原發性膽汁性膽管炎病人咽漱液中EB病毒分型

吳海梅 趙真真 周永 薛楓 辛永寧 宣世英

[摘要] 目的 明確原發性膽汁性膽管炎（PBC）病人咽漱液中EB病毒（EBV）的1/2分型及EBV核抗原1（EBNA1）基因的多態性分布。方法 采用PCR結合凝膠電泳鑒定54例PBC病人EBV感染和1/2分型情況。應用PCR/測序的方法檢測54例PBC病人咽漱液中EBNA1基因的多態性。比較PBC病人和健康人群EBV 1/2分型及各基因變異類型的分布，并比較EBV不同亞型病人的臨床特征。結果 54例PBC病人EBV感染率為100%。PBC病人2型EBV感染率明顯高于健康人群（χ²=5.959，P=0.015，OR=2.782，95%CI=1.208～6.410）。在PBC病人咽漱液標本中最多見的EBNA1亞型是P-thr變異型，其在PBC病人中所占的比例高于健康人群，差異具有顯著性（χ²=8.290，P=0.004，OR=3.253，95%CI=1.440～7.347）。EBV-2型PBC病人直接膽紅素異常升高比例顯著高于EBV-1型病人（χ²=9.714，P=0.002）。結論 2型EBV感染及P-thr變異型攜帶可能與PBC相關，2型EBV感染與PBC病人的直接膽紅素異常升高有關。

[關鍵詞] 皰疹病毒4型，人；肝硬化，膽汁性；抗原，核；多態性，單核苷酸

[中圖分類號] R575.22;R373.9

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2023）04-0513-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.109

[網絡出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230912.0954.001;2023-09-13 17：13：39

VARIANTS OF EPSTEIN-BARR VIRUS IN THROAT WASHING OF PATIENTS WITH PRIMARY BILIARY CIRRHOSIS WU Haimei， ZHAO Zhenzhen， ZHOU Yong， XUE Feng， XIN Yongning， XUAN Shiying （Infection Disease Department of Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Nanjing Medical University， Qingdao 266071， China）＼; [ABSTRACT] Objective To investigate the type 1/2 variants of Epstein-Barr virus （EBV） and the polymorphism of the Epstein-Barr nuclear antigen 1 （EBNA1） gene in throat washing of patients with primary biliary cirrhosis （PBC）. Methods PCR and gel electrophoresis were used to identify EBV infection and the type 1/2 variants of EBV in 54 patients with PBC， and PCR and sequencing were used to detect the polymorphism of the EBNA1 gene in the throat washing samples of 54 PBC patients. The type 1/2 variants of EBV and the distribution of variants were compared between the PBC patients and the healthy population， and clinical features were compared between the patients with different subtypes of EBV. Results The 54 PBC patients had an EBV infection rate of 100%. The PBC patients had a significantly higher infection rate of type 2 EBV than the healthy population （OR=2.782， 95%CI=1.208-6.410， χ²=5.959，P=0.015）. P-thr variant was the most common subtype of EBNA1 in the samples of PBC patients， and the frequency of P-thr in PBC patients was significantly higher than that in the healthy population （OR=3.253， 95%CI=1.440-7.347， χ²=8.290，P=0.004）. Compared with the patients with EBV-1 type， the patients with EBV-2 type had a significantly higher proportion of patients with an abnormal increase in direct bilirubin （DBil） （χ²=9.714，P=0.002）. Conclusion Type 2 EBV infection and P-thr variant might be associated with PBC， and type 2 EBV infection is associated with the abnormal increase in DBil in patients with PBC.

[KEY WORDS] herpesvirus 4， human; liver cirrhosis， biliary; antigens， nuclear; polymorphism， single nucleotide

EB病毒（EBV）是皰疹病毒科嗜淋巴細胞屬成員，感染了世界上95%以上的人口，且與多種自身免疫性疾病有關^[1-3]。原發性膽汁性膽管炎（PBC）的發病機制尚不清楚，但該病本質上是自身免疫性疾病^[4]。有研究發現，PBC與EBV感染之間存在關聯^[5-7]。EBV相關疾病的分布具有明顯的地域差異，提示不同地區的EBV流行株可能有序列及生物學功能上的差異。EBV最常見的分型方式為基于EBV核抗原（EBNA）2、3A、3B及3C的抗原性及基因序列而區分的1/2分型。多數研究認為，1/2分型具有地域相關性，也有研究顯示EBV-2型感染可能與鼻咽癌（NPC）發生有關^[8]。而基于EBNA1的基因序列，亦可以將其劃分為5種亞型：P-ala、P-thr、V-val、V-leu和V-pro。該分型方式同樣具有疾病特異性^[9]。本研究首次對PBC病人咽漱液中EBV進行1/2分型檢測及EBNA1的多態性分析，旨在確定EBV的基因亞型與PBC疾病相關性。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本采集及DNA提取

收集青島市市立醫院及青島市第六人民醫院收治的54例PBC病人的咽漱液標本，病人籍貫均為山東省并且長期居住在青島市。PBC診斷參照《原發性膽汁性膽管炎的診斷和治療共識（2021）》的標準^[10]。排除標準：①合并自身免疫性肝炎、原發性硬化性膽管炎、IgG4相關性肝膽疾病等其他自身免疫性肝病的病人；②合并甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等嗜肝性病毒感染，或人免疫缺陷病毒、巨細胞病毒等非嗜肝性病毒感染的病人。健康人群咽漱液標本均來自在山東省居住的健康成年人群。取30 mL無菌生理鹽水漱口1 min后采樣，標本采集后采用江蘇康為世紀公司的通用式組織DNA抽提試劑盒抽提細胞DNA。

1.2 EBV 1/2分型檢測

參考SAMPLE等^[11]的報道設計PCR引物，擴增EBNA3C序列（表1）。取5 μL PCR擴增產物于含溴化乙錠的20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統記錄電泳結果。每次PCR反應均用無酶雙蒸水作陰性對照。PCR反應體系及反應條件參考ZHAO等^[12]的文獻。

1.3 EBNA1基因序列多態性檢測

1.3.1 PCR擴增 依據B95-8原型株序列，參考ZHAO等^[12]的報道設計擴增EBNA1基因的引物，引物序列及PCR產物長度見表1。采用巢式PCR擴增EBNA1 C-末端AA404-641（nt109159-109875）之間的序列，EBNA1-1、EBNA1-2為第1輪擴增引物，EBNA1-3、EBNA1-4為第2輪擴增引物。取第1次PCR擴增產物5 μL作為第2次PCR的模板，PCR反應體系及條件參考相關文獻^[12]。每次PCR反應均設水對照。取5 μL PCR產物置于15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳。

1.3.2 測序分析 取上述PCR產物25 μL送北京華大基因有限公司進行測序，采用Snapgene軟件查看所獲序列峰圖文件，利用DNAStar軟件（Larsergene，version 7.0）進行序列剪接和對比分析，并在美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫中與B95-8原型株（GenBank登錄號V01555）序列進行對比分型。采用BHATIA等^[13]和GUTI?RREZ等^[14]的分類方法，以AA487為特征性AA，結合其他共有突變對序列將EBNA1基因分為P-ala、P-thr、V-val、V-leu和V-pro 5種亞型，將具有相同共有突變的序列歸為1種變異類型。

1.4 統計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用卡方檢驗、精確概率法。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EBV感染率與1/2分型

本文54例病人標本中均檢出EBV感染，感染率為100%，其中1型EBV感染31例（57.4%），2型EBV感染19例（35.2%），1+2型EBV混合感染4例（7.4%）。圖1為部分標本EBNA3C片段PCR產物電泳結果。健康人群EBV 1/2分型結果：1型EBV感染45例（45/57，78.9%），2型EBV感染10例（10/57，17.6%），1+2型混合感染2例（2/57，3.5%）^[15]。將1+2型EBV感染病人與2型EBV感染病人合并進行統計分析，結果顯示，PBC病人2型EBV感染率（23/54，42.6%）明顯高于健康人群（12/57，21.1%），差異具有統計學意義（χ²=5.959，P=0.015，OR=2.782，95%CI=1.208～6.410）。

2.2 EBV 1/2分型與PBC病人臨床特征關系

EBV-2型病人直接膽紅素（DBil）異常升高比例顯著高于EBV-1型（χ²=9.714，P=0.002）；EBV-1型PBC病人與EBV-2型PBC病人之間性別、年齡、體質量指數（BMI）以及總膽紅素（TBil）、間接膽紅素（IBil）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉移酶（GGT）、總膽汁酸（TBA）等肝功能指標比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。見表2。

2.3 EBNA1基因序列多態性

2.3.1 EBNA1 C端序列變異類型 本研究成功擴增52例PBC病人的EBNA1片段，共檢出4種變異類型：P-ala、P-thr、V-val和V-leu。有5份PBC病人標本在用Snapgene軟件查看峰圖序列時發現AA487等共有突變位點出現超過1種亞型的特征性突變，經反復測試最后鑒定為混合感染。其中有2份標本為P-thr+V-leu混合感染，1份標本為V-val+P-thr混合感染，1份標本為V-val+V-leu混合感染，1份標本為P-thr+P-ala混合感染。

2.3.2 EBNA1亞型在PBC病人和健康人群中的分布 在PBC病人標本中最多見的變異類型為P-thr變異型（27/52，51.9%），其次為V-val變異型（18/52，34.7%）。在健康人群中最多見的變異類型為V-val變異型（34/55，61.8%）^[15]。P-thr攜帶者（31/52，59.6%）在PBC病人中所占比例明顯高于健康人群（18/55，32.7%）（χ²=8.290，P=0.004，OR=3.253，95%CI=1.440～7.347）。見表3。

2.3.3 EBNA1亞型與1/2分型的關系 EBV-1型病人主要的EBNA1亞型為V-val和P-thr，共占96.2%（26/27），EBV-2型病人主要的EBNA1亞型為P-thr，占64.7%（11/17）。EBV-1型與EBV-2型PBC病人之間EBNA1亞型的分布差異無顯著性（χ²=3.858，P=0.277）。見表4。

2.3.4 EBNA1基因序列多態性與PBC病人臨床特征關系 P-thr、V-val 2種EBNA1亞型病人之間性別、年齡、BMI及肝功能指標比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。見表5。

3 討論

PBC是一種慢性的自身免疫性疾病，其病因是免疫介導的小膽管進行性破壞，其典型特征是血清中存在抗線粒體抗體。PBC病人的肝臟和唾液樣本中均存在EBV-DNA水平升高^[5-6]。MORSHED等^[6]研究結果顯示，有61%的PBC病人外周血單個核細胞中EBV-DNA水平增加，而在健康對照組中僅有11%。BARZILAI等^[7]研究結果表明，PBC病人EBV早期抗原IgG滴度升高。以上研究均提示PBC的發生發展可能與EBV感染有關。

本研究共納入54例PBC病人，其EBV感染率為100%。全世界95%以上的健康成人攜帶EBV，最新的研究顯示，美國、巴西、墨西哥成年男性EBV平均感染率為97.3%^[16]。本研究所有PBC病人均感染EBV，這可能與本研究納入人群年齡較大，感染風險隨著年齡增長亦增高有關。

1型EBV是世界范圍內的優勢流行株，而2型EBV主要在非洲地區感染率較高^[17]。本研究PBC病人咽漱液標本中2型EBV的檢出率明顯高于健康人群，提示2型EBV感染可能與PBC有關。在體外1型EBV比2型EBV更加容易轉化初始B淋巴細胞，而2型EBV由于細胞活化T細胞核因子（NFAT）c1/c2轉錄因子活性的增加以及EBV即刻早期蛋白（BZLF1）啟動子Zp-V3的普遍存在導致受感染B細胞有更高的裂解能力^[18-19]。有人推測2型EBV可能在免疫系統紊亂病人中更常見^[17]。這提示EBV-2型與免疫功能有關，也部分解釋了PBC病人中EBV-2型感染比例更高的原因。

V-val型是北方地區最多見的EBNA1變異類型。而本研究PBC病人中所占比例最高的則是P-thr型，且PBC病人P-thr型所占比例顯著高于健康人群。有研究結果表明，V-val變異型EBNA1比B95-8原始株有更高的轉錄活性以及維持宿主細胞存活的能力，且來自不同地域的EBV相關胃癌（EBVaGC，日本和美國）及NPC（中國北方）的結果均顯示V-val為EBNA1主要亞型^[9]。提示PBC病人的P-thr分型比例增高具有疾病特異性，P-thr亞型可能與PBC具有相關性。EBV表位的分子擬態導致對自身抗原的耐受性喪失以及表位傳播可能是EBV導致自身免疫疾病發生與發展的機制之一^[20]。在動物實驗中，用EBNA1 DNA免疫不僅可以產生抗EBNA1抗體，還可以產生自身抗體并導致狼瘡樣自身免疫性疾病^[21]。EBNA1蛋白功能區域如DNA結合-二聚化部位（AA452-607）、轉錄激活部位（AA325-376、AA65-89）、USP7結合部位（AA442-459）等均位于C-末端^[22]，因此EBNA1 C端的突變可能對其功能產生影響。例如有研究發現，EBNA1 DNA結合域的氨基酸改變導致NPC細胞中DNA的復制能力受損，EBNA1的AA325-376缺失可以影響其轉錄激活的功能^[23]。故推測EBNA1序列多態性可能通過改變病毒DNA復制、轉錄等功能參與疾病發生發展^[24]。EBNA1在誘導自身免疫反應等方面具有重要作用，而P-thr亞型中大多數突變位點位于功能區域，今后需對該亞型繼續深入研究，進一步闡明其在PBC發生發展過程中的作用與機制。

EBV-2型PBC病人DBil異常升高比例顯著高于EBV-1型病人，而EBV-1型與EBV-2型PBC病人之間性別、年齡、BMI和除外DBil的肝功能指標差異均無顯著性。機體膽紅素濃度升高可以抑制細胞核因子κB（NF-κB）信號通路激活，從而誘導炎癥因子的表達和加重炎癥反應，并可以引起脂質過氧化損傷^[25]。DBil為PBC病人臨床治療中常用的反映肝功能的指標，其異常升高與病人臨床癥狀及預后有關^[10，26]。因此我們認為，EBV-2型感染與PBC病人的肝損傷有關，其具體機制還有待進一步研究。

綜上，2型EBV感染及P-thr變異型攜帶可能與PBC相關，2型EBV感染與PBC病人的DBil異常升高有關。由于PBC患病率較低，標本較難收集，盡管滿足統計需求，但本研究納入樣本例數仍較少，后續尚需擴大樣本量進一步研究。

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（本文編輯 馬偉平）