響應面法優化甜茶苷的超聲提取工藝

劉 英,郭洋洋,徐永莉,張貞發,韋 瑩,馮世鑫,閆志剛*

(1.廣西民族師范學院,廣西 崇左 532200;2.廣西壯族自治區藥用植物園,廣西 南寧 530023)

甜茶(RubussuavissimusS. Lee)為薔薇科多年生灌木,是廣西特有的天然甜味植物,具有“茶、糖、藥”3種身份[1-2]。甜茶中富含甜茶苷、茶多酚、黃酮等化學成分及多種微量元素[3],具有降血糖、降血脂、降血壓、抗過敏、抗氧化、防癌、抗癌、護肝等藥理作用[4],同時具有生津止渴、潤肺祛痰、清熱降火等多重功效。甜茶苷是甜茶中特有的有效成分,具有降血糖[5-6]、降血壓、治療胃酸過多以及促進新陳代謝等作用。作者在此以甜茶苷提取率為評價指標,在單因素實驗的基礎上,采用響應面法[7-8]對甜茶苷的超聲提取工藝進行優化,以期為甜茶苷的進一步開發利用提供幫助。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

甜茶葉,采自廣西荔浦縣,烘干粉碎后備用。

甜茶苷對照品,成都曼思特生物科技有限公司;甲醇(色譜純),西隴科學股份有限公司;無水乙醇(分析純),成都科隆化學品有限公司。

Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀,美國安捷倫公司;FW177型中草藥粉碎機,天津儀器有限公司;EL204型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 標準曲線的繪制

準確稱取0.010 0 g甜茶苷對照品,用少量甲醇溶解,轉移到10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到1 mg·mL-1甜茶苷標準溶液。準確吸取甜茶苷標準溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,并用甲醇定容至刻度,搖勻,得到質量濃度分別為0.01 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1的甜茶苷溶液,用0.45 μm微孔濾膜過濾,待用。分別吸取各濃度甜茶苷溶液20 μL,在210 nm波長處進行高效液相色譜分析,記錄峰面積(n=5)。以峰面積(y)為縱坐標、甜茶苷溶液濃度(c,mg·mL-1)為橫坐標,繪制標準曲線,擬合得到甜茶苷線性回歸方程為:y=4775.7c+75.1(R=0.9998)。表明甜茶苷濃度在0.01～0.4 mg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

1.3 甜茶苷的提取

精準稱量1.000 0 g甜茶葉粉末,按一定料液比加入一定體積分數的乙醇,在一定溫度下超聲提取一定時間,得到甜茶苷提取液。按1.2方法進行高效液相色譜分析,記錄峰面積,依據標準曲線方程計算甜茶苷濃度,進而計算甜茶苷提取率。

1.4 提取工藝的優化

以甜茶苷提取率為評價指標,采用單因素實驗分別考察乙醇體積分數(20%、40%、60%、80%、100%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50,g∶mL,下同)、超聲溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)和超聲時間(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)對甜茶苷提取率的影響;在單因素實驗的基礎上,以乙醇體積分數、料液比、超聲溫度、超聲時間為考察因素,以甜茶苷提取率為評價指標,通過Box-Behnken[9-12]設計4因素3水平響應面實驗,優化甜茶苷超聲提取工藝。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對甜茶苷提取率的影響(圖1)

圖1 乙醇體積分數對甜茶苷提取率的影響

由圖1可知,隨著乙醇體積分數的增加,甜茶苷提取率先升高后降低;在乙醇體積分數為40%時,提取率達到最高。這是因為,隨著乙醇體積分數的增加,甜茶苷溶出量逐漸增加,提取率相應升高;但乙醇體積分數超過40%后,除了溶出甜茶苷外,能溶于乙醇的雜質也逐漸增多,單位體積內的甜茶苷提取率反而降低。因此,乙醇體積分數以40%較為適宜。

2.1.2 料液比對甜茶苷提取率的影響(圖2)

圖2 料液比對甜茶苷提取率的影響

由圖2可知,隨著料液比的減小,即提取溶劑用量的增加,甜茶苷提取率先升高后降低;在料液比為1∶30時,提取率達到最高。這是因為,甜茶苷的提取是一個濃度差為推動力的過程,剛開始時濃度差隨料液比的減小而增大,提取率相應升高;當料液比為1∶30時,甜茶苷從甜茶葉細胞中的溶出速率達到最大,提取率達到最高;繼續增加溶劑用量,一方面會稀釋甜茶苷,另一方面會有更多的色素及其它雜質溶出,導致提取率下降。因此,料液比以1∶30較為適宜。

2.1.3 超聲溫度對甜茶苷提取率的影響(圖3)

由圖3可知,隨著超聲溫度的升高,甜茶苷提取率先升高后降低;在超聲溫度為60 ℃時,提取率達到最高。這是因為,超聲波能夠破碎植物細胞,升高超聲溫度,甜茶苷從甜茶葉中的溶出速率相應加快,提取率升高;當超聲溫度超過60 ℃時,雜質溶出量增加,導致提取率下降。因此,超聲溫度以60 ℃較為適宜。

2.1.4 超聲時間對甜茶苷提取率的影響(圖4)

由圖4可知,隨著超聲時間的延長,甜茶苷提取率先升高后降低;在超聲時間為30 min時,提取率達到最高。這是因為,甜茶苷的提取是一個傳質過程,30 min前甜茶葉中的甜茶苷溶出不完全,延長超聲時間,傳質量增加,提取率顯著升高;30 min后,甜茶苷溶出速率降低,溶劑中的甜茶苷濃度增加不明顯,最終穩定而達到動態平衡,同時延長超聲時間,也可能溶出更多的雜質,導致甜茶苷提取率下降。因此,超聲時間以30 min較為適宜。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 實驗設計與回歸模型

在單因素實驗的基礎上,以甜茶苷提取率為評價指標,分別以40%、1∶30、60 ℃、30 min作為響應面實驗中乙醇體積分數、料液比、超聲溫度、超聲時間的中心值,通過Box-Behnken設計4因素3水平響應面實驗,結果見表1。

表1 響應面實驗結果

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表1數據進行線性回歸分析與擬合[13],得到甜茶苷提取率數學模型:Y=-63.06+0.59A+0.98B+1.12C+0.49D+0.00145AB-0.0038AC-0.0026AD+0.00295BC+0.00075BD-0.0026CD-0.004383A2-0.021B2-0.008008C2-0.004258D2。可以看出,各因素對甜茶苷提取率的影響順序為:超聲溫度(C)>料液比(B)>乙醇體積分數(A)>超聲時間(D),乙醇體積分數和超聲溫度的交互作用(AC)對甜茶苷提取率的影響最大。

2.2.2 方差分析

對擬合的數學模型進行方差分析,結果見表2。

表2 方差分析

由表2可知,該模型極顯著(P<0.01),模型的R2=0.9732,自變量與響應值關系顯著;失擬項P=0.3249>0.1,表明失擬項在α=0.1水平上不顯著,此模型與實際值的擬合度較高;一次項中,乙醇體積分數(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)和超聲時間(D)對甜茶苷提取率的影響極顯著(P<0.01);交互項中,乙醇體積分數與超聲溫度的交互作用(AC)、乙醇體積分數與超聲時間的交互作用(AD)對甜茶苷提取率的影響極顯著(P<0.01),料液比與超聲溫度的交互作用(BC)對甜茶苷提取率的影響顯著(P<0.05),乙醇體積分數與料液比的交互作用(AB)對甜茶苷提取率的影響不顯著(P>0.05);二次項中,A2、B2、C2、D2對甜茶苷提取率的影響極顯著(P<0.01)。

2.2.3 響應面分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行處理[14-15],得到各因素交互作用對甜茶苷提取率影響的響應面圖,結果如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對甜茶苷提取率影響的響應面圖

圖5a、e的響應曲面坡度較平緩,表明乙醇體積分數與料液比的交互作用、料液比與超聲時間的交互作用對甜茶苷提取率的影響不顯著。圖5b、c、f的響應曲面坡度較大,表明乙醇體積分數與超聲溫度的交互作用、乙醇體積分數與超聲時間的交互作用、超聲溫度與超聲時間的交互作用對甜茶苷提取率的影響極顯著。圖5d的響應曲面坡度適中,表明料液比與超聲溫度的交互作用對甜茶苷提取率的影響顯著。使用Design-Expert 8.0.6軟件對模型進行分析與處理,得到甜茶苷最優提取工藝條件為:乙醇體積分數35.93%、料液比1∶29.41、超聲溫度61.64 ℃、超聲時間30.68 min,在此條件下,甜茶苷提取率達到3.88%。為提高實驗的可操作性,將最優條件修正為:乙醇體積分數36%、料液比1∶30、超聲溫度62 ℃、超聲時間30 min。

2.3 驗證實驗

在上述最優條件下,進行3次驗證實驗,其HPLC圖譜如圖6所示。

圖6 對照品溶液(a、b)和供試品溶液(c、d、e)的HPLC圖譜

由圖6可知,3次驗證實驗得到的甜茶苷提取率分別為3.62%、3.88%、3.36%,平均值為3.62%,與理論值(3.88%)較為接近。表明優化的提取工藝較為可靠。

3 結論

在單因素實驗的基礎上,采用響應面法優化甜茶苷的超聲提取工藝。得到最優提取工藝為:乙醇體積分數36%、料液比1∶30(g∶mL)、超聲溫度62 ℃、超聲時間30 min,在此條件下,甜茶苷平均提取率為3.62%,與預測值(3.88%)僅相差0.26%。該優化提取工藝操作方便,結果可靠,為甜茶苷的進一步開發利用提供了依據。