SMAD6對豬未成熟支持細胞增殖和凋亡的影響

顏賽娜，楊岸奇，唐湘薇，陳楚杰，尹艷飛，向嬌嬌，馬佳佳，冉茂良*，陳斌*

(1. 湖南農業大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2. 畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

支持細胞(Sertoli cells)分布于睪丸曲細精管上皮細胞管壁上偏基膜側，在睪丸細胞中體積最大且形狀不均勻[1]。該細胞最明顯特征是可以通過分泌繆勒管激素抑制因子(mullerian inhibiting factor)，在胚胎確定為雄性后阻礙雌性器官發育[2]。此外，支持細胞具有分泌抑制素B(inhibin b)、活化素(activin)、雄激素結合蛋白(androgen binding protein，ABP)的功能[3-5]，這些物質對于睪丸發育和性成熟具有重要作用。睪丸中每個成熟的支持細胞可以為30～50個生殖細胞提供營養支持[6]。哺乳動物睪丸體積大小及產生精子能力與睪丸支持細胞的數量呈正相關[7]。成熟的支持細胞不具備增殖能力，在成熟睪丸中數量相對穩定[8]，其最終數量取決于未成熟時的增殖活性。說明睪丸未成熟支持細胞的增殖活性對種公畜繁殖性能和養殖效益具有重要影響。

未成熟支持細胞的增殖受到激素、信號通路、基因等多方面的調控。本課題組前期研究鑒定出在睪丸發育過程中受3′UTR甲基化水平正向調控的樞紐基因，如INHBA(inhibin subunit beta A)、SMAD6和TGFB3(transforming growth factor beta 3)等，其中INHBA基因已被驗證能影響支持細胞增殖活性[9]。但SMAD6在睪丸發育過程中的生物學功能尚未被發掘。因此，本研究旨在探明SMAD6對豬未成熟支持細胞增殖及凋亡的影響，為睪丸發育和精子生成中的分子調控作用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

豬睪丸細胞系(ST)ATCC?CRL-1746TM購自上海安為生物科技有限公司，已證實為純度接近100%的豬未成熟支持細胞[10]，并已應用于相關研究[11-12]。細胞完全培養基為：高糖DMEM∶胎牛血清∶雙抗(Penicillin-Streptomycin)=10∶1∶0.1，各成分均來自美國Gibco公司。細胞培養條件為：在有一定濕度、溫度為37 ℃及含5% CO2的細胞培養箱中培養。

1.2 SMAD6過表達載體構建和SMAD6干擾RNA合成

SMAD6過表達質粒(OE-SMAD6)以NheⅠ和KpnⅠ為酶切位點、以pcDNA3.1(+)-EGFP為載體(氨芐抗性)在武漢金開瑞生物工程有限公司設計并合成。SMAD6干擾RNA(SMAD6 siRNA)由廣州銳博生物技術有限公司設計并合成，干擾序列見表1。

表1 SMAD6 siRNA序列

1.3 細胞轉染

細胞接種于6孔板中，融合度達60%～80%時，吸棄完全培養基，每孔加入1 mL的PBS潤洗2遍；向每孔加入1 mL不含血清和雙抗的高糖DMEM，培養箱中繼續培養2 h。OE-SMAD6組和對照組(NC)每孔準備2管125 μL的DMEM，一管加入9 μL Lipofectamine?2000(美國Invitrogen公司)，另一管分別加入OE-SMAD6和pcDNA3.1(+)-EGFP空載(NC)質粒，2管分別充分混勻后，室溫靜置5 min；將2管試劑混合成1管并充分混勻，室溫靜置30 min后加入細胞培養液中。干擾SMAD6表達組和對照組每孔準備1管120 μL的DMEM，分別加入5 μL的SMAD6 siRNA和siRNA NC，充分混勻后室溫靜置5 min；加入12 μL Lipofectamine?2000，充分混勻，室溫靜置30 min后加入細胞培養液中。以上每組設置3個重復，每個重復1個孔，轉染培養6 h后更換為完全培養基，繼續培養至一定狀態后進行后續試驗。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

細胞在6孔板中轉染后繼續培養24 h，采用TRIzol(美國Thermo公司)提取細胞總RNA，核酸/蛋白濃度測定儀(Nan Drop ND-2000，美國Themo Scientific公司)測定RNA濃度并檢測總RNA質量；使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(日本TaKaRa公司)進行逆轉錄獲得cDNA；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息見表2。使用SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司)進行RT-qPCR；配制RT-qPCR反應液，反應體系為：7.5 μL TB-GreenⅡ?PremixExTaqTM(2×)、0.6 μL上游引物、0.6 μL下游引物、1 μL cDNA和5.3 μL ddH2O；CFX Connect實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)上進行RT-qPCR反應，反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39次循環；95 ℃ 10 s；65～95 ℃ 每0.5 ℃進行1次熒光監測。ACTB為內參基因，每個樣品設置3個重復孔。采用2-ΔΔCt公式計算基因的相對表達水平。

表2 引物信息

1.5 細胞增殖檢測

細胞轉染后按照CCK-8試劑盒和EdU試劑盒(上海百賽生物技術股份有限公司)說明書操作，接種于96孔板，檢測細胞增殖情況。CCK-8檢測：分別于0、24、48、72 h向每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養箱孵育4 h，在450 nm波長下檢測每孔細胞的吸光度值，以0 h作為對照，計算24、48、72 h各組細胞的相對增殖率。EdU檢測：96孔板培養24 h后，每孔加入50 μmol/L EdU試劑100 μL，置于培養箱孵育2 h，按照EdU試劑盒使用說明書進行細胞固定、Apollo染色和DNA染色，隨后熒光顯微鏡下拍照。

1.6 細胞ATP水平測定

細胞在6孔板中轉染后繼續培養24 h，吸棄培養基，1 mL PBS清洗2次，每孔加入200 μL ATP試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)中的ATP裂解液，冰上裂解5 min，收集裂解產物，4 ℃、15 000 r/min離心5 min，后續按試劑盒說明書進行操作。

1.7 流式細胞凋亡檢測

細胞在6孔板中轉染后繼續培養12～24 h，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞沉淀于1.5 mL離心管中；使用Annexin V-Alexa Flour 647/PI Kit凋亡檢測試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)對細胞沉淀進行染色：Binding Buffer、Annexin V-FITC和Propidium Iodide按比例混合，每管細胞沉淀加入200 μL混合液，渦旋混勻，室溫下避光孵育20 min；流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8 Western blot檢測

細胞在6孔板中轉染后繼續培養48 h，收集細胞；加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(北京博奧森生物技術有限公司)裂解細胞獲取蛋白；用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)測定蛋白濃度；蛋白樣品變性后按照12 μg每孔加入10%的SDS-PAGE凝膠[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]中進行電泳；200 mA轉膜1 h；PVDF膜置于孵育盒中，加入10 mL快速封閉液(上海碧云天生物技術有限公司)封閉30 min；去除封閉液，加入10 mL一抗室溫孵育2 h，4 ℃孵育過夜，一抗包括：β-actin(1∶2 000，美國Proteintech Group公司)，SMAD6(1∶500，北京博奧森生物技術有限公司)，BAX(1∶1 000，美國Proteintech Group公司)，Caspase3(1∶1 000，美國Cell Signaling Technology公司)；回收一抗，加入10 mL二抗室溫孵育2～4 h，二抗包括辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶1 000，上海碧云天生物技術有限公司)和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000，上海碧云天生物技術有限公司)；去除二抗，ECL化學發光液(成都正能生物技術有限責任公司)孵育PVDF膜1 min后進行顯影。

1.9 數據統計分析

所有試驗中每個處理組各3個生物重復，即統計結果的每組樣本數為3。Image J軟件進行細胞計數；IBM SPSS Statistics 25進行統計分析，顯著性差異分析用t檢驗，數據以“均值±標準差”形式表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 OE-SMAD6和SMAD6 siRNA的轉染效果

為確定OE-SMAD6的轉染量和SMAD6 siRNA的轉染序列，分別將不同含量的OE-SMAD6、NC、3條不同序列的SMAD6 siRNA和siRNA NC轉染至豬未成熟支持細胞中，采用熒光激發觀察OE-SMAD6轉染情況，結果顯示，3 000 ng OE-SMAD6組中有較強熒光(圖1A)；采用RT-qPCR檢測SMAD6表達情況，結果顯示，3 000 ng OE-SMAD6的SMAD6相對表達量較高且極顯著高于NC組(P<0.01)(圖1B)，SMAD6 siRNA-1組的SMAD6相對表達量最低且極顯著低于siRNA NC組(P<0.01)(圖1C)；采用Western blot檢測SMAD6蛋白的表達情況，結果顯示，3 000 ng OE-SMAD6組的SMAD6蛋白相對表達量顯著高于NC組(P<0.05)(圖1D)，SMAD6 siRNA-1組的SMAD6蛋白相對表達量極顯著低于siRNA NC組(P<0.01)(圖1E)。以上結果表明，轉染3 000 ng OE-SMAD6和SMAD6 siRNA-1后有效影響了豬未成熟支持細胞中SMAD6的表達，后續試驗將選擇3 000 ng作為OE-SMAD6的轉染量，選擇SMAD6 siRNA-1進行SMAD6 siRNA的轉染。

A. 轉染不同含量OE-SMAD6后細胞熒光圖(綠色為OE-SMAD6載體上EGFP在細胞內的表達，標尺=100 μm)；

2.2 SMAD6促進豬未成熟支持細胞的增殖

為明確SMAD6對進豬未成熟支持細胞增殖的作用，在豬未成熟支持細胞中分別過表達SMAD6和干擾SMAD6的表達后檢測細胞增殖情況。采用RT-qPCR檢測周期相關基因(CCND1、CCNE1、CDK4和MYC)和增殖相關基因(EGF、FGF2、PCNA、和GDNF)的表達，結果顯示，過表達SMAD6后周期相關基因和增殖相關基因的相對表達水平均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)(圖2A和B)，干擾SMAD6的表達后周期相關基因和增殖相關基因的相對表達水平均極顯著降低(P<0.01)(圖2C和D)；用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況，結果顯示，轉染OE-SMAD6后24 h時細胞增殖活性顯著升高(P<0.05)，轉染OE-SMAD6后48 h時極顯著升高(P<0.01)(圖2E)，轉染SMAD6 siRNA后48 h和72 h時細胞增殖活性均極顯著下降(P<0.01)(圖2F)；用EdU試劑盒對細胞進行染色，結果顯示，過表達SMAD6后EdU陽性細胞率極顯著升高(P<0.01)(圖2G)，干擾SMAD6的表達后EdU陽性細胞率則極顯著下降(P<0.01)(圖2H)。以上結果表明，SMAD6有促進豬未成熟支持細胞增殖的作用。

A、B. 轉染OE-SMAD6，RT-qPCR檢測細胞周期相關基因和增殖相關基因的相對表達量；C、D. 轉染SMAD6 siRNA，RT-qPCR檢測細胞周期相關基因和增殖相關基因的相對表達量；E、F. 分別轉染OE-SMAD6和SMAD6 siRNA，CCK-8試劑盒檢測細胞增殖倍數；G、H. 分別轉染OE-SMAD6 和SMAD6 siRNA 24 h后，EdU試劑盒檢測細胞增殖情況及統計結果(標尺=1 000 μm)。

2.3 SMAD6抑制豬未成熟支持細胞的凋亡

為明確SMAD6對進豬未成熟支持細胞凋亡的作用，在豬未成熟支持細胞中分別過表達SMAD6和干擾SMAD6的表達后檢測細胞凋亡情況。采用ATP檢測試劑盒測定細胞ATP水平，結果顯示，過表達SMAD6后細胞ATP水平極顯著升高(P<0.01)(圖3A)，干擾SMAD6的表達后細胞ATP水平則極顯著下降(P<0.01)(圖3B)；采用Western blot檢測促凋亡相關蛋白BAX和Caspase3的表達水平，結果的顯示，過表達SMAD6后BAX的表達顯著降低(P<0.05)，Caspase3的表達有所降低但不顯著(P=0.08)(圖3C)，干擾SMAD6表達后BAX和Caspase3的表達均顯著升高(P<0.05)(圖3D)；用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果顯示，過表達SMAD6后細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)(圖3E)，干擾SMAD6表達后細胞凋亡率則顯著上升(P<0.05)(圖3F)。以上結果表明，SMAD6有抑制豬未成熟支持細胞凋亡的作用。

A、B. 分別為轉染OE-SMAD6和SMAD6 siRNA后細胞ATP水平；

3 討論

SMAD家族蛋白是由一系列SMAD家族基因編碼且結構類似的功能性蛋白，主要作用為將TGF-β信號由細胞表面受體傳導至細胞核內[13]。SMAD蛋白主要分為3類：①由SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5、SMAD8和SMAD9組成的通路限制性或受體活化型SMAD(R-SMAD)，其中SMAD2和SMAD3由TGF-β信號激活又稱為AR-SMAD，而其他R-SMAD由BMP(bone morphogenetic protein)信號激活可歸類為BR-SMAD[14]；②共同通路型SMAD(Co-SMAD)，目前已知的Co-SMAD僅包括SMAD4，主要作用為與R-SMAD共同招募調節因子，也是各類TGF-β家族信號傳導所必需的共同介質[15]；③由SMAD6和SMAD7組成的抑制性SMAD(I-SMAD)[16]。 I-SMAD可以通過多種途徑以破壞TGF-β/BMP信號傳統，如I-SMAD保守MH2結構域與1型受體結合而減少R-SMAD對上游信號的傳導，或者與激活的R-SMAD形成異構復合物而抑制R-SMAD與Co-SMAD結合；另外I-SMAD還可以通過招募泛素連接酶以靶向降解激活的R-SMAD[17]。SMAD7能對各類TGF-β信號起到抑制作用，SMAD6則主要是對BMP信號進行抑制進而影響體內多種細胞的增殖、分化與凋亡[18]。

眾多研究表明，SMAD6對細胞增殖有重要影響。Wang等[19]的研究表明，與正常細胞相比，視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)中SMAD6基因表達量顯著上調，但通過干擾BR細胞中SMAD6后發現BR細胞的增殖速度顯著降低。Lu等[20]發現在前列腺癌中HNF1B基因可以直接抑制SMAD6表達進而抑制細胞周期蛋白D1，造成癌細胞增殖速度下降。Wang等[21]使用BMP抑制劑LDN-193189 (LDN)處理胚胎生殖細胞后，細胞中SMAD6基因的表達被完全抑制，并且細胞停滯在有絲分裂期。以上研究說明SMAD6對某些細胞的增殖具有促進作用。本研究也出現類似的結果，在體外培養的豬未成熟細胞中分別過表達SMAD6和干擾SMAD6表達后檢測細胞增殖情況，發現SMAD6對豬未成熟支持細胞的增殖有正向促進作用。

SMAD6對細胞凋亡有重要影響。Jeon等[22]研究表明，SMAD6的敲低激活了c-Jun NH2末端激酶途徑并減少了Rb-1的磷酸化，導致肺癌細胞系H1299凋亡增加。Wu等[23]研究發現，miR-186靶向SMAD6通過絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)激活誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的凋亡。Xu等[24]同樣研究發現，SMAD6作為miR-186的靶標其表達受到抑制而促進膠質瘤U87細胞的凋亡。上述研究結果表明，SMAD6對某些細胞的凋亡具有抑制作用。本研究結果也與之一致，即在體外培養的豬未成熟細胞中分別過表達SMAD6和干擾SMAD6表達后檢測細胞凋亡情況，發現SMAD6對豬未成熟支持細胞的凋亡有抑制作用。