μmol·L-1苯腎上腺素預收縮,待收縮穩(wěn)定后,加入梯度濃度(10-10～10-6.5mol·L-1)的吳茱萸堿及其衍生物5a～5f,使用離體微血管張力測定系統(tǒng)記錄血管張力,繪制血管張力變化曲線,研究吳茱萸堿衍生物對大鼠血管舒張功能的影響。

1.2.2 CCK-8細胞增殖實驗

溶液配制:精密稱取吳茱萸堿及其衍生物5a～5f,用DMSO配制成200 μmol·L-1母液,再用DMSO稀釋成濃度(μmol·L-1)分別為1、3、10、30、50、100的吳茱萸堿及其衍生物5a～5f溶液。同法配制各濃度順鉑溶液。

取對數(shù)生長期的肝癌細胞HepG2,用胰酶消化,收集細胞,1 000 r·min-1離心,棄上清,加入新鮮培養(yǎng)液重懸細胞;計數(shù),調(diào)整細胞密度至2.5×104個·mL-1,吸取200 μL細胞懸液加入96孔板中,使每孔細胞為5×103個,并設置空白組、對照組、陽性對照組(順鉑)和溶劑對照組,每組設置6個復孔,置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h;次日,將培養(yǎng)液更換為含不同濃度(1、3、10、30、50,μmol·L-1)吳茱萸堿及其衍生物5a～5f的培養(yǎng)液,空白組、對照組更換新鮮培養(yǎng)液,陽性對照組更換為含不同濃度(1、3、10、30、50,μmol·L-1)順鉑的培養(yǎng)液,溶劑對照組加入1 μL的DMSO,分別置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h;每孔加入10 μL的CCK-8溶液,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2.5 h;用酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔溶液在450 nm處吸光度(A),計算每組吸光度平均值,按式(1)計算抑制率(%):

(1)

1.2.3 內(nèi)皮細胞毒性實驗

細胞培養(yǎng):人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC用含有20%胎牛血清、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC,用胰酶消化,收集細胞,1 000 r·min-1離心,棄上清,加入新鮮培養(yǎng)液重懸細胞;計數(shù),調(diào)整細胞密度至1×105個·mL-1,吸取100 μL細胞懸液加入96孔板中,使每孔細胞為1×104個,并設置空白組、對照組,每組設置6個復孔,置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h:次日,將培養(yǎng)液更換為含不同濃度(1、10、30、50、100,μmol·L-1)吳茱萸堿及其衍生物的培養(yǎng)液,空白組、對照組更換新鮮培養(yǎng)液,分別置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h;每孔加入15 μL濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h;小心吸盡各孔培養(yǎng)液,加入100 μL的DMSO,使結晶物充分溶解;用酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔溶液在490 nm處吸光度,計算每組吸光度平均值,按式(1)計算抑制率(%),按式(2)計算存活率(%):

存活率=100%―抑制率

(2)

1.2.4 吳茱萸堿與高血壓靶點的搜索

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)搜索吳茱萸堿的相關靶點。以“hypertension”為關鍵詞,使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)搜索高血壓的相關靶點。

1.2.5 分子對接模擬研究

為了研究吳茱萸堿衍生物舒張血管作用機制并且驗證配體-受體結合情況,選取吳茱萸堿與高血壓密切相關的5個靶點:凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ)、5-羥色胺受體3A(5-hydroxytryptamine receptor 3A)、類固醇受體輔激活劑1(steroid receptor coactivator 1,SRC-1)、雄激素受體(androgen receptor)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric-oxide synthase,eNOS),進行分子對接。在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)中,選取相應的晶體結構(PDB ID:4ZXX[12]、6W1M[13]、5Y7W[14]、2AXA[15]、3NOS[16])作為蛋白靶點進行研究。

使用AutoDock 4.2軟件進行分子對接研究。選取具有顯著生物活性的吳茱萸堿衍生物作為配體與5個關聯(lián)靶點進行分子對接,使用ChemDraw Ultra 19.0進行三維定向繪制和優(yōu)化,并使配體能量最小化,能量最小化后的配體用于分子對接研究;使用PyMOL軟件對配體-關聯(lián)靶點相互作用進行可視化分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果與討論

2.1 吳茱萸堿衍生物的血管舒張活性

吳茱萸堿及其衍生物5a～5f對大鼠腸系膜動脈血管的舒張作用如圖2所示。

圖2 吳茱萸堿及其衍生物5a～5f對大鼠腸系膜動脈血管的舒張作用

由圖2可知,吳茱萸堿及其衍生物5a～5f均對苯腎上腺素預收縮的大鼠腸系膜動脈血管具有舒張作用,其中吳茱萸堿衍生物5a的舒張作用最強。經(jīng)擬合,吳茱萸堿及其衍生物5a～5f的logEC50值分別為-7.883、-8.387、-8.363、-8.383、-8.316、-8.047、-7.903。

2.2 吳茱萸堿衍生物對肝癌細胞的抑制率

通過CCK-8細胞增殖實驗,測定給予不同濃度的吳茱萸堿及其衍生物5a～5f時肝癌細胞的抑制率,結果見表1。

表1 給予不同濃度的吳茱萸堿及其衍生物5a～5f時肝癌細胞的抑制率

由表1可知,隨著吳茱萸堿及其衍生物5a～5f濃度的增加,其對肝癌細胞的抑制率逐漸升高;在濃度為50 μmol·L-1時,與吳茱萸堿比較,衍生物5a對肝癌細胞的抑制率下降最多,衍生物5c稍微下降,衍生物5d、5e、5f略微升高,衍生物5b升幅最大。表明衍生物5a、5c對肝癌細胞的細胞毒性有所降低,衍生物5d、5e、5f略高,衍生物5b最高。

2.3 吳茱萸堿衍生物對內(nèi)皮細胞的損傷

通過內(nèi)皮細胞毒性實驗,測定給予不同濃度的吳茱萸堿及其衍生物5a時人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC的存活率,結果見表2。

表2 給予不同濃度的吳茱萸堿及其衍生物5a時人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC的存活率

由表2可知,隨著吳茱萸堿及其衍生物5a濃度的增加,人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC的存活率逐漸降低;同濃度下,給予衍生物5a時內(nèi)皮細胞的存活率均高于給予吳茱萸堿時的。表明衍生物5a對內(nèi)皮細胞的損傷較吳茱萸堿小。

2.4 吳茱萸堿與高血壓的關聯(lián)靶點

TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索顯示吳茱萸堿的相關靶點有21個,GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索顯示高血壓的相關靶點有10 517個,二者關聯(lián)靶點有5個:凝血因子Ⅶ、5-羥色胺受體3A、SRC-1、雄激素受體、eNOS。

凝血因子Ⅶ是外源性凝血途徑的唯一啟動因子,它在血栓形成過程中起關鍵作用,與心血管疾病有密切關系[17]。5-羥色胺可以通過5-羥色胺受體介導血管內(nèi)皮功能障礙,造成血管收縮、血管平滑肌細胞增殖與遷移等過程,促進心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[18];5-羥色胺受體3A是其中的一個亞科,向大鼠靜脈注射其受體激動劑會引起血壓明顯升高[19]。SRC-1協(xié)同相關基因共同促進血管緊張素Ⅱ誘導的炎癥性細胞因子(IL-6)的分泌,在高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的機體代償機制中發(fā)揮重要作用[20]。雄激素受體是核受體家族的一員,是心血管系統(tǒng)的危險因子,可促進高血壓的發(fā)生[21]。NO在血管張力調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關重要的作用,而NO在內(nèi)皮細胞上的合成受eNOS調(diào)控[22]。

2.5 分子對接結果

以血管舒張活性最強的吳茱萸堿衍生物5a為配體,分別與5個關聯(lián)靶點凝血因子Ⅶ、5-羥色胺受體3A、SRC-1、雄激素受體、eNOS對接,結果見表3。

表3 分子對接結果

由表3可知,吳茱萸堿衍生物5a與5個關聯(lián)靶點的結合能均較高,可以通過氫鍵、疏水作用和碳氫相互作用等多種方式進行對接。吳茱萸堿衍生物5a與凝血因子Ⅶ通過Gly216H、Ser190H形成氫鍵,對接良好;吳茱萸堿衍生物5a與5-羥色胺受體3A通過Asn101B形成氫鍵,與Trp156B產(chǎn)生π-σ相互作用,而且衍生物5a可深入5-羥色胺受體3A的口袋,對接良好;吳茱萸堿衍生物5a與SRC-1通過Gln301A形成氫鍵,與Tyr297A產(chǎn)生π-π堆積作用,對接良好;吳茱萸堿衍生物5a與雄激素受體通過Val685A形成氫鍵,與Arg752A產(chǎn)生π-正離子相互作用,對接良好;吳茱萸堿衍生物5a與eNOS通過Trp447A形成氫鍵,與Trp447A、Phe460B產(chǎn)生π-π堆積作用,對接良好。其相互作用模式如圖3所示。

圖3 吳茱萸堿衍生物5a與5個關聯(lián)靶點的相互作用模式

由圖3可知,噻吩環(huán)的存在對吳茱萸堿衍生物5a與5個關聯(lián)靶點之間的碳氫相互作用有很大的影響,噻吩環(huán)并的六元環(huán)醚上氧原子的存在對氫鍵的形成起到了關鍵作用。表明這類吳茱萸堿衍生物舒張血管的作用機制可能是多靶點共同作用。

3 結論

簡單高效合成了6個含噻吩結構的吳茱萸堿衍生物5a～5f,它們均對苯腎上腺素預收縮的大鼠腸系膜動脈血管具有舒張作用,其中衍生物5a的血管舒張活性較吳茱萸堿高。在濃度為50 μmol·L-1時,與吳茱萸堿相比,衍生物5a、5c對肝癌細胞的細胞毒性有所降低,衍生物5d、5e、5f略高,衍生物5b最高。衍生物5a對內(nèi)皮細胞HUVEC的損傷較吳茱萸堿略小。衍生物5a與5個關聯(lián)靶點的結合能均較高,可以通過氫鍵、疏水作用和碳氫相互作用等多種方式進行對接。含噻吩結構的吳茱萸堿衍生物舒張血管的作用機制可能是多靶點共同作用,具有進一步研究的意義。