高尿酸血癥對雌性大鼠生殖功能的影響

宋淼 鄒通 徐禮斌 龔雪琳 王笑峰 邢士超

[摘要] 目的 探討高尿酸血癥（HUA）對雌性大鼠生殖功能的影響。方法 利用腺嘌呤、高酵母飼料和氧嗪酸鉀（尿酸酶抑制劑）進行9個周的HUA模型建立。通過陰道脫落細胞涂片觀察大鼠動情周期；留取完整子宮、卵巢稱質量，計算器官系數；采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察卵巢的病理變化；采用實時熒光定量PCR（qPCR）方法檢測卵巢組織中吻素1（KISS1）和吻素1受體（KISS1R）mRNA表達。結果 HUA雌性大鼠模型構建成功。與正常大鼠相比，HUA雌性大鼠動情間期明顯縮短（F=14.000，P＜0.01），卵巢系數顯著下降（t=2.377，P＜0.05），卵巢組織中KISS1和KISS1R mRNA表達顯著增高（t=3.456、5.408，P＜0.05）。結論 HUA可造成雌性大鼠KISS1系統紊亂，引起動情間期縮短和卵巢系數降低。

[關鍵詞] 高尿酸血癥；不育，女（雌）性；大鼠，Wistar；生殖；親吻素

[中圖分類號] R589.9;R339.2

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2023）04-0551-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.110

[網絡出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20230912.1030.002;2023-09-13 19：08：50

EFFECTS OF HYPERURICEMIA ON REPRODUCTIVE FUNCTION IN FEMALE RATS SONG Miao， ZOU Tong， XU Libin， GONG Xuelin， WANG Xiaofeng， XING Shichao （Department of Pathogenic Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）＼; [ABSTRACT] Objective To investigate the effects of hyperuricemia （HUA） on reproductive function in female rats. Methods A HUA model was established by nine weeks of high-yeast feeding with adenine and oteracil potassium （a uricase inhibitor）. The rat estrous cycle was determined through observing the smears of exfoliated vaginal cells. The intact uterus and ovaries were weighed to calculate the organ coefficients. Pathological changes in the ovaries were observed with hematoxylin-eosin （HE） staining. The mRNA expression of kisspeptin 1 （KISS1） and kisspeptin 1 receptor （KISS1R） in the ovaries was measured using quantitative real-time PCR. Results The female rat HUA model was successfully constructed. Compared with normal rats， the female rats with HUA showed a significantly shorter interestrus interval （F=14.000，P<0.01）， a significantly lower ovarian coefficient （t=2.377，P<0.05）， and significantly higher mRNA expression of KISS1 （t=3.456，P<0.05） and KISS1R （t=5.408，P<0.05） in the ovarian tissue. Conclusion HUA can disrupt the KISS1 system in female rats， resulting in a shortened interestrus interval and a reduced ovarian coefficient.

[KEY WORDS] hyperuricemia; infertility， female; rats， Wistar; reproduction; kisspeptins

尿酸是嘌呤代謝的終末產物。在我國，高尿酸血癥（HUA）的患病率為13.3%，其中女性的患病率為7.9%^[1-2]。近年來，女性不孕率不斷升高，這與飲食、生活習慣和環境等因素密切相關^[3]。研究表明，HUA與女性生殖障礙之間存在密切聯系，但其機制尚不清楚^[4-5]。在中樞神經系統中，親吻肽（Kiss-peptin）通過調節促性腺激素釋放激素（GnRH）影響下丘腦-垂體-性腺軸^[6]。Kisspeptin蛋白由吻素1（KISS1）基因所編碼，通過與吻素1受體（KISS1R）結合，發揮其生物學功能^[7]。Kisspeptin和其受體KISS1R基因敲除的小鼠無正常的動情周期，且卵巢更小，存在生育困難^[8-9]。本實驗通過構建HUA雌性大鼠模型，觀察雌鼠動情周期、器官濕質量系數、卵巢病理變化及卵巢組織中KISS1和KISS1R mRNA的表達，探究HUA對雌鼠生殖功能的影響。現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

健康成年雌性Wistar大鼠14只，12周齡，體質量為（240±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。腺嘌呤（北京索萊寶生物科技有限公司）；氧嗪酸鉀（生工生物工程股份有限公司）；質量分數為0.10的高酵母飼料（北京博泰宏達生物技術有限公司）；毛細玻璃管（華西醫科大學儀器廠）；真空采血管（康衛仕醫療器械有限公司）；低溫離心機（賽默飛科技有限公司）；PCR試劑盒（塞維爾生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理采用隨機數字法將大鼠分為HUA組和對照組，每組7只。HUA造模參考李傳偉等^[10]的方法。HUA組大鼠飲食分為兩個階段：第1階段，飼喂高酵母飼料，并且用40 g/L的腺嘌呤溶液按照100 mg/（kg·d）的劑量灌胃；在檢測到大鼠血尿酸（SUA）水平顯著下降時，進入第2階段，繼續飼喂高酵母飼料，腺嘌呤劑量減半，同時每日12：00給予大鼠腹腔注射氧嗪酸鉀，用量為100 mg/（kg·d）。整個實驗持續9周。對照組大鼠飼喂普通飼料，并且給予等體積的蒸餾水進行灌胃。兩組大鼠均每間隔1周內眥取血0.5 mL，以3 500 r/min 離心10 min，取血清，采用生化分析儀檢測SUA。

1.2.2 動情周期觀察 在確認造模成功后（第7周），每天8：00和20：00，抓取大鼠放置于手心，將沾有生理鹽水的細小棉棒緩慢地插入大鼠陰道后稍停留，并輕輕旋轉，緩慢地拔出，將陰道內含物均勻地涂抹在載玻片上，待自然干燥后，用亞甲藍染色5 min，顯微鏡下觀察。參考印丹丹等^[11]的方法，根據細胞種類和比例的變化來判斷動情周期，直至觀察一個完整的動情周期。

1.2.3 器官濕質量系數測定 在造模第9周后處死大鼠，留取完整的子宮、卵巢，吸干表面水分后稱質量，計算器官系數。子宮（卵巢）系數=子宮（卵巢）質量（mg）/大鼠體質量（g）×100%。

1.2.4 卵巢組織病理學觀察 卵巢稱質量后，取部分組織立即置于40 g/L甲醛中進行固定，制備組織蠟塊，切片（5 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察。

1.2.5 卵巢組織KISS1和KISS1R mRNA表達檢測 剩余部分卵巢組織用trizol提取mRNA，逆轉成為cDNA后，使用PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR（qPCR）檢測。所用引物及其序列見表1。采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.3 統計學方法

應用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，兩組不同時間SUA和動情周期比較采用重復測量方差分析，其他兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05認為差異有顯著意義。

2 結果

2.1 兩組SUA水平比較

在模型構建第1、5、7、9周時，HUA組大鼠的SUA水平均顯著高于對照組（F=9.430～28.910，P＜0.05），表明HUA大鼠模型造模成功。見表2。

2.2 兩組動情周期比較

雌性大鼠動情周期可分為4個階段。①動情前期：涂片可見大量有核上皮細胞和少量的角化上皮細胞（圖1A）；②動情期：涂片可見滿視野的角化上皮細胞和少量的有核上皮細胞（圖1B）；③動情后期：涂片上有核上皮細胞、角化上皮細胞、白細胞均可見且比例相當（圖1C）；④動情間期：可見大量的白細胞和黏液（圖1D）。與對照組相比，HUA組大鼠動情前期、動情期、動情后期時間無明顯變化，而動情間期明顯縮短（F=14.000，P＜0.01）。見表3。

2.3 兩組器官濕質量系數比較

與對照組相比，HUA組大鼠的子宮系數無明顯變化，但卵巢系數顯著下降（t=2.377，P＜0.05），說明HUA對卵巢產生影響。見表4。

2.4 卵巢組織病理學觀察

兩組大鼠卵泡細胞的發育和成熟正常，病理切片無明顯改變，說明HUA對卵巢組織沒有明顯破壞。見圖2。

2.5 兩組卵巢組織KISS1和KISS1R mRNA表達比較

qPCR檢測結果顯示，與對照組相比，HUA組大鼠卵巢組織中KISS1和KISS1R mRNA表達顯著增高（t=3.456、5.408，P＜0.05）。見表5。

3 討論

隨著生活水平的提高，我國HUA發病率越來越高，女性發病率也呈現出逐年增長的趨勢。尿酸不僅已經被證實是心血管疾病和高脂血癥、糖尿病等代謝類疾病的風險因素^[12]，還與多種女性生殖障礙類疾病相關，如多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位、妊娠并發癥等^[5，13]。

在雌性哺乳動物中，動情周期分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期4個階段。雌性大鼠體內的激素水平、卵巢和子宮的生理狀態都隨著動情周期的改變而變化，動情周期是雌性生殖健康的重要標志^[14]。動情周期是由下丘腦-垂體-性腺軸所控制的，主要通過GnRH進行調節，主要有兩種調節模式：一種是脈沖式分泌模式，負責刺激卵泡發育和類固醇生成；另一種則是激增分泌模式，主要負責誘導促黃體生成素的激增^[15]。KISS1R是GnRH神經元脈沖式分泌活動調節的關鍵受體^[16]。荀文娟等^[17]研究發現，KISS1/KISS1R系統對豬的發情周期具有重要的調節作用。本文研究結果顯示，與對照組相比較，HUA組大鼠卵巢組織中KISS1和KISS1R mRNA的表達水平均明顯增高，尤其是KISS1R mRNA的表達增高更為顯著。KISS1R mRNA編碼的產物為Kisspeptin蛋白受體，本研究HUA組大鼠動情間期縮短，可能是由于KISS1R表達水平升高，使大鼠對激素更加敏感所致。

卵巢KISS1/KISS1R系統還控制著卵泡發育、卵母細胞成熟、調節排卵和卵巢類固醇激素的合成等^[18]。FABOV?等^[19]研究發現，在卵巢的體外模型中，低劑量的Kisspeptin蛋白對卵巢有保護、抗凋亡的作用，而高劑量的Kisspeptin蛋白對卵巢具有負向調節作用。本研究HUA組大鼠卵巢組織中KISS1 mRNA表達水平增高，但卵巢系數下降。猜測這可能是由于卵巢中Kisspeptin蛋白過量表達，卵巢功能被抑制所導致的。但目前尚缺乏直接證據與大規模的臨床研究證實這一猜測。

綜上所述，HUA可能通過KISS1系統導致雌性大鼠動情周期紊亂和卵巢系數下降，這為HUA的早期篩查及其并發癥的預防性治療提供了新的理論依據，也為女性生殖障礙相關疾病的診療提供了新的思路。

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（本文編輯 馬偉平）