阿卡斑病毒培養(yǎng)特性和滅活疫苗免疫效果評估

謝佳芮，寇美玲，高華峰，高林，陳文瑾，苗海生

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224)

阿卡斑病 (Akabane disease)又名赤羽病，是由阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)引起的一種病毒病，主要感染牛羊，以流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、木乃伊胎、新生胎兒發(fā)生關(guān)節(jié)彎曲和積水性無腦綜合征(AH 綜合征)為特征，主要傳播媒介為吸血昆蟲。阿卡斑病毒隸屬泛布尼亞病毒科(Peribunyaviridae)、正布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)、辛波血清群(Simbu)，是單股負(fù)鏈RNA病毒。該病毒最早于1959年在日本群馬縣赤羽村的金色庫蚊和三帶喙庫蚊體內(nèi)分離獲得，其后在韓國、臺灣、土耳其、以色列及澳大利亞先后發(fā)現(xiàn)該病毒，其中2002—2006 年間在日本發(fā)生14次疫情，給日本牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的損失[1-4]。我國云南、廣西、陜西、內(nèi)蒙古、湖南、河北、山東、上海、吉林等地區(qū)也相繼檢測或分離到該病毒[5-7]。

阿卡斑病與其他多數(shù)病毒病一樣，無特效治療藥物，主要通過接種疫苗進(jìn)行防控，但由于多數(shù)動物感染后臨床癥狀不明顯，因此極易造成誤診，被發(fā)現(xiàn)時往往已成大流行態(tài)勢。目前，國外已開發(fā)出多種弱毒苗和滅活苗，減毒活疫苗已在日本使用，滅活疫苗已在澳大利亞、日本和韓國使用。日本開發(fā)了利用HmLu-1細(xì)胞傳代致弱的減毒活疫苗，但是該疫苗用本國毒株制備[8]，對中國流行毒株的免疫效果無評價結(jié)果。目前，國內(nèi)未見有商品化阿卡斑疫苗批準(zhǔn)和相關(guān)研究報道，因此亟需針對我國流行毒株開發(fā)安全、高效的疫苗。本研究應(yīng)用3種細(xì)胞分別對阿卡斑病毒CX-01株進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用BEI滅活劑進(jìn)行滅活，評價病毒增殖滴度，探索滅活程序，并利用小鼠模型評價了ISA 206佐劑滅活疫苗的免疫效力。

1 材料與方法

1.1 阿卡斑病毒毒株培養(yǎng)及組織半數(shù)感染量(TCID50)檢測

阿卡斑病毒CX-01株于2019年分離自云南省楚雄州一羊場，由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室鑒定保藏，同時保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為：CGMCC No.45207，可適應(yīng)BHK-21、Vero和HmLu-1細(xì)胞培養(yǎng)。擴(kuò)繁病毒時，首先將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長滿單層的BHK-21、Vero和HmLu-1細(xì)胞接種適量的阿卡斑病毒種毒，再補(bǔ)加MEM維持液，以種毒和MEM維持液混合后病毒的初始滴度不低于104.5TCID50/mL為準(zhǔn)，置37 ℃溫箱培養(yǎng)，當(dāng)觀察到70%～80%細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE)時收獲病毒培養(yǎng)液，凍融1次后，3 000 r/min離心30 min，上清液即為制備滅活疫苗的病毒液，進(jìn)行TCID50檢測。

TCID50檢測方法：將待檢病毒液用無血清MEM培養(yǎng)基作10-1～10-6連續(xù)倍比稀釋，加入提前準(zhǔn)備長滿上述相應(yīng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每個稀釋度加4孔，每孔0.1 mL，然后每孔補(bǔ)加0.1 mL無血清MEM培養(yǎng)基，置5%二氧化碳37 ℃溫箱中培養(yǎng)。5 d后觀察細(xì)胞病變，K?rber法計算TCID50。

1.2 主要試劑和實驗動物

主要試劑：BEA(二乙烯亞胺)、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、ISA 206佐劑、分析純左旋咪唑鹽酸鹽，購自云南豐科生物科技有限公司。蔗糖、海藻糖購自昆明諾華生物科技有限公司。實驗動物為BALB/c小鼠，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，小鼠實驗在云南生物制藥有限公司實驗動物中心進(jìn)行。

1.3 病毒增殖特征

應(yīng)用已經(jīng)適應(yīng)HmLu-1、Vero、BHK-21細(xì)胞的阿卡斑病毒CX-01種毒，分別接種3種細(xì)胞測定病毒增殖規(guī)律，以確定病毒在不同傳代細(xì)胞上的增殖特性。將上述3種細(xì)胞培養(yǎng)的種毒分別作病毒滴度(TCID50)檢測，并用無血清MEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使培養(yǎng)液內(nèi)的病毒最終滴度為104.5TCID50/mL，分別加入到對應(yīng)長滿單層細(xì)胞的HmLu-1、Vero、BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37 ℃溫箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72、84、96、108和120 h取樣，每次取樣0.5 mL，同時補(bǔ)加0.5 mL的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液。取樣完成后分別用HmLu-1、Vero、BHK-21細(xì)胞對相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的病毒樣品進(jìn)行TCID50檢測。

1.4 病毒滅活

制備0.2 mol/L的BEI滅活劑，具體方法為：在1.6%氫氧化鈉溶液中加入4.1%的二乙烯亞胺，充分溶解，置37 ℃ 1.5 h進(jìn)行環(huán)化，期間每15 min劇烈晃動10 s，反應(yīng)結(jié)束后即得到0.2 mol/L的BEI滅活劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，共制備3個批次。將病毒滴度106.75TCID50/mL的病毒液平均分為3份，每份30 mL。首先將3批次待滅活的病毒懸液置37 ℃水浴鍋中，使病毒液溫度達(dá)到37 ℃，然后將0.2 mol/L BEI滅活劑按照1%的量加到病毒液中，即BEI終濃度為0.002 mol/L，置37 ℃溫箱中緩慢攪拌滅活。分別在滅活0、1、2、3、4、5、6、7和8 h時各取樣5 mL，并添加2 mol/L的硫代硫酸鈉溶液10 μL到樣品內(nèi)，終止滅活反應(yīng)，4 ℃保存待檢。所有樣品用無血清MEM培養(yǎng)液分別作10-1～10-6倍比梯度稀釋，進(jìn)行TCID50檢測。

1.5 不同疫苗添加劑對免疫效果的影響

將滅活好的阿卡斑病毒液分為4份，每份10 mL。為評估疫苗添加劑蔗糖、海藻糖和左旋咪唑?qū)π∈竺庖咝Ч挠绊懀囼炘O(shè)4個不同添加劑配方組別：第1組為10 mL病毒；第2組為10 mL病毒液+0.5 mL蔗糖+0.5 mL海藻糖；第3組為10 mL病毒液+0.5 mL蔗糖+0.5 mL海藻糖+1%左旋咪唑(0.11 g)；第4組為10 mL病毒液+1%左旋咪唑(0.1 g)；第5組為對照組，為HmLu-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液。然后按照體積比1∶2的量加入ISA 206佐劑攪拌乳化，4～6 ℃放置30 d后進(jìn)行疫苗免疫試驗。每種疫苗接種5只小鼠，每只小鼠皮下接種0.2 mL，21 d后心臟采血分離血清，進(jìn)行中和抗體檢測。

中和試驗方法為：在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上將待檢血清作1∶4～1∶512倍比稀釋，應(yīng)用100 TCID50的病毒液在5%二氧化碳37 ℃溫箱中進(jìn)行中和反應(yīng)1 h，然后以HmLu-1細(xì)胞作為感作細(xì)胞，每孔加100 μL細(xì)胞生長液(約含1×104個細(xì)胞)，5%二氧化碳、37 ℃溫箱培養(yǎng)5 d后判定結(jié)果，K?rber法計算中和抗體效價。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SSPS軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較檢驗，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 病毒培養(yǎng)和毒價檢測

阿卡斑病毒滴度(TCID50/mL)檢測結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，HmLu-1、Vero、BHK-21細(xì)胞均在84～96 h時滴度最高，其中HmLu-1細(xì)胞培養(yǎng)病毒滴度最高為106.75TCID50/mL。

表1 3種細(xì)胞擴(kuò)繁病毒滴度檢測結(jié)果-lg TCID50/mL

2.2 病毒滅活時間確定

用終濃度為0.002 mol/L的BEI對3個批次的病毒液進(jìn)行滅活、取樣，每次取樣后加終止液終止反應(yīng)。表2結(jié)果顯示，3批次抗原在滅活5 h后TCID50均為0，即病毒液不再感染細(xì)胞。為確保對阿卡斑病毒的滅活完全徹底，在BEI滅活劑用量和滅活條件不變的前提下，選擇最優(yōu)的滅活時間即8 h，其中第5小時后更換滅活用容器(瓶)1次。

表2 不同滅活時間TCID50檢測結(jié)果-lg TCID50

2.3 免疫效果評估

中和試驗結(jié)果顯示(見表3)，1～4組均不同程度出現(xiàn)中和抗體，對照組(5組)未出現(xiàn)中和抗體。其中第3組免疫效果最好，平均中和抗體滴度為18.0，極顯著高于第1組(P<0.01)，顯著高于第2組和第4組(P<0.05)。表明阿卡斑病毒滅活后需添加蔗糖、海藻糖、左旋咪唑穩(wěn)定抗原并提高機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答。

表3 阿卡斑病毒滅活疫苗不同添加劑免疫效果比較

3 討論

隨著赤羽病在世界許多地區(qū)的廣泛流行，病毒基因組和致病性也在不斷演化，在韓國、日本和臺灣已發(fā)現(xiàn)變異株，其對犢牛和成年牛的致病性增強(qiáng)，并可引起新生犢牛腦炎癥狀[9]。2016年在廣西發(fā)現(xiàn)可以感染竹鼠的致病性毒株[10]，2021年9月至2022年1月，我國東北地區(qū)多地發(fā)生疑似阿卡斑病毒致病的疫情[11]。云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院應(yīng)用cELISA方法對2019—2020 年采自云南省邊境地區(qū)10個縣市的牛群血清樣品進(jìn)行AKAV 抗體檢測與分析，結(jié)果在采集的4 437份牛血清樣品中檢出抗體陽性樣品1 367 份，平均抗體陽性率為30.81%[12]。

本研究選用的毒株為2019年分離自山羊血液的CX-01毒株，通過對S和M基因片段的比較，該毒株屬于基因群Ia，與所有中國已報道毒株序列屬同一遺傳譜系，并且該毒株易持續(xù)性擴(kuò)繁，因此該毒株作為中國疫苗用毒株具有一定的優(yōu)勢。目前國外已有阿卡斑病毒滅活疫苗制備的報道[13-15]，Yang等[15]用BEI和甲醛分別對阿卡斑病毒滅活，制備疫苗后接種豚鼠和懷孕母牛，發(fā)現(xiàn)2種滅活方法對免疫效果無顯著差異，一次免疫后抗體效價高于8，二次免疫后最高中和抗體效價均可達(dá)64 。由于甲醛主要是通過病毒衣殼蛋白的交聯(lián)反應(yīng)使蛋白質(zhì)變性阻止核酸的釋放，BEI則直接破壞病毒核酸，避免了破壞衣殼表面抗原和病毒返強(qiáng)，選擇適當(dāng)?shù)挠昧靠稍? h內(nèi)滅活病毒，保證了病毒衣殼蛋白的穩(wěn)定性。同樣規(guī)格的BEI滅活劑，不同廠家或不同批次不可避免的存在純度、活性方面的細(xì)微差異，在滅活劑配制過程當(dāng)中由不同人員操作也會有差異。本研究中使用的溫箱與其他研究人員使用的溫箱或溫室可能會存在溫度上的差異，并且病毒液用量不同時，特別是大容量培養(yǎng)時溫度傳導(dǎo)較慢，影響滅活效果。作者曾長期開展口蹄疫等重大動物疫病滅活疫苗研究，比如口蹄疫病毒一般37 ℃ 6 h可完全滅活，但實際生產(chǎn)過程中均需要12 h以上來確保安全。因此，適當(dāng)延長病毒的滅活時間是滅活疫苗制備常識，雖然阿卡斑病非重大動物疫病，但適當(dāng)?shù)难娱L病毒滅活時間也是必要的，綜合考慮滅活效果與病毒穩(wěn)定性的關(guān)系，確定滅活8 h比較合理。本研究選擇了該種滅活方法進(jìn)行研究，為阿卡斑病毒滅活疫苗制備提供了一種新的滅活方案。由于受研究條件限制，選擇了BALB/c小鼠作為動物模型進(jìn)行試驗，雖然不能完全體現(xiàn)大動物的實際免疫效果，但是在一定程度上可展示出滅活疫苗和添加劑的作用，為后續(xù)試驗提供參考。研究中，蔗糖和海藻糖作為抗原保護(hù)劑已得到了共識，左旋咪唑作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能[16]，本研究是對其增強(qiáng)抗體分泌功能的一種嘗試性使用，至少證明在阿卡斑病毒滅活疫苗中配合使用是有突出效果的。

阿卡斑病毒在我國多地特別是熱帶亞熱帶地區(qū)呈現(xiàn)流行性分布，目前已有毒株致病力普遍較弱，多數(shù)動物在感染6 d后轉(zhuǎn)歸良好，但隨著病毒基因組的不斷變異和重組，不排除未來高致病性毒株的出現(xiàn)，因此對毒株和滅活疫苗制備技術(shù)的研究具有重要意義。