4種豬腹瀉病毒恒溫隔絕式熒光RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

侯聞聞，余良政，樊毛迪，朱振邦，林成賢，陳昌海，李向東*

(1. 揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2. 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；3. 揚州大學教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009；4. 金瑞鴻捷(廈門)生物科技有限公司，福建 廈門 361028；5. 江蘇省動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210036)

豬腹瀉病是一類在臨床上十分普遍的疾病，其對仔豬造成的影響較大[1]，給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。臨床上引起豬腹瀉常見的病毒性病原主要包括：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)等[2-4]。PEDV屬于冠狀病毒科、α冠狀病毒屬，是一種單股正鏈 RNA 病毒[5]。自2010年以來，PEDV出現(xiàn)了新型變異毒株，在多個國家大規(guī)模暴發(fā)[6]。TGEV屬于冠狀病毒科、α冠狀病毒屬[7]，我國最早于1956年在廣東省發(fā)現(xiàn)TGEV，近年來，我國大部分省市均有該病的流行，且發(fā)病率呈上升趨勢[8]。PoRV屬于呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬，在世界范圍內(nèi)廣泛存在[9]，我國于1981年報道首次分離到PoRV，目前在全國范圍內(nèi)流行[10]。PDCoV屬于冠狀病毒科、δ冠狀病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒[11]，近年來在我國各地豬場廣泛存在[12]。這4種病原引起的癥狀十分相似，都表現(xiàn)為腹瀉、脫水，體重減輕等，在臨床上需要加以鑒別診斷。現(xiàn)有對上述4種豬腹瀉病毒的檢測方法包括傳統(tǒng)的RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR等，但上述方法操作較為復雜，操作人員要經(jīng)過專業(yè)培訓，不能用于現(xiàn)場操作，且耗時較長，在突發(fā)疫情時不能進行快速診斷以達到及時撲滅疫情的目的。新型恒溫隔絕式熒光RT-PCR(iiRT-PCR)檢測方法，利用Rayleigh-Bernard自然對流原理，通過底部的單一熱源進行加熱，使得R-tube底部的溫度能夠維持在95 ℃，而R-tube上部的溫度處于自然冷卻狀態(tài)，上下的溫度差形成自然的熱對流，形成可供PCR擴增反應(yīng)的連續(xù)溫度梯度[13]。這種自然對流促進了反應(yīng)液的自發(fā)循環(huán)，擴增效率高，可在42 min內(nèi)完成檢測。該檢測方法借助于POCKITTMMicro Duo手持式核酸分析儀，儀器重量僅為430 g，電源為鋰電池，可充電使用，并且檢測結(jié)果以“+”(陽性)、“-”(陰性)和“？”(可疑)的形式直接顯示，便于非專業(yè)人員讀取結(jié)果，給現(xiàn)場檢測帶來了極大的便利。本研究擬開發(fā)針對上述4種病毒性腹瀉病原的iiRT-PCR方法，用于臨床現(xiàn)場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒與臨床樣品

TGEV、PEDV、PoRV(G5型)三聯(lián)活疫苗(弱毒華毒株+弱毒CV777株+NX株)購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；PDCoV、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、日本腦炎病毒(JEV)保存于本實驗室；臨床樣品來自于江蘇省某豬場。

1.2 主要試劑

rTaq酶購自TaKaRa公司；DL2000 Plus DNA Marker購自諾唯贊生物科技有限公司；Uni-iiPCR Starter Kit購自中國臺灣瑞基海洋生物科技公司。

1.3 主要儀器

POCKITTMMicro Duo手持式核酸分析儀購自中國臺灣瑞基海洋生物科技公司；熒光定量PCR儀購自Thermo Fisher Scientific；電泳儀和凝膠成像儀均購自上海天能科技有限公司。

1.4 引物和探針的合成

下載NCBI GenBank中PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV毒株基因組序列至少各20條進行比對與分析，并選擇最保守的PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因區(qū)域設(shè)計引物和探針(表1)，引物和探針由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 4種豬腹瀉病毒iiRT-PCR引物與探針信息

1.5 核酸提取

用TRIzol法提取TGEV、PEDV、PoRV、PDCoV、CSFV、PRRSV、JEV的RNA，將上述病毒的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 反應(yīng)體系優(yōu)化

按Uni-iiPCR Starter Kit說明書的建議對反應(yīng)體系進行優(yōu)化。反應(yīng)總體系為50 μL，用方陣法分別對上下游引物濃度10 μmol/L(1.25～5 μL)、探針濃度10 μmol/L(0.25～2.5 μL)，Taq聚合酶5 U/μL(1～5 μL)、反轉(zhuǎn)錄酶20 U/μL(0.5～2 μL)進行優(yōu)化。

1.7 特異性評價

以PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、CSFV、PRRSV、JEV的RNA為模板，以Nuclease-free水為陰性對照，按照1.6中確立的最佳反應(yīng)條件，分別用PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的4對引物對上述模板和陰性對照進行iiRT-PCR檢測，并使用2%瓊脂糖凝膠對iiRT-PCR產(chǎn)物進行電泳，陽性擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序，以評價4種病毒的引物特異性。

1.8 敏感性評價

將PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV的RNA進行10倍倍比稀釋至10-5作為模板，以Nuclease-free H2O為模板作為陰性對照，用建立的iiRT-PCR方法進行檢測，測定該方法的檢測下限。將PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV的cDNA按10倍倍比稀釋至10-5作為模板，Nuclease-free H2O為模板作為陰性對照，用相同引物和探針分別建立4種豬腹瀉病毒熒光定量RT-PCR方法，檢測熒光定量RT-PCR方法的下限，并將2種方法得到的檢測下限對比，以評價iiRT-PCR方法的敏感性。

1.9 穩(wěn)定性評價

采用建立的iiRT-PCR方法分別對4種腹瀉病毒的5個稀釋度(10-1～10-5倍稀釋)的RNA進行檢測，每種濃度的RNA模板重復檢測3次，檢測其批內(nèi)重復性；另外，以這些RNA為模板在不同時間進行3次獨立檢測，每次間隔1 d，檢測其批間重復性。

1.10 臨床樣品的檢測

對采自江蘇省不同豬場的22份腹瀉臨床樣品，分別用本研究建立的iiRT-PCR方法和熒光定量RT-PCR方法進行檢測，比較2種方法檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系優(yōu)化

分別對PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV 4種豬腹瀉病毒iiRT-PCR方法的引物、探針、Taq聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶進行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系為50 μL：Uni-ii Buffer(2×)為25 μL，上、下游引物均為5 μL(終濃度均為1 μmol/L)，探針0.25 μL(終濃度為0.05 μmol/L)，Taq聚合酶1 μL(終濃度為0.1 U/μL)，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶1.25 μL(終濃度為0.5 U/μL)，Nuclease-free H2O為10.5 μL，RNA模板為2 μL。

2.2 特異性試驗

用本研究建立的4種豬腹瀉病毒iiRT-PCR方法分別對PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV陽性樣品進行檢測，同時對其他常見豬病毒性病原包括PRRSV、CSFV、JEV進行檢測，并對iiRT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的引物和探針分別特異性地擴增PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV陽性樣品，而無法擴增其他無關(guān)病原和陰性對照，其陽性擴增產(chǎn)物片段分別在83、89、91、99 bp(圖1)，符合預(yù)期大小。對陽性擴增產(chǎn)物測序結(jié)果進行分析證實檢測無誤，說明該方法特異性強。

A. PEDV iiRT-PCR方法特異性驗證，其中：M. Marker，P. PEDV(陽性對照)，N. Nuclease-free H2O(陰性對照)，1～6. 依次為TGEV、PoRV、PDCoV、PRRSV、CSFV、JEV；

2.3 敏感性試驗

分別將商品化PEDV、TGEV、PoRV三聯(lián)弱毒疫苗(105TCID50/mL)和實驗室保存的PDCoV(106TCID50/mL)提取的RNA進行10倍倍比稀釋(10-1～10-5)，并以此為模板，用建立的iiRT-PCR方法進行檢測，結(jié)果顯示4種豬腹瀉病毒iiRT-PCR方法檢測下限分別為102、102、103、103TCID50/mL。

建立的熒光定量RT-PCR方法的反應(yīng)體系為：rTaq酶10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.2 μL，10 μmol/L探針0.2 μL，模板2 μL，使用Nuclease-free H2O補足至20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，同時收集熒光信號。Ct≤35時判定為陽性樣品。其檢測PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV cDNA下限分別為101、102、102、102TCID50/mL。

2種方法檢測結(jié)果顯示iiRT-PCR方法檢測的敏感度略低于熒光定量RT-PCR方法(圖2)。

1～5. 依次為10-1～10-5倍稀釋；6. 陰性對照。

2.4 重復性試驗

采用建立的iiRT-PCR方法對2.3中使用的病毒5個稀釋度進行批內(nèi)和批間重復性試驗，結(jié)果表明批內(nèi)3個平行和批間3次重復試驗結(jié)果完全一致，證明建立的方法具有良好的重復性。

2.5 臨床樣品的檢測情況

本研究建立的iiRT-PCR方法與熒光定量RT-PCR方法檢測臨床樣品的結(jié)果一致，檢測的22份臨床腹瀉樣品中，PEDV陽性樣品9份(陽性率為 40.91%)、TGEV陽性樣品2份(陽性率為 9.09%)、PoRV陽性樣品10份(陽性率為45.45%)、PDCoV陽性樣品為2份(陽性率為 9.09%)。其中，PEDV與PoRV混合感染陽性樣品4份(18.18%)，PDCoV與PoRV混合感染陽性樣品1份(4.55%)。2種方法檢測結(jié)果符合率為100%，表明本研究中建立的iiRT-PCR方法準確可靠。

3 討論

由PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV 4種豬腹瀉病毒引起的臨床表現(xiàn)十分相似，仔豬大都表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水等，僅通過臨床癥狀和病理剖檢難以區(qū)分這些病毒引起的疾病。目前已有建立這4種病毒的多重RT-PCR及多重熒光定量RT-PCR方法的報道[14-16]，也有PEDV等病毒單重iiRT-PCR方法建立的報道[17-18]。而本研究首次從腹瀉癥候群角度建立針對這4種病原的iiRT-PCR方法，通過一次iiRT-PCR檢測即可診斷是由上述4種病原中的哪種病毒引起的腹瀉。

傳統(tǒng)的普通PCR方法和實時熒光定量PCR方法需要專門的實驗室設(shè)備，操作步驟較為繁瑣，且檢測耗時較長，無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測。而iiPCR的儀器重量輕，體積小，便于攜帶，并且操作簡單，檢測速度快，結(jié)果直接，無需進行瓊脂糖凝膠電泳，從而避免了交叉污染。目前國內(nèi)外已有針對嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、非洲豬瘟病毒等iiPCR方法建立的報道[19-21]。本研究針對PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因設(shè)計了特異性的引物和探針，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件后，建立了針對這4種豬腹瀉病原的iiRT-PCR方法，通過試驗驗證了該方法的特異性、敏感性和重復性。但同時需要注意的是，該方法也存在一定的不足之處，如：iiPCR需要專門的試劑和R-tube管，檢測成本與普通PCR和熒光定量PCR相比較高。iiPCR檢測更適合由DNA病毒引起的重大動物疫病，如非洲豬瘟的現(xiàn)場快速診斷和拔牙式清除[20]。

對于豬腹瀉病毒混合感染的報道很多。施開創(chuàng)等[14]檢測的廣西省243份臨床腹瀉樣品中，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV混合感染陽性樣品8份(3.29%)；丁慶文等[22]檢測的92份豬腹瀉樣品中，PEDV與PDCoV混合感染率為20.65%；許夢怡等[23]檢測的40份腹瀉豬病料中，TGEV 與 PEDV 混合感染率為2.5%，PEDV 與 PoRV 混合感染率為5%。本研究對22份豬腹瀉臨床樣品進行檢測，也發(fā)現(xiàn)了有混合感染的情況存在，其中PEDV與PoRV混合感染陽性樣品4份(18.18%)，PDCoV與PoRV混合感染陽性樣品1份(4.55%)，說明臨床上豬腹瀉病毒混合感染的情況十分普遍，這也給腹瀉疾病的診斷和防控造成一定的困難，應(yīng)該引起重視。