兔出血癥病毒1、2型雙重TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法的建立和應用

王冠萱, 陳萌萌, 仇汝龍, 范志宇, 胡 波, 宋艷華, 魏后軍, 葛 雷, 徐為中, 王 芳, 錢鶯娟

(1.江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業農村部獸用生物制品工程重點實驗室,江蘇南京 210014;2.南京農業大學動物醫學院/教育部動物健康與食品安全國際合作聯合實驗室/農業農村部動物細菌學重點實驗室,江蘇南京 210095)

兔出血癥(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是一種急性、烈性、高度接觸性傳染病[1-4],由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起。于1984年首次在中國發現[2],并迅速傳播至歐洲、澳大利亞、非洲等地[3,5-6],該疾病死亡率高達90%,嚴重危害養兔業的發展[3]。2010年,一種新的RHDV毒株在法國被發現,不同于經典RHDV毒株的血清型,被命名為RHDV2[7]。目前,RHDV2在歐洲、亞洲、非洲、澳大利亞、北美等地廣泛流行[5,8],并逐漸取代經典RHDV和RHDVa成為當地的優勢毒株[8-9]。我國于2020年出現由RHDV2毒株引起的RHD暴發[10],由于目前使用的針對經典RHDV毒株制備的疫苗對RHDV2的交叉保護效果有限[11-12],導致RHDV2在國內迅速流行,國內呈現經典RHDV和RHDV2這2種基因型共同流行的情況。

RHDV是杯狀病毒科(Calicivirus)[13]兔病毒屬(Lagovirus)成員,目前引起RHD的RHDV有GI.1和GI.2這2個基因型。截至2010年,經典RHDV分離株屬于GI.1基因型。 2010年,在歐洲發現了一種新的變異RHDV,該毒株在系統發育和抗原方面與GI.1基因型不同,被命名為RHDV2或RHDVb,屬于GI.2基因型[7,14]。RHDV為單股正鏈RNA病毒[1],基因組全長為7437個核苷酸,衣殼由單個結構蛋白VP60構建[15],包含有2個開放閱讀框(ORF)[16]。

感染RHDV1和RHDV2的家兔臨床癥狀相似,均會出現死亡、厭食、發熱等癥狀,剖檢可見肝臟出血、壞死,脾腫大,全身彌漫性血管內凝血(DIC)[3,17-18]等,所以僅靠臨床癥狀無法準確區分,需要依靠分子生物學診斷技術進行鑒別[19]。TaqMan RT-qPCR技術與普通RT-PCR相比,具有污染少、定量準確、實時檢測、敏感性高等優點[20-21],而且可以在同一個反應管中同時檢測多種基因,大大提高了反應效率[21]。因此本研究采用TaqMan RT-qPCR 技術建立一種可以在同一個反應管中鑒別RHDV1和RHDV2型病原的方法,以便于臨床和實際生產中兔出血癥的快速診斷和防控。

1 材料與方法

1.1 病毒株與樣品

兔出血癥病毒1型(RHDV1)、兔出血癥病毒2型(RHDV2)、輪狀病毒(Rotavirus,RV)、兔支氣管敗血波氏菌、兔多殺性巴氏桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌cDNA由筆者所在實驗室保存。臨床待檢樣品來自2021年12月之后山東、福建等地養兔場送檢的疑似RHDV感染兔肝臟及筆者所在實驗室模擬動物試驗中獲取的鼻肛拭子。

1.2 試劑與儀器

RNAiso Plus(病毒RNA提取試劑)從TaKaRa公司購買,HiScriptⅡ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(反轉錄試劑)、AceQ qPCR Probe Master Mix(TaqMan熒光定量試劑盒)均從諾唯贊生物有限公司購入;凝膠成像儀從上海天能(Tanon)科技有限公司購入。 電泳儀購自(Bio- Rad)公司。QuantStudio 1 熒光定量 PCR 儀從美國Applied Biosystems公司購入。PCR 儀從艾本德(Eppendorf)中國有限公司購入。

1.3 引物和探針

根據GenBank中的RHDV1分離株WF 2007(登錄號:FJ794180)和RHDV2分離株SC 2020/04(登錄號:MT383749)的基因序列,利用Primer Express3.0.1軟件針對保守VP60基因序列設計2組特異性引物和TaqMan探針(表1)。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 RHDV1型和RHDV2型TaqMan qPCR 特異性引物與TaqMan探針

1.4 標準質粒的構建

采用RHDV1分離株WF2007、RHDV2分離株SC 2020/04的VP60基因全長引物克隆目的基因,將獲得的基因序列連接到pMD18-T載體上,將篩選驗證成功的pMD18-T-WF2007-VP60、pMD18-T-SC2020-VP60質粒送去生物公司進行測序,將測序結果進行比對符合預期結果。測定重組質粒濃度并計算拷貝數,用ddH2O稀釋為1×1010copies/μL,作為模板標準品。

1.5 雙重 TaqMan qPCR體系和反應條件的優化

以“1.4”節中質粒標準品為模板,按照TaqMan熒光定量試劑盒說明書進行擴增,總反應體系為 20 μL。對退火溫度(55～65 ℃)、引物濃度(0.1～1 μL)、探針濃度(0.1～1 μL)進行優化,確定最佳反應體系和條件。

1.6 雙重 TaqMan qPCR 標準曲線的建立

將“1.4”節中稀釋后的2種質粒標準品1 ∶ 1混合后進行10倍倍比稀釋,選擇1×108～1×104copies/μL 5個梯度質粒標準品作為陽性模板進行擴增。根據熒光定量 PCR 儀自帶軟件 Quant StudioTMDesign &Analysis Software 自動生成標準曲線。

1.7 特異性試驗

以兔多殺性巴氏桿菌、兔支氣管敗血波氏菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、輪狀病毒(RV)的基因組DNA為模板,以雙蒸水為陰性對照,以構建的RHDV1型和RHDV2型標準品質粒1 ∶ 1混合后作為陽性對照模板,進行熒光定量PCR特異性檢測。

1.8 敏感性試驗

以1×108copies/μL作為2種質粒標準品的起始濃度,進行10倍倍比稀釋,使用1×108～1×101copies/μL 的混合質粒作為反應模板,以ddH2O為陰性對照模板,進行TaqMan RT-qPCR和普通RT-PCR擴增,檢測其敏感性。

1.9 重復性試驗

以1×106～1×104copies/μL的混合質粒為模板進行TaqMan RT-qPCR擴增,分別進行組內和組間重復性試驗,整理CT值并計算變異系數,評價其重復性。

1.10 臨床樣本的檢測

使用本研究建立的TaqMan雙重熒光定量 RT-PCR 方法和普通RT-PCR方法對2021年12月之后收到的來自山東、福建等地的疑似RHDV感染的家兔肝臟樣品、鼻肛拭子以及以及筆者所在實驗室模擬動物實驗的樣本進行檢測,比較本研究建立的方法與常規 RT-PCR 方法的檢出率。

2 結果與分析

2.1 雙重 TaqMan qPCR 反應體系及參數優化

優化后的20 μL反應體系:2×AceQ qPCR Probe Master Mix10 μL,1型上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L),2型上下游引物各0.2 μL(10 μmol/L),RHDV-1-Probe 0.2 μL(10 μmol/L),RHDV-2-Probe 0.2 μL(10 μmol/L),50×ROX ReferenceⅠ 0.4 μL,質粒cDNA模板2 μL,dd2O 6 μL。反應程序:95.0 ℃預變性5 min;95.0 ℃10 s,60 ℃ 30 s,40個循環。

2.2 雙重 TaqMan qPCR 標準曲線的建立

將10倍倍比稀釋的1×108～1×104copies/μL混合質粒按照優化后的反應體系和參數進行擴增,軟件自動生成標準曲線(圖1):RHDV1型標準曲線決定系數r2=0.999,標準方程為y= -3.347x+14.764,目的基因的擴增效率為98.952%;RHDV2型標準曲線決定系數r2=0.999,標準方程為y= -3.331x+9.833,目的基因的擴增效率為99.615%。結果顯示,本研究建立的兔出血癥病毒1、2型TaqMan雙重熒光定量 PCR 方法有良好的線性關系。

2.3 雙重 TaqMan qPCR 的特異性試驗

用“1.5”節優化好的體系及參數對兔支氣管敗血波氏菌、兔多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、輪狀病毒(RV)進行檢測,同時設置陰陽性對照,結果(圖2)顯示,除RHDV1型、RHDV2型產生特異性的擴增曲線外,其他病原體及雙蒸水均不產生擴增曲線,說明該方法具有良好的特異性。

2.4 雙重 TaqMan qPCR 的敏感性試驗

選取稀釋度為1×108～1×101copies/μL的質粒作為模板進行TaqMan RT-qPCR和常規RT-PCR擴增。RT-qPCR擴增結果顯示,該方法的敏感性可達到100～1 000 copies/μL;普通RT-PCR結果顯示,當質粒pMD-18T-WF濃度在1×104copies/ μL、pMD-18T-SC濃度在1×103copies/μL 時有模糊的目的條帶出現。由此可見,TaqMan qPCR 的靈敏度約為常規PCR的10～100倍(圖3)。

2.5 雙重 TaqMan qPCR 的重復性檢測

2種重組質粒分別選取106、105、104這3 個稀釋度,每個稀釋度重復3次,進行重復性試驗。并根據熒光定量PCR 得到的CT值,計算結果見表2。結果顯示,組內和組間的重復試驗變異系數在0.01%～1.61%之間,說明該雙重熒光定量PCR方法重復性良好。

表2 雙重 TaqMan qPCR 的重復性試驗

2.6 臨床樣本檢測

利用已經建立的TaqMan RT-qPCR和常規 RT-PCR 方法分別對來自全國不同兔場疑似RHDV感染的49份臨床樣品以及筆者所在實驗室保存的42份鼻肛拭子進行檢測。TaqMan RT-qPCR方法檢測49份臨床肝臟樣品,檢出14份RHDV1型,19份RHDV2型,2份RHDV1、2型混合感染;檢測42份鼻肛拭子樣品,檢出3份RHDV1型,19份RHDV2型;用常規RT-PCR方法檢出12份RHDV1型,15份RHDV2型;鼻肛拭子中檢出0份RHDV1型,10份RHDV2型(表3)。 結果顯示,本試驗建立的雙重熒光定量PCR方法的敏感性顯著高于普通RT-PCR。

表3 臨床樣品的檢測結果

3 討論

2020年至今,RHDV2型已在我國發生了廣泛的流行,相比于RHDV1型,RHDV2型不僅感染成年家兔,還可以感染幼年家兔和野兔[12],嚴重危害養兔業的發展和自然生態環境。目前,我國已有建立的單獨檢測RHDV1型的診斷方法,如RT-PCR方法[22]、ELISA方法[23]等,但均無法應用于RHDV2型的檢測。筆者所在實驗室建立了單獨檢測RHDV2型的TaqMan qPCR方法[19],但是無法同時檢測2種不同血清型的RHDV,不利于疫病的檢測和診斷。因此,建立一種可以同時檢測RHDV1型和RHDV2型的方法來應對RHD的診斷和防控十分必要。

應用軟件Primer Express 3.0分別針對RHDV1型和RHDV2型保守的VP60序列設計引物和探針,篩選出最合適的引物和探針,并優化反應條件和反應體系,成功建立了雙重TaqMan RT-qPCR方法。繪制RHDV1型和RHDV2型標準曲線,決定系數r2均為0.999,可見線性關系良好;使用該TaqMan RT-qPCR 方法檢測RHDV1型、RHDV2型時,與兔多殺性巴氏桿菌、兔支氣管敗血波氏菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、輪狀病毒均無交叉反應,說明該方法特異性良好;該方法對RHDV1型、RHDV2型的靈敏度可以達到1 μL 100～1 000拷貝數,比筆者所在實驗室建立的鑒別經典 RHDV 與 RHDV2的普通 RT-PCR 方法[24]靈敏10～100倍;重復試驗結果表明,組內和組間重復性試驗CV值在0.01%～1.61%之間,說明該方法有良好的重復性。

綜上,本試驗建立的TaqMan雙重 RT-qPCR方法可以在同一個反應管中檢測RHDV1型和RHDV2型,具有特異性好、敏感性高的優點,可以很大程度上提高臨床檢測效率,有助于實際生產中對RHD的診斷和防控,為開發快速診斷試劑盒奠定了基礎。