L-茶氨酸改善肝損傷功效及其作用機制研究進展

袁懿煒，張一帆，龔明秀，葉江成，趙 進*，葛 建

1.中國計量大學 生命科學學院 食品營養與質量安全研究所，浙江 杭州 310018；2.特色農產品品質與危害物控制技術浙江省重點實驗室，浙江 杭州 310018

肝損傷作為人類肝臟疾病發生初級階段，持續炎癥以及相應的再生反應會對機體造成損傷進而將可能發展成脂肪肝、肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌[1]。近年來，肝損傷給全球公共衛生帶來新的挑戰[2]，肝損傷的預防與治療的重要性和有效性已引起越來越多研究者關注[3]。

茶葉是世界三大飲料之一。L-茶氨酸（N-乙基-L-谷氨酰胺）是一種特殊的非編碼氨基酸，約占茶葉游離氨基酸總量的一半[4]。茶葉中的L-茶氨酸可以產生焦糖味和誘人的香氣，在口感上有助于緩解茶水中茶多酚的澀味和咖啡因的苦味[5]。茶葉及其相關功能成分具有抗炎[6]、保護神經[7]、抗凋亡[8]、降脂減肥[9]、免疫調節[10]及抗氧化[11]等多種功能。

L-茶氨酸具有很高的生物利用度。研究表明，L-茶氨酸通過Na非依賴性中性氨基酸系統L轉運途徑快速轉運[12]并在腸道吸收，然后在腸道和肝臟中分解為谷氨酸和乙胺，最后隨尿液排泄[13]。已有報道L-茶氨酸口服給藥后約30 min在血漿中達到最高濃度，然后在給藥后8 h其含量逐漸消除[14]。研究結果表明口服L-茶氨酸對試驗動物的行為、食物攝入、體重、死亡率、發病率、血液學指標、尿液參數和組織病理學特征無不良影響[15]。

1 肝損傷的產生因素及其代謝特征標志物

肝損傷的主要原因是外源性物質（如酒精、藥物、生物代謝產物）的持續影響，這些物質會誘發肝臟氧化應激與炎癥，導致一系列肝臟疾病的產生[16]。

1.1 氧化應激

氧化應激是指機體內活性氧（ROS）與抗氧化能力失衡。活性氧是細胞正常代謝的中間產物，在細胞信號傳導中扮演重要角色[17]。當細胞中增加的ROS擊破機體防御系統會引起氧化應激，進而刺激炎癥因子的釋放，導致疾病發展[18]。肝臟是負責機體代謝內穩態、解毒和清除ROS的主要器官[19]，肝細胞線粒體和內質網是各種形式的肝病中ROS產生的主要部位[20]。Sugimoto等[21]研究表明，急性與慢性乙醇將通過改變肝細胞細胞膜和線粒體的氧化還原狀態、增加細胞色素P450（CYP）2E1蛋白的表達等多種機制提高細胞內ROS的含量，進而導致肝損傷。部分藥物在代謝過程中也不可避免地引起ROS的升高，進而導致肝損傷[22-23]。

研究表明肝損傷可抑制肝臟抗氧化酶活性[24]。酒精的代謝物乙醛能直接與谷胱甘肽（GSH）結合，降低谷胱甘肽的活性，進而影響谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）與谷胱甘肽還原酶（GR）的活性，導致ROS不能被及時清除，進而發生氧化應激[25]。由脂肪過度累積引起胰島素抵抗將導致肝脂肪變性，肝脂肪生成增加，而游離脂肪酸降解受損，脂肪堆積使肝臟敏感，從而引起ROS、過氧化脂質（LPO）、丙二醛（MDA）的升高以及一系列抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）與過氧化氫酶（CAT）等活性降低[26-28]，進而導致肝損傷。Li等[29]試驗表明L-茶氨酸能預防小鼠酒精性肝損傷，包括SOD、CAT、GR活性和GSH水平。Li等[30]研究表明，L-茶氨酸可上調半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3酶原（ProCaspase-3）的表達，抑制裂解聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的通路表達，從而緩解H2O2誘導的H9C2細胞的凋亡。

1.2 炎癥反應

炎癥是形成肝臟疾病的重要因素。炎癥是免疫反應的重要組成部分，表現為炎癥細胞浸潤到肝臟[31]，一旦炎癥細胞持續或壓倒性地存在，將會導致細胞損傷和脂質積累，進而導致肝損傷[32]。炎癥主要通過細胞中轉錄因子核因子κB（NF-κB）的激活機制刺激Kupffer細胞產生促炎細胞因子，包括誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環氧合酶-2（COX-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素1-α（IL-1α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、干擾素-γ（IFN-γ）、組織生長因子-β（TGF-β）和結締組織生長因子（CTGF）[33-35]。TNF-α可能作為肝臟毒性、炎癥和非酒精性脂肪肝（NAFLD）發展的媒介，TNF-α會提高活化的肝星狀細胞中基質金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP1）的mRNA表達水平，并激活相關信號通路產生一系列炎癥因子（IL-1α、iNOS等），進而促進肝細胞的損傷過程[36]。而當肝臟慢性炎癥持續發展至纖維化后，將激活TGF-β、CTGF等促纖維化因子，進一步加重肝損傷[37]。這些促炎細胞因子促進肝臟和全身炎癥，從而改變肝臟微環境，進而導致纖維化和異常肝細胞再生[38]。

2 L-茶氨酸改善肝損傷的途徑

2.1 細胞試驗

人體正常肝細胞（L02、HL7702等）與人類肝癌細胞（HepG2、HHC等）是研究肝損傷及其相關疾病的常用細胞。李桂蘭等[39]研究發現L-茶氨酸能提高過氧化氫（H2O2）損傷的L02細胞存活率，減少乳酸脫氫酶（LDH）的滲漏，從而緩解肝細胞凋亡。Xin等[40]研究證實L-茶氨酸能通過細胞凋亡誘導HepG2細胞死亡，并且在急性谷氨酰胺限制或剝奪的情況下這種作用明顯增強。Zhang 等[41]研究表明，L-茶氨酸及其衍生物能顯著抑制SMMC7721和HepG2細胞的體外遷移和體外培養，并能顯著增強抗癌藥物阿霉素（DOX）對SMMC7721和HepG2細胞的生長抑制作用，且L-茶氨酸還可誘導損傷SMMC7721細胞的凋亡。Sun等[42]研究發現，L-茶氨酸通過機制下調肝組織和正常肝細胞中磷酸化的NF-κB、TNF-α和IκB激酶α（IKKα）進而降低iNOS、IL-1β和IL-6的分泌。Deng等[43]研究表明，L-茶氨酸能恢復錳超氧化物歧化酶（MnSOD）的mRNA水平來降低腸毒素大腸桿菌（ETEC）感染的小鼠氧化參數。Liang等[44]用L-茶氨酸處理經油酸誘導的HepG2與AML12細胞發現，L-茶氨酸通過AMP活化蛋白激酶（AMPK）增加過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）和肉堿棕櫚酰轉移酶-1A（CPT1A）的表達，從而增強脂肪酸β氧化。

2.2 動物試驗

由于與人體基因組的高度同源性，大鼠和小鼠在肝損傷的研究中得到廣泛應用。研究表明，在熱應激下L-茶氨酸可顯著預防熱應激誘導的炎性和急性期反應的影響[45]。Jiang等[46]研究發現L-茶氨酸劑量依賴性地下調CYP2E1，抑制四氯化碳（CCl4）的代謝激活，從而抑制小鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）與谷草轉氨酶（AST）活性、膽紅素水平、GSH含量及抗氧化酶活性的升高，緩解CCl4誘導的脂質過氧化以及肝臟組織病理改變。Wang等[47]發現，經L-茶氨酸處理的脂多糖（LPS）誘導的炎癥小鼠的ALT與AST濃度、MDA以及肝臟總超氧化物歧化酶（T-SOD）水平明顯降低，且顯著抑制多種炎癥因子（包括IL-1β、TNF-α和IL-6）的表達，并增加肝組織中IL-10與IFN-γ含量的比例，證明茶氨酸對于肝損傷具有治療作用。另有研究表明[48]，L-茶氨酸可抑制肝組織中NF-κB的表達，下調促炎細胞因子IL-1和IL-6的表達和促肝纖維化細胞因子（TGF-β和CTGF）。Zeng等[49]研究發現，L-茶氨酸抑制晚期糖基化終末產物（AGEs）的產生，逆轉D-半乳糖誘導的氧化應激和炎癥反應的失衡，以此改善肝臟老化。Chen等[50]用L-茶氨酸處理的脂肪源性間充質干細胞（ADSCs）注射到用N-亞硝基二乙胺（DEN）誘導的大鼠肝損傷模型，發現L-茶氨酸預處理的ADSC中HGF的旁分泌量、對DEN誘導的肝纖維化以及抑制細胞凋亡的肝損傷的保護作用均優于僅注射ADSCs的干預效果。

2.3 L-茶氨酸與其他物質的協同調控作用

作為谷氨酰胺的類似物，Lai等[51]研究發現L-茶氨酸與L-谷氨酰胺聯合使用顯著提高E44813（產腸毒素大腸桿菌）應激大鼠體內SOD與GSH-Px活性，降低了MDA含量和炎癥因子表達。有研究表明[52]，同時給予L-茶氨酸與L-胱氨酸，將顯著抑制肝臟GSH水平的下降并增強特異性IgG的產生。Jia等[53]研究表明，L-茶氨酸可以防止表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（EGCG）氧化并共同降低肝損傷。Nagai等[54]研究發現，L-茶氨酸與DOX聯用時L-茶氨酸能緩解DOX誘導的GSH和SOD含量下降并抑制LPO產生，從而緩解DOX引起的不良反應。汪麗偉等[55]研究表明，飼喂含L-茶氨酸與茶多酚的飼料能顯著提高仔雞CAT的活性并降低MDA含量。Xia等[56]研究發現，兒茶素通過水溶液中氫鍵自發地與L-茶氨酸結合并在一定程度上具有緩慢釋放抗氧化能力。L-茶氨酸和可可堿單獨或組合通過下調Akt/mTOR和JAK2/STAT3通路以及增加Smad2腫瘤抑制因子來抑制腫瘤發生[57]。Yu等[58]研究發現，L-茶氨酸和士的寧相互作用增強了戊巴比妥鈉對士的寧的毒性和抗驚厥作用。

3 L-茶氨酸改善肝損傷的作用機理

3.1 減少機體氧化應激損傷

ROS作為氧氣代謝的自然副產物，在生理條件下ROS維持在一個穩定的水平[59]以促進生理氧化還原信號的傳遞。正常水平的ROS通過轉錄因子和表觀遺傳途徑的調節，作為信號分子參與細胞新陳代謝、生長、免疫防御、增殖和分化[60]。然而，在氧化應激的情況下，過量的ROS會觸發病理性的氧化還原信號[61]并由其特殊的化學性質引起脂質過氧化[62]，破壞抗氧化系統引起細胞大分子（DNA、脂類、蛋白質等）的氧化修飾[63]，進而導致肝臟損傷[64]。研究表明[65]，ROS促進慢性肝病的機制與不加區別的氧化生物分子損傷和氧化還原信號紊亂有密不可分的關系。在哺乳動物中，ROS被抗氧化酶（SOD和CAT）和抗氧化物質（維生素、GSH、GSH-Px和GR等）合作清除[66]。

L-茶氨酸能調控體內抗氧化物質的水平。作為谷氨酰胺的類似物，L-茶氨酸從茶樹根部合成后在嫩葉中水解成谷氨酸和乙胺[67]。Alt?nkaynak等[68]試驗表明，L-茶氨酸可增加細胞內谷氨酸或谷氨酰胺水平，而谷氨酰胺類化合物如茶氨酸是合成GSH所必需的[69]。在DOX引起的心臟毒性試驗結果顯示，L-谷氨酰胺可提高GSH水平，抑制血漿和心臟組織的脂質過氧化[70]。研究表明[71]，谷氨酸可通過α-酮戊二酸再生三羧酸（TCA）循環中間代謝物并通過氧化磷酸化減輕氧化損傷。L-茶氨酸的另一水解物乙胺也可能導致GSH-Px的升高，乙胺將抑制異戊烯基焦磷酸鹽積累誘導的甲羥戊酸途徑，異戊烯基焦磷酸鹽可增加GSH-Px等硒蛋白的合成[72]；試驗表明L-茶氨酸給藥對肝臟具有重要的保護作用，導致GSH-Px活性水平增加[73]。L-茶氨酸也能通過調節抗氧化酶的活性減少氧化應激損傷。有研究表明[74]，L-茶氨酸能顯著提高抗氧化酶水平進而改善肝缺血再灌輸大鼠的急性肝損傷。Malko?等[75]研究發現，L-茶氨酸通過降低MDA水平以及增加谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）和GSH水平表現出抗氧化作用進而抑制盲腸結扎穿刺致膿毒癥誘導的肝腎組織損傷。Sadzuka等[76]研究表明，L-茶氨酸能抑制LPO的水平。

3.2 下調機體炎癥因子的表達

肝臟炎癥是肝病的常見誘因，被認為是肝組織損傷的主要驅動因素，引發從非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）進展為嚴重纖維化，最后為肝細胞癌（HCC）[77]。由于肝損傷和肝臟炎癥，炎癥細胞和肝細胞本身釋放細胞因子如TNF-α和ROS。這些介質可引起血漿和線粒體膜的過氧化，從而導致壞死或細胞凋亡進而引起細胞死亡[78-79]。在生理條件下，肝臟會產生基礎量的TNF-α，而一旦出現肝損傷TNF-α會明顯增加[80]。TNF-α與其受體結合后可通過激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）誘導肝細胞凋亡[81]，它還能激活NF-κB信號通路并引發IL-1β、IL-6、iNOS、COX等炎癥因子的分泌引起細胞凋亡，從而進一步加重肝臟炎癥[82]。Bai等[83]研究發現，L-茶氨酸在體內外均降低促炎癥因子的表達，包括COX-2、前列腺素E2（PGE-2）、iNOS和一氧化氮（NO）。有研究表明[84]，L-茶氨酸可顯著降低單核細胞化學引誘蛋白-1（MCP-1）、IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α和IFN-γ的產生，并減弱ROS的產生以及NF-κB和基質金屬蛋白酶-9的活化，進而減輕卵清蛋白誘導的炎癥反應。Liu等[85]研究發現，在E44813應激大鼠中L-茶氨酸通過抑制大麻素受體1的活性、促進p-ERK1/2的核易位并通過COX2-Pdcd4-NFκB-IL10和TNFα途徑降低促炎癥因子TNF-α的表達。

3.3 調節線粒體活性

細胞凋亡是一種高度調節的細胞死亡形式，在胚胎發育、組織穩態和疾病進展中起重要作用[86]。Bax或Bcl-2可以控制線粒體的通透性并促進細胞色素C的通過[87]。因此，Bax與Bcl-2含量的比例決定許多細胞的命運[88]。Bax和Bcl-2蛋白的不平衡可能導致細胞色素C的釋放，從而引發Caspase-3的激活，導致細胞凋亡[89]。Ben等[90]研究發現，L-茶氨酸可以降低氯化鎘刺激的神經元腫瘤細胞的Bax與Bcl-2含量的比例以及裂解的Caspase-9、Caspase-3和聚（ADP-核糖）聚合酶的水平。Nagai等[91]研究表明L-茶氨酸顯著抑制Bax蛋白水平，并抑制Caspase-3的激活從而減緩DOX引起的細胞損傷。另有研究表明[92]L-茶氨酸選擇性地抑制谷氨酸離子型受體和I型代謝受體的結合，減少由于谷氨酸受體過度激活而導致的鈣離子流入，進而緩解細胞色素C釋放和Caspase激活誘導的細胞死亡。Chen等[93]發現L-茶氨酸處理可降低魚藤酮誘導的一氧化氮水平升高和脂質過氧化的產生并增加線粒體復合物I、II、IV和V的活性。Wu等[94]試驗表明，L-茶氨酸可顯著逆轉疊氮化鈉誘導的Caspase-3/9和細胞色素C蛋白表達水平升高并能穩定SH-SY5Y細胞線粒體膜電位，減少線粒體損傷。

3.4 調節MAPK信號通路

MAPK（絲裂原活化蛋白激酶級聯）是一種將細胞外信號傳遞到細胞核的機制[95]，在真核細胞中MAPK信號通路是一種常見且較為保守的調節機制[96]。MAPK信號通路通過外部環境（如生長因子、有絲分裂原、細胞因子和壓力）的誘導進而影響細胞的增殖、分化、凋亡、炎癥和代謝，從而通過各種信號傳導途徑調節細胞的生物學行為[97]。Gong等[98]研究發現，L-茶氨酸預處理組ERK1/2和JNK1/2MAPK磷酸化水平下降，茶氨酸預處理組Caspase-3蛋白表達量顯著降低，說明其抑制ETEC誘導的肝損傷。Liu等[99]研究發現L-茶氨酸調節p38MAPK、NF-κB通路和HSP27熱休克蛋白，減輕熱應激引起的機體炎癥反應和免疫功能損傷。L-茶氨酸具有劑量依賴抑制促炎蛋白激酶C（PKC）、ERK、NF-κB、IL-33等信號傳導，進而改善P物質誘導氧化應激、細胞凋亡和自噬所引起的膀胱多動癥[100]。Ma等[101]試驗表明，L-茶氨酸以劑量依賴性方式顯著減少1,2-二甲基肼（DMN）誘導的結直腸癌小鼠的腫瘤標志物，并以劑量依賴性方式顯著抑制p38MAPK、p-53以及Caspase-3/8/9的表達。Fan等[102]發現，L-茶氨酸通過明顯抑制ERK/NF-κB信號通路表現出對轉移性前列腺癌具有治療潛力。

4 展望

L-茶氨酸可以有效調控機體肝損傷，其作用機理主要包括減少氧化應激損傷、下調炎癥因子的表達以及調節細胞信號通路等方面。L-茶氨酸已表現出改善肝損傷的良好效果，但目前對L-茶氨酸的衍生產品及其產業化仍需繼續加強研究及開發應用。

一是劑量安全性。目前鮮有報道L-茶氨酸的安全性問題，美國食品藥品監督管理局（FDA）建議每日茶氨酸攝入量不應超過1200 mg[103]。

二是L-茶氨酸衍生產品技術創新不足。L-茶氨酸是一種新型的食品添加劑，目前已在日本與歐美等發達國家中得到廣泛應用。2014年我國公布了L-茶氨酸可作為新的食品原料，但作為茶葉生產大國，我國開發茶氨酸及其衍生產品的創新和推廣力度仍遠遠不足，應大力開發L-茶氨酸為基礎的高值化產品進而提高L-茶氨酸的經濟和社會效益。