219份茶樹資源1,2,6-三沒食子酰葡萄糖變異分析

荀涵碩，王留彬，張 睿，王麗鴛，韋 康

中國農業科學院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008

水解單寧1,2,6-三沒食子酰葡萄糖（1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose，1,2,6-TGGP）是一種多酚化合物，具有抗菌、消炎、抗氧化等作用[1-2]。然而目前對多酚類物質的研究主要集中在兒茶素類物質上，對1,2,6-TGGP的關注較少。茶是世界最受歡迎的飲料之一[3]，具有多種保健（藥理）功能[4]。茶葉中富含多酚類化合物，研究人員已從茶樹中鑒定到1,2,6-TGGP，但是茶葉中關于1,2,6-TGGP含量變異范圍的研究報道非常少。Zhang等[5]通過高效液相色譜結合二極管陣列和質譜檢測了16個茶樣（6個綠茶、6個烏龍茶和4個白茶），結果發現茶葉中1,2,6-TGGP含量非常低，在0～6.6 mg/g。Song等[6]通過高效液相色譜結合二極管陣列和質譜對13批龍井綠茶進行分析，也得到了類似的結果。Wei等[2]對17個茶樹品種進行1,2,6-TGGP含量測定，發現其變化范圍為1.96～43.20 mg/g。李強等[7]對‘中黃1號’‘中黃2號’‘白雞冠’與‘中白1號’進行1,2,6-TGGP含量測定，結果發現含量在0～0.24 mg/g。

茶樹種質資源是茶樹種質創新及品種遺傳改良的基礎[8-9]。目前對茶樹資源的分析多集中在水浸出物、兒茶素、氨基酸、咖啡堿等成分，尚無對1,2,6-TGGP優異資源鑒定與篩選的研究報道。本研究擬對219份茶樹資源進行1,2,6-TGGP含量測定，分析其變異特性并探尋其與兒茶素類物質的相關性，從而篩選出高1,2,6-TGGP優異茶樹資源，以期為高1,2,6-TGGP茶樹新品種選育及其形成機理研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以53份種植于中國農業科學院茶葉研究所茶園（N 30°19′、E 120°10′）的茶樹資源、166份種植于浙江省嵊州市中茶所嵊州實驗基地（N 30°15′、E 121°22′）的茶樹資源為材料。2019年、2020年和2021年3月在不同地塊采摘試驗茶樹資源一芽二葉鮮葉樣。具體樣品名稱見表1。其中編號1～21是杭州2019年樣品，22～32是杭州2020年樣品，33～53是杭州2021年樣品；編號54～110是嵊州2019年樣品，111～152是嵊州2020年樣品，153～219是嵊州2021年樣品。共計219份。

表1 219份茶樹資源名稱Table 1 The names of the 219 tea germplasms

1.2 主要儀器和試劑

儀器：Waters HPLC，Phenomenex色譜柱（Synergi 4 μ Polar-RP 80A, 4.6 mm×250 mm,5 μm）；UV-2550紫外可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；Waters alliance 2695-2498高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

試劑：甲醇、乙腈、甲酸（杭州碩科儀器設備有限公司），均為色譜純級；1,2,6-TGGP，由上海源葉生物科技有限公司提取；沒食子酸（GA）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG），上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸、EDTA（Disodiumethylendiaminetetrac etate，乙二胺四乙酸）鈉鹽。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線繪制

分別精密稱取1,2,6-TGGP、GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG標準品2.000 mg置于10 mL離心管中，加入70%甲醇（色譜純級）溶液2 mL超聲溶解，配成1 000 μg/mL的母液，再用70%甲醇溶液將對照品母液稀釋成系列梯度濃度的標準溶液，繪制標準曲線。利用標準曲線對各代謝物進行定量。

1.3.2 HPLC檢測

流動相A為1%甲酸水溶液，流動相B為100%乙腈。流速為1 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫40℃，進樣量10 μL。梯度洗脫程序詳見表2。

1.3.3 樣品制備

于2019、2020、2021年春季按一芽二葉的標準采摘鮮葉原料，置于電熱式碧螺春烘干機中120℃烘30 min左右，烘干至恒重。

1.3.4 茶多酚提取與鑒定

多酚類物質提取和鑒定在課題組前期建立的方法上略有改進：取茶樣0.1 g（0.999～0.100 3 g）精密稱定，置于10 mL離心管中，準確加70%甲醇溶液5 mL，于70℃水浴鍋水浴浸提20 min（每隔5 min上下搖動一次），待冷卻至室溫后轉入離心機（3500 r/min，10 min）。吸取0.5 mL上清液至5 mL離心管中，加2 mL穩定液（10 mg/mL EDTA-Na 2、10 mg/mL抗壞血酸、純乙腈、超純水的質量比或體積比為1∶1∶2∶16混勻，使用0.45 μm有機微孔濾膜過濾，取濾液到進樣瓶中，放至HPLC儀器中進行1,2,6-TGGP鑒定與含量測定。

1.3.5 數據處理

數據采用Excel 2108軟件進行整理，數據統計采用SPSS 24數據統計分析軟件進行統計分析。變異系數的計算公式為：變異系數=標準差/均值。

2 結果與分析

2.1 兒茶素組分含量

1,2,6-TGGP（峰9）含量的鑒定情況見圖1，1,2,6-TGGP含量較高（＞ 5.00 mg/g）的茶樹資源兒茶素組分及1,2,6-TGGP的具體含量測定結果見表3。

圖1 茶葉中主要成分液相色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatogram of the main components in tea

表3 1,2,6-TGGP含量較高的茶樹資源兒茶素及1,2,6-TGGP含量Table 3 Catechin and 1,2,6-TGGP content of tea germplasms with high content of 1,2,6-TGGP mg/g

對219份茶樹資源9個組分含量進行統計分析（表4）后發現，1,2,6-TGGP含量為0.34～53.63 mg/g，平均為9.53 mg/g；GA含量為0.16～1.32 mg/g，平均為0.48 mg/g；GC含量為0.46～7.88 mg/g，平均為2.00 mg/g；EGC含量為3.03～27.41 mg/g，平均為12.36 mg/g；C含量為0.47～22.72 mg/g，平均為2.16 mg/g；EC含量為2.96～13.86 mg/g，平均為7.07 mg/g；EGCG含量為12.25～114.10 mg/g，平均為67.39 mg/g；GCG含量為0.29～4.50 mg/g，平均為1.80 mg/g；ECG含量為3.46～53.87 mg/g，平均為25.24 mg/g。219份茶樹資源中9個成分變異系數從大到小排序為1,2,6-TGGP、C、GC、GA、GCG、EGC、ECG、EC、EGCG；變異系數最大的是1,2,6-TGGP，為101.45%。以上結果表明，219份茶樹資源表現出豐富的遺傳多樣性。

表4 219份茶樹資源9個組分含量統計Table 4 Content statistics of 9 components in 219 tea germplasms

對219份茶樹資源1,2,6-TGGP含量的分布進行分析（圖2）可以看到，1,2,6-TGGP含量低于1%的資源材料最多，有149份，占比68.03%；1%～3%的有57份，占比26.03%；高于3%的最少，有13份材料，分別是‘中茗6號’（5.36%）、‘中茗6號’（4.92%）、‘恩施5號’（4.20%）、‘中茗6號’（4.11%）、‘4201’（4.02%）、‘ESN-5’（4.02%）、‘中茗6號’（3.82%）、‘中茗66號’（3.57%）、‘1118’（3.41%）、‘Z9’（3.30%）、‘4511’（3.23%）、‘ESN-8’（3.21%）和‘0401’（3.12%），占比5.94%。其中1,2,6-TGGP含量最高的‘中茗6號’在不同年份、不同地點均有較高含量，說明該品種受環境影響較小。

圖2 219份茶樹資源的1,2,6-TGGP含量分布Figure 2 Distribution of 1,2,6-TGGP content in 219 tea germplasms

2.2 兒茶素各組分的相關性

對219份茶樹資源的9個組分進行相關性分析結果（表5）可看出，9個組分中有2/3的組分間存在顯著性的相關關系。除GC外，EC與所有的組分存在顯著性的相關關系，其中與EGC、C、EGCG、GCG、ECG呈極顯著正相關，與GA、1,2,6-TGGP呈極顯著負相關。除C外，1,2,6-TGGP也與所有的組分存在顯著性的相關關系，其中與GA、EGCG、ECG呈極顯著正相關，與GC、GCG呈顯著正相關，與EGC、EC呈極顯著負相關。1,2,6-TGGP與GA呈極顯著正相關，結果與Wei等[2]研究結果一致。

表5 219份茶樹資源生化成分含量相關性分析Table 5 Correlation analysis of the content of biochemical components in 219 tea germplasms

3 討論

茶多酚是茶樹中酚類物質及其衍生物的總稱。茶多酚包括兒茶素（黃烷醇類），黃酮、黃酮醇類，花青素、花白素類，酚酸及縮酚酸等，是茶葉的重要品質成分和構成茶湯滋味的主要物質[10]。目前大多數研究主要圍繞兒茶素類物質，很少有酚酸衍生物的報道。1,2,6-TGGP作為酚酸衍生物的一種，具有抗菌、消炎等作用。本研究測定了219份浙江杭州和嵊州茶樹資源中兒茶素和1,2,6-TGGP含量并對其進行了含量變異分析，結果發現9個組分的變異系數從大到小依次為1,2,6-TGGP、C、GC、GA、GCG、EGC、ECG、EC、EGCG，表明1,2,6-TGGP有巨大改良潛力。進而分析了1,2,6-TGGP的含量分布情況，從中篩選出13份高含量茶樹資源。最后分析了1,2,6-TGGP與兒茶素的相關性，發現與其呈極顯著正相關的GA、EGCG、ECG和呈極顯著負相的EGC、EC。

前期研究表明，1,2,6-TGGP是UDP葡萄糖和沒食子酸經過一系列嚴格位置的沒食子酰基化步驟合成的。具體過程為UDP葡萄糖先與第一個沒食子酸反應合成葡萄糖沒食子鞣甙（β-glucogallin），后者再與第二個沒食子酸反應合成1,6-二醛酰葡萄糖（1,6-digalloylglucose），1,6-二醛酰葡萄糖再與第三個沒食子酸反應合成1,2,6-TGGP[11]。本研究發現1,2,6-TGGP與沒食子酸有極顯著的相關關系，這與李強等[7]的研究結果一致。有趣的是，EGC和EC都與1,2,6-TGGP呈極顯著負相關，EGCG和ECG均與1,2,6-TGGP呈極顯著正相關，EGC和EC經過酰基化后可形成EGCG和ECG，而1,2,6-TGGP中存在三個酰基，可能可以充當酰基供體。初步推測這5種物質間可能存在某種相關性關系。可能的過程是1,2,6-TGGP給EGC提供沒食子酰基生成EGCG，給EC提供沒食子酰基生成ECG。但具體的反應過程需要進行深入研究。

綜上，我們篩選到富含1,2,6-TGGP的優異茶樹種質資源并且對1,2,6-TGGP的變異范圍、與兒茶素的相關性有了較為清晰的認識，這為后期1,2,6-TGGP合成機理研究及品種選育奠定了一定的基礎。