響應面法優化雙黃連口服液醇沉物乳酸菌發酵工藝

王清龍，王坤麗，趙圣振，袁琦昱，湯法銀*

(1. 河南牧業經濟學院，河南 鄭州 450046；2. 河南炎黃生物工程有限公司，河南 新鄉 453000)

2020年以來中國畜牧業步入“飼料端禁抗、養殖端限抗、產品端無抗”快速推進期，中藥作為“替抗”的主力軍，也迎來了高質量發展的大好時機[1]。但中藥屬于資源性產物，加上全球需求逐步增加和養殖成本限制，一定程度上制約著其在畜牧業上的應用發展。而 “不與人藥爭資源”和“吃干榨凈”的系統研發思路[2]，為破除獸用中藥資源和價格瓶頸提供了可能。我國現行藥典和獸藥典中雙黃連口服液制法均采用了水提醇沉法[3-4]，其工業化生產過程會產生大量的絮凝廢棄沉淀物——雙黃連口服液醇沉物，其主要成分為大分子多糖、黏液質、蛋白質等，也包含部分次生代謝活性物如黃酮、生物堿等[5-7]，是潛在的獸用中藥開發資源。同時益生菌發酵中藥，可利用益生菌降解大分子物質，產生小分子活性成分、代謝產物及活性酶等，因而成為“替抗”產品研發熱點[8]。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用碳水化合物產生乳酸的細菌總稱，屬于革蘭陽性菌，兼性厭氧，不產生芽胞。這類菌廣泛分布于自然界中，是人和動物常用益生菌，具有促進消化吸收、維持機體腸道菌群平衡、增強機體免疫力等功能[9]。利用乳酸菌對中藥進行發酵，能提高中藥的藥效，應用于動物能提高動物生產性能和抗氧化能力，調節腸道菌群[10-12]。基于此，本試驗選用乳酸菌對雙黃連口服液醇沉物進行液態發酵，采用響應面法優化發酵工藝制成發酵中藥制劑[13]，不僅能“變廢為寶”，推進中藥制劑工業廢棄物的資源化利用，更拓寬了獸用中藥資源，為中獸醫藥“治未病”的養-調-防-治的健康養殖提供更多可用中藥產品。

1 材料與方法

1.1 雙黃連口服液醇沉物干粉制備

雙黃連口服液醇沉物來自于河南某知名中藥制藥企業，取適量置 105 ℃烘箱中烘至干燥后粉碎，過4號篩即得(水分≤9.0%)。

1.2 乳酸菌種活化

乳酸菌菌種由河南牧業經濟學院發酵中藥實驗室提供。將放于-20 ℃冰箱中乳酸菌甘油凍存管置室溫融化后，劃線接種于固體MRS培養基(北京澳博星生物技術有限公司)，37 ℃倒置培養24 h，再將其轉接至MRS液體培養基，37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養24 h后備用，并吸取菌液置于顯微鏡下進行觀察，確定菌種是否恢復活性。

1.3 雙黃連口服液醇沉物添加量的確定

分別按每組總質量的10%、20%、30%準確稱取雙黃連口服液醇沉物加入發酵瓶中，加水后混勻并滅菌，按總質量6%接種乳酸菌，37 ℃恒溫培養48 h，每組試驗重復3次，以活菌數為指標選取最佳濃度，取平均值作為單因素試驗所用底物濃度。

1.4 發酵液中活菌數的測定

采用平板活菌計數法測量其活菌數[14]。

1.5 單因素試驗優化發酵條件篩選

以活菌數為指標，以優選的添加量、接種量6%、發酵溫度37 ℃和發酵時間48 h為基礎方案，按單因素試驗分別研究接種量2%、4%、6%、8%，發酵時間12 h、24 h、36 h、48 h，發酵溫度27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃對乳酸菌發酵雙黃連口服液醇沉物結果的影響，每組試驗重復3次，取平均值。

1.6 響應面法優化發酵條件設計

參照單因素試驗結果，以接種量(A)、發酵時間(B)和發酵溫度(C)3個因素為自變量，以發酵產物活菌數(Y)為響應值，通過 Design-Expert 11.0軟件，采用 Box-Behnken設計法[15]，對雙黃連口服液醇沉物乳酸菌液態發酵工藝進行響應面優化設計，見表1。

表1 發酵工藝響應面法優化設計與水平

2 結果與分析

2.1 雙黃連口服液醇沉物添加量的確定

試驗結果如圖1所示，當雙黃連口服液醇沉物添加量為20%時，接種量6%，37 ℃恒溫培養48 h后活菌數平均值最大，為2.2×109CFU/mL，而添加量為10%和30%時活菌數均較低，因此確定單因素試驗中所添加的雙黃連口服液醇沉物含量為20%。

圖1 醇沉物添加量對發酵結果的影響

2.2 單因素試驗優化發酵條件

不同接種量、發酵時間和溫度對發酵效果的影響如圖2、圖3和圖4所示，3種因素對乳酸菌液體發酵雙黃連口服液醇沉物均具有影響，且接種量4%時活菌數最大值可達2.47×109CFU/mL，發酵時間24 h時活菌數最大值可達1.86×109CFU/mL，發酵溫度32 ℃時活菌數最大值可達1.95×109CFU/mL。因此單因素試驗確定的最佳條件為接種量4%、發酵溫度32 ℃和發酵時間24 h。

圖2 不同接種量對發酵結果的影響

圖3 不同發酵時間對發酵結果的影響

2.3 響應面法優化

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

采用響應面法所得發酵試驗結果見表2。利用Design-Expert 11.0軟件對表2數據進行BBD分析，可以得到接種量(A)、發酵時間(B)和發酵溫度(C)對發酵終產物活菌數(Y)的響應值回歸方程為：Y=306.80+25.25A+13.31B+7.81C-0.2500AB+1.25AC+1.38BC-135.09A2-37.46B2-28.96C2。

對該回歸方程進行方差分析，結果見表3。由表3數據可知，該二次回歸模型的F值為123.54，P<0.000 1，說明該回歸模型極顯著；失擬項P=0.897 8，說明該模型結果可靠。一次項中的接種量(A)、發酵時間(B)和二次項中的A2、B2、C2的P值均小于0.01，說明這幾項因素對于最終產物的活菌數影響極為顯著，且3個單因素的F值結果可知其影響順序為：接種量(A)>發酵時間(B)>發酵溫度(C)，最佳發酵條件為：接種量4%、發酵時間24 h和發酵溫度32 ℃。

表3 回歸模型方差分析結果

2.3.2 二次回歸模型分析

利用Design-Expert 11.0軟件對表3的二次回歸模型進行分析，可得接種量(A)、發酵時間(B)和發酵溫度(C)3個因素交互影響發酵終產物活菌數的響應曲面圖。

由圖5可知，接種量(A)和發酵時間(B)交互影響所得圖像的等高線趨近于橢圓形且橢圓度較大，其3D圖像坡度較陡，說明這2個因素的交互作用對發酵終產物的影響顯著。由圖6可知，接種量(A)和發酵溫度(C)交互影響的等高線為橢圓形，其3D圖像坡度陡峭，說明這2個因素的交互作用對發酵終產物的影響特別顯著。由圖7可知，發酵時間(B)和發酵溫度(C)的交互影響所得圖像的等高線更近似于圓形并且其3D圖像的坡度相較于前兩組緩和，等高線近乎圓形，足以見得這兩個因素交互作用的影響不如前兩組顯著，不過仍具有一定的影響。由圖5～7可知，發酵終產物的活菌數隨著接種量、發酵時間和發酵溫度的逐漸遞增總體有著上升下降趨勢，說明存在發酵終產物活菌數的極值，且交互作用對其發酵結果影響最大的是接種量和發酵溫度。

圖7 發酵時間和發酵溫度交互作用的響應曲面

2.3.3 最佳發酵條件確定

從單因素試驗結果表明最佳條件為接種量4%、發酵時間24 h和發酵溫度32 ℃時，說明極值點應當存在于附近。利用Design-Expert 11.0軟件可以求出發酵終產物活菌數的極值點，結果接種量4.188%、發酵時間26.165 h、發酵溫度32.710 ℃條件下，發酵終產物活菌數理論極值上可達到3.03×109CFU/mL。考慮到實際生產過程中條件與工藝限制，將最佳發酵條件修正為接種量4%、發酵時間26 h、發酵溫度32.7 ℃。

2.3.4 驗證試驗

按照優化的最佳條件，在實驗室采用10 L發酵罐進行3次平行擴大試驗，結果發酵終產物活菌數的平均值為2.98×109CFU/mL，與響應面預測極值相近，證明該優化條件切實可行。

3 討論

3.1 中藥提取制劑廢棄物開發利用

中藥提取后，藥渣中殘留30%的活性成分[16]。我國中藥制藥產業化過程中，每年產生固體、液體廢棄物及副產物達數億噸，造成中藥資源的嚴重浪費，也對生態環境帶來巨大壓力。基于此，段金廒等[2]提出 “吃干榨凈、物盡其用”的中藥資源循環利用原則，構建了中藥資源全產業鏈廢棄物及副產物的四級分類體系，并提出藥用、飼料化、肥料化等多途徑資源化模式。秦夢等[17]在系統研究的基礎上，提出中藥廢渣在畜禽飼料及添加劑生產等方面具有極大的開發應用潛能，并呼吁相關部門加大中藥廢渣的綜合開發利用，以減少污染保護生態環境，同時實現中藥產業的良性循環發展。研究表明，中藥提取制劑工業廢棄物——醇沉物，含有大量的營養物質和部分免疫活性物質，主要是植物多糖、蛋白質及次級代謝產物[5，18]，具有綜合開發利用價值。植物多糖具有促生長、提高免疫力、抗氧化功能，同時作為益生元能調節腸道菌群和腸道組織形態[19-21]。湯法銀等[22]選用當歸補血口服液制劑的廢棄醇沉物添加在雛雞日糧中，結果與對照組比較，添加醇沉物組的雛雞各方面生長指數及抗體效價均有顯著提高。張麗霞[23]研究發現板藍根水提醇沉物干物質中含有總糖 52.49%，蛋白質13.19%，益生菌發酵后在肉雞飼糧中添加，可顯著提高肉雞平均日增重，降低料重比，同時增強免疫力。隨著研究的深入，水提醇沉法為主制備的多種中藥多糖被證實具有免疫增強等生物活性，并在畜牧業上得到廣泛應用[24-25]，進一步提示中藥提取制劑的醇沉物存在較大的開發潛力。

3.2 影響發酵的因素及條件優化

益生菌發酵中藥與多種因素相關，發酵菌種及數量、發酵溫度、時間、濕度、氧氣等受環境影響較大[26-28]。本研究單因素試驗和響應面法回歸模型均表明，接種量對發酵結果影響顯著，但也并非越多越好，隨著接種量的增加，發酵產物活菌總數反而逐漸下降，其原因可能是因為雙黃連口服液醇沉物所提供的的營養物質會被乳酸菌用來進行呼吸和繁殖，當菌種數量達到一定時就出現了飽和狀態，雙黃連口服液醇沉物所提供的營養物質不足以供養如此數量的菌種，菌種的生長繁殖也會受到抑制，也就是菌種數量超出了底物所能提供的最大限度，不僅發酵結果不佳，還會造成一定程度上的浪費。響應面法回歸模型表明，接種量、發酵時間和發酵溫度對發酵終產物活菌總數的影響都極為顯著，且3個單因素的F值表明其對發酵終產物活菌數的影響順序為：接種量(A)>發酵時間(B)>發酵溫度(C)。然而，利用Design-Expert 11.0軟件進行二次回歸模型進行分析可知：三因素交互作用對發酵結果影響最大的是接種量和發酵溫度，而發酵時間和發酵溫度的交互作用基本不顯著；同時單因素試驗優化最佳條件和響應面法計算極值條件相近，3次平行擴大驗證試驗也表明優化條件可行，因此在發酵條件優化時要充分考慮發酵過程是多種因素互作結果，在科學設計基礎上應充分考慮實際生產條件，實現發酵工藝的效益最大化。

4 結論

本試驗表明，乳酸菌液態發酵雙黃連口服液醇沉物的最佳條件為：醇沉物添加量20%、接種量4%、發酵溫度32.7 ℃、發酵時長26 h。3次平行擴大試驗所得發酵終產物活菌數的平均值為2.98×109CFU/mL。在此條件下利用乳酸菌對雙黃連口服液醇沉物進行發酵，制備發酵中藥制劑，不僅能變廢為寶，避免了中藥制劑工業廢棄殘渣對環境造成的污染，也為其合理開發應用提供了新思路，更為畜牧業健康養殖提供了更多綠色、低廉、有效的中藥或飼料添加劑產品。