菲律賓蛤仔牛磺酸轉運體蛋白基因鑒定、表達及低鹽脅迫響應

張志超, 王 珺, 霍忠明, 聶鴻濤, 閆喜武, 丁鑒鋒

(1.大連海洋大學水產與生命學院,遼寧大連 116023; 2.遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心,遼寧大連 116023)

牛磺酸別稱2-氨基乙烷磺酸鹽,是一種廣泛分布在人類和動物體內的小分子含硫氨基酸,在哺乳動物的神經發育、生殖系統發育、糖類代謝、脂類代謝和免疫和調節內環境穩定等過程中發揮著重要作用[1]。牛磺酸也是貝類主要的游離氨基酸之一,在抗逆、生長、發育和免疫等過程發揮重要的作用。貝類,尤其是在潮間帶和灘涂環境中生存的貝類,由于潮汐、降雨和河流匯集等因素,會導致其環境鹽發生劇烈的變化,在應對鹽度變化的過程中,細胞內高濃度的牛磺酸發揮重要作用[2-4]。在高鹽度環境中,細胞外牛磺酸轉運至細胞內[5-6];而在低滲環境下,牛磺酸則會擴散至細胞外,以維持細胞內外滲透壓平衡[7]。此外,研究發現,貽貝(Mytilusgalloprovincialis)鰓組織的表面積和牛磺酸含量呈顯著負相關[8]。對不同生長速度的貽貝稚貝的研究表明,生長速度快的稚貝具有更大的鰓表面積而使其具有更高的濾食效率[9]。Babarro等對相同養殖條件下珍珠貝(Pinctadafucata)的轉錄組分析發現,不同規格的珍珠貝牛磺酸合成限速酶半胱亞磺酸脫羧酶的表達量存在顯著差異[10]。因此,貝類體內的牛磺酸可通過影響其攝食能力而對其生長過程產生影響。此外,動物體內的牛磺酸可通過其滲透壓調節、抗氧化和類胰島素樣作用及促細胞增殖效應等途徑促進體外培養胚胎的發育[11-13]。在貝類的發育過程中,牛磺酸也同樣具有重要作用,紅鮑(Haliotisrufescens)需要通過其卵細胞中的牛磺酸,維持其胚胎到幼蟲發育到變態前體內恒定的牛磺酸含量,保證胚胎的正常發育,長牡蠣(Crassostreagigas)在浮游幼蟲期體內牛磺酸含量迅速升高,能夠使其適應環境滲透壓的劇烈變化[14]。此外,在貽貝(Mytilusedulis)血淋巴中的牛磺酸可作為冷凍保護劑在低溫環境中保持血淋巴正常的生理功能[15]。因此,對貝類牛磺酸代謝過程地深入了解將有助于闡明貝類生長、發育和抗逆的機制。牛磺酸轉運體是分布在細胞膜上的一種轉運蛋白,在牛磺酸代謝過程中發揮關鍵作用[5,16]。

菲律賓蛤仔是我國重要的經濟養殖貝類,其主要廣泛分布于潮間帶,環境變化劇烈,極易受高溫、低鹽和病原微生物等影響,從而導致生長變緩、免疫力降低等問題,嚴重時暴發大規模死亡,造成巨大經濟損失。牛磺酸對貝類的生長、發育和抗逆過程,均具有重要的功能[14,16]。目前,關于貝類牛磺酸代謝關鍵基因牛磺酸轉運體的研究相對較少,僅在牡蠣和貽貝等幾個物種中進行[17-19],而在菲律賓蛤仔中鮮見報道。本研究對菲律賓蛤仔RpTauT基因進行全基因組鑒定,對其保守基序、保守結構域、系統發育關系進行分析,并對RpTauT基因的組織表達及3種殼色蛤仔低鹽脅迫過程中RpTauT基因的表達特征進行分析,旨在闡明蛤仔RpTauT基因在抗逆過程中的作用,并初步探明其在不同殼色蛤仔抗逆性差異形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在大連海洋大學遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心實驗室進行,2021年4月,選取殼長為(3.0±0.5) cm,外殼完整且活力較強的蛤仔個體共300枚,在50 L水體的平底塑料槽中暫養1周后進行試驗,試驗水溫為(18.0±0.5) ℃,鹽度為30。每天換水1次,早晚各投喂螺旋藻粉1次。

1.2 菲律賓蛤仔RpTauT基因鑒定、基因結構及進化分析

蛤仔RpTauT基因鑒定主要基于菲律賓蛤仔基因組數據(NCBI項目登錄號為PRJNA479743)[20]。將基因組注釋結果中與目的基因高度匹配的序列通過NCBI網站的在線保守區分析工具CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、序列比對工具BlastX等在線工具結合預測候選序列的保守結構域進行確認。推測蛋白的氨基酸比對使用 BioEdit 7.09軟件的 Clustal W程序,使用Expasy的ProtScale工具(https://web.expasy.org/protscale/)預測氨基酸序列的疏水性,使用在線軟件TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)進行蛋白跨膜區域預測,使用MEME Suite在線工具預測蛋白保守基序(motif)(https://meme-suite.org/meme/tools/meme),motif數目參數設置為 10,長度設置為21～50 aa,使用Tbtools軟件進行保守結構域和motifs的可視化[21]。進化分析使用Maga 6.0軟件,基于鄰接法構建系統進化樹,使用iTOL(https://itol.embl.de/)在線工具進行進化樹美化。

1.5 菲律賓蛤仔RpTauT基因組織表達分析

取3種殼色菲律賓蛤仔各2枚,冰盤上解剖,提取足、外套膜、鰓、水管、內臟團、性腺和唇瓣組織,液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存,用于組織表達分析。

1.6 菲律賓蛤仔RpTauT基因低鹽脅迫表達分析

選3種殼色蛤仔橙蛤、白蛤、斑馬蛤各60枚,每組30枚,設2個平行。試驗對照組鹽度為30‰,低鹽處理組鹽度14‰,在低鹽脅迫處理的0、8、16、24、48、72、96 h,每處理隨機選4個個體,取其水管組織,液氮速凍后于-80 ℃保存,用于基因表達分析。

1.7 RNA提取和反轉錄

總RNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的試劑盒,使用1.5%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性,采用核酸分析儀(Thermo Nanodrop 2000C)檢測D260 nm/D280 nm值。使用寶生物工程(大連)有限公司反轉錄試劑盒進行反轉錄。

1.8 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

基因表達量檢測采用RT-qPCR法,以菲律賓蛤仔Tublin基因作為內參基因,對蛤仔RpTauT基因表達量進行分析。引物設計采用Primer Primer 5.0軟件,使用引物見表1。基因相對表達量計算采用2-ΔΔCT法[22]。

表1 熒光定量引物

1.9 數據處理

2 結果與分析

2.1 菲律賓蛤仔RpTauT基因結構及進化分析

將推測的蛤仔RpTauT蛋白的氨基酸序列與牡蠣Crassostreagigas(NP_001292278.1)、貽貝Mytilusgalloprovincialis(BAD91313.1)、蛤蜊Phreagenaokutanii(BBK07881.1)和蝦夷扇貝Mizuhopectenyessoensis(XP_021352796.1)的序列Motifs和保守區進行比對分析,Motif分析結果見圖1。由圖1可知,共鑒定出10個保守Motif。除蛤仔RpTauT5、RpTauT6和蝦夷扇貝的TauT外,均含有10個保守的motif,其中,蛤仔RpTauT5和蝦夷扇貝的TauT蛋白缺失motif 4,RpTauT6缺失mitif 2、motif 4、motif 5、motif7和motif10。保守區結構域分析表明,蛤仔RpTauT1、RpTauT2、 RpTauT3和RpTauT4與牡蠣、貽貝和蛤蜊的TauT蛋白具有溶質載體-6(SLC6)家族的保守結構域,而RpTauT5和RpTauT6與蝦夷扇貝的TauT蛋白具有溶質載體-5-6(SLC5-6)家族的保守結構域,均為Na依賴轉運體蛋白[23]。

氨基酸比對結果見圖2。由圖2可知,蛤仔推測的RpTauT蛋白均具有典型的溶質載體蛋白6(SLC6)超家族的疏水結構域,由12個跨膜片段構成,Na+結合位點也高度保守。此外,用以形成二硫鍵穩定SLC6家族轉運體蛋白胞外環的半胱氨酸殘基在蛤仔RpTauT1、RpTauT2、RpTauT3和RpTauT4中也高度保守。

2.2 菲律賓蛤仔RpTauT基因系統進化分析

使用包括人類在內的脊椎動物和貝類等無脊椎動物共34個物種的55條TauT基因序列與菲律賓蛤仔RpTauT基因構建系統進化樹,由圖3可知,脊椎動物的TauT聚為一支,蛤仔的RpTauT與雙殼貝類的遺傳距離較近,其中,RpTauT1、RpTauT2、RpTauT3和RpTauT5與蝦夷扇貝的TauT聚為一支,RpTauT4與蛤蜊聚為一支,RpTauT6與蚌蠣(Mercenariamercenaria)的TauT聚為一支。

2.3 菲律賓蛤仔RpTauT基因的組織表達分析

由圖4可知,組織表達分析中,蛤仔RpTauT基因在檢測的組織中均有表達。RpTauT1在各組織中的表達量依次為外套膜>足、水管>性腺、唇瓣>鰓、消化腺,其中,在外套膜組織中表達量最高(P<0.05),在鰓和消化腺中表達量最低(P<0.05);RpTauT2在各組織中的表達量依次為水管>鰓、消化腺>足、外套膜>性腺、唇瓣,表達量最高在水管組織(P<0.05),性腺和唇瓣組織表達量最低(P<0.05);RpTauT3在各組織中的表達量依次為外套膜>水管、足>性腺、唇瓣>鰓、消化腺,其中,在外套膜組織中表達量最高(P<0.05),在鰓和消化腺中表達量最低(P<0.05);RpTauT4在各組織中的表達量依次為外套膜>水管>足>性腺>唇瓣>鰓、消化腺,其中,在外套膜組織中表達量最高(P<0.05),在鰓和消化腺中表達量最低(P<0.05);RpTauT5在各組織中的表達量依次為外套膜、水管>足>性腺、唇瓣>鰓、消化腺,其中,在外套膜和水管組織中表達量最高(P<0.05),在鰓和消化腺中表達量最低(P<0.05);RpTauT6在各組織中的表達量依次為水管>性腺、消化腺、足、鰓>外套膜、唇瓣,其中,在水管組織中表達量最高(P<0.05),在外套膜和唇瓣中表達量最低(P<0.05)。

2.4 3種殼色菲律賓低鹽脅迫后牛磺酸含量變化

低鹽脅迫后蛤仔體內牛磺酸含量變化情況見圖5。由圖5可知,橙蛤24 h牛磺酸含量顯著升高(P<0.05),48 h含量較0 h略有升高,但不顯著(P>0.05);斑馬蛤牛磺酸含量也表現為先升高后降低的過程;而白蛤牛磺酸含量表現為逐漸升高的過程。

2.5 3種殼色菲律賓蛤仔RpTauT基因在低鹽脅迫下的表達

低鹽脅迫條件下,由圖6可知,3種殼色蛤仔的RpTauT基因表達量均表現出一個升高而后恢復繼而再升高的過程。其中,橙蛤、白蛤、斑馬蛤RpTauT1基因分別在24、72、16 h時達最高值(P<0.05),且在8、16、48、96 h,斑馬蛤RpTauT1基因表達量顯著高于其他2種殼色(P<0.05);橙蛤RpTauT2基因表達最高值出現在48 h(P<0.05),白蛤在8、24、 72 hRpTauT2表達量均達最高值(P<0.05),斑馬蛤在16 h達最高值(P<0.05),在0、8、24、72、96 h白蛤RpTauT2基因表達量顯著高于其他2個殼色(P<0.05),而在16、48 h,斑馬蛤RpTauT2基因表達量顯著高于其他2個殼色(P<0.05);橙蛤、白蛤、斑馬蛤RpTauT3基因最高表達量分別在24、72、16 h(P<0.05),在8、72、96 h,白蛤RpTauT3基因表達量顯著高于其他2個殼色(P<0.05);橙蛤、斑馬蛤RpTauT4基因分別在24、16 h時達最高值(P<0.05),白蛤RpTauT4基因在24、72 h達最高值(P<0.05),斑馬蛤RpTauT4基因在16 h達最高值, 并顯著高于其他2種殼色(P<0.05),而橙蛤RpTauT4基因在24 h表達量顯著高于其他2種殼色(P<0.05);橙蛤、白蛤、斑馬蛤RpTauT5基因表達量分別在24、72、16 h達最高值(P<0.05),白蛤RpTauT5基因在8、72、96 h表達量顯著高于其他2種殼色(P<0.05),斑馬蛤RpTauT5基因表達量在16 h顯著高于其他2種殼色(P<0.05);橙蛤、白蛤、斑馬蛤RpTauT6基因表達量分別在 24、24、16 h達最高值(P<0.05),白蛤RpTauT6基因表達量在8、24、72 h顯著高于其他2種殼色(P<0.05),斑馬蛤RpTauT6基因表達量在16、48、96 h均顯著高于其他兩種殼色(P<0.05)。

3 討論

3.1 蛤仔RpTauT基因結構特征和進化分析

牛磺酸(2-氨基乙磺酸)是哺乳動物體內主要的游離β-氨基酸之一,具有廣泛的生理功能,包括滲透調節、抗氧化、神經細胞發育和維持細胞膜穩定性等[24-25]。牛磺酸的許多細胞保護特性基于其在細胞內的含量,而細胞內的牛磺酸主要來源于胞內合成或者胞外轉運,合成主要由牛磺酸生物合成酶半胱氨酸雙加氧酶和半胱氨酸亞砜脫羧酶完成,而轉運過程主要由牛磺酸轉運體來完成[26]。牛磺酸轉運體是分布在細胞膜上的一類通道蛋白,通常有12個疏水性跨膜結構域,N-和C-端位于胞內側,轉運過程需要Na+和Cl-結合至其胞外環狀結構啟動,是一種鈉離子依賴性蛋白[5]。本研究通過全基因組分析在蛤仔基因組中鑒定出6個RpTauT基因,通過對貽貝、太平洋牡蠣、蛤蜊等物種TauT的結構域、保守基序及氨基酸結構等比較發現,蛤仔RpTauT與不同物種尤其是雙殼貝類中的TauT蛋白具有類似的高度保守結構域,因而推測RpTauT與其他雙殼貝類同源基因具有相似的功能,進化分析也證實蛤仔的RpTauT與雙殼貝類具有更近的遺傳距離。

3.2 菲律賓蛤仔RpTauT基因的組織表達

研究發現,太平洋牡蠣的TauT在鰓、性腺、血淋巴中表達量較高,而在外套膜、肝胰腺和消化道中表達量較低[18]。Hosoi等采用免疫組化方法在紫貽貝的鰓、外套膜和閉殼肌中均檢測出TauT蛋白[16]。在文蛤(M.lusoria)的鰓、外套膜、肌肉、心臟、胃和腸道組織中均檢測到TauT基因表達,其在鰓和外套膜中的表達水平高于其他組織[27]。本研究中,蛤仔的RpTauT基因主要在外套膜和水管組織具有高表達,這2個組織是蛤仔與外界環境的主要接觸界面,其滲透壓波動較大,表明蛤仔RpTauT基因在滲透壓調節過程中發揮重要功能,該結果與在牡蠣和文蛤中的研究結果一致。但在鰓組織中,僅RpTauT2和RpTauT6表現出較高的表達量,可能與蛤仔不同RpTauT基因的組織表達特異性有關。研究認為貝類的生殖細胞內含有大量的牛磺酸用于配子在進入海水過程中滲透壓的調節[18],在哺乳動物生殖組織內的大量牛磺酸具有多種生理作用[28-29]。在本研究中,蛤仔性腺組織中RpTauT表達量并未達到很高水平,可能與研究未在蛤仔繁殖期進行有關。

3.3 3種殼色蛤仔低鹽脅迫后牛磺酸含量比較

牛磺酸是雙殼貝類應對鹽度變化過程維持細胞內滲透壓穩定的最重要的游離氨基酸之一[30]。研究表明,蚶蜊(Glycymerisglycymeris)、貽貝肌肉組織中的牛磺酸含量在適應低鹽度環境后會降低[31]。將文蛤轉移至稀釋1倍的海水中,其鰓組織中的牛磺酸含量在轉移3 h顯著增加,其外套膜中的牛磺酸含量在24 h后才顯著增加[19]。但將文蛤轉移至鹽度為10的海水中1個月后,其鰓組織中牛磺酸含量顯著增加,而外套膜中的牛磺酸含量未發生顯著變化[27]。Hosoi等發現,從海水轉移至50%稀釋海水后8 h時,太平洋牡蠣外套膜中的牛磺酸含量顯著降低[32]。在本研究中,檢測蛤仔軟體部的牛磺酸總含量除在橙蛤 24 h 顯著升高外,其余時間點3種殼色蛤仔軟體部牛磺酸含量在脅迫過程中均未發生顯著變化,表明在應對鹽度脅迫過程中,牛磺酸的變化主要發生在組織細胞內外,而對個體牛磺酸含量影響相對較小。

3.4 菲律賓蛤仔RpTauT低鹽脅迫表達

牛磺酸轉運體蛋白通過對細胞內外牛磺酸的重新分配來協助貝類應對環境滲透壓的變化[33]。在低鹽脅迫過程中,雙殼貝類的牛磺酸成分會流失到細胞外液中[30]。紫貽貝的免疫組化結果顯示,其外套膜中TauT低滲脅迫24 h后表達上調[34]。將貽貝轉移至低鹽環境24、48 h后,其鰓組織中的TAUT mRNA表達量也表現出一定增加[17]。Hosoi等研究發現,低鹽脅迫48 h的紫貽貝和低鹽脅迫 24 h 的牡蠣的外套膜組織中TauT表達量顯著增加[16,18]。Silva等將貽貝離體鰓組織急性暴露于60%人工海水中,雖然牛磺酸吸收的抑制作用>85%,但牛磺酸的表觀積累僅減少了約10%[35]。Wright等觀察到暴露于外部環境的紫貽貝和加州貽貝鰓組織中的TAUT 活性增加有助于恢復從鰓表面流失的牛磺酸[36]。因此,低鹽度環境中,雙殼貝類中的外套膜中TAUT誘導表達可能是由于滲透壓下降導致組織中牛磺酸含量減少的結果。在本研究中,蛤仔在低鹽脅迫過程中水管中的 TAUT mRNA表達也顯著上調,可能是由于水管組織中的牛磺酸在低鹽環境中大量流失誘導的補償機制。但牡蠣在低鹽環境中處理7 d,其鰓組織中的牛磺酸含量和TauT的表達量均顯著降低[37]。TauT在不同物種中對低鹽脅迫的不同反應可能是物種差異及處理過程的不同所致。此外,研究發現牛磺酸具有抗氧化活性,能夠通過減少電子傳輸鏈產生的超氧化物及提高抗氧化酶的活性等途徑發揮其抗氧化功能[38]。貝類在應對鹽度突變的初期,通常采用關閉貝殼與低鹽環境隔離的方式進行應對,結果會導致其短期內攝取氧氣含量不足,低氧可導致體內電子的蓄積,為活性氧的形成提供便利,結果導致體內產生較高水平的活性氧[39]。相關研究已初步證實這一過程,在鹽度由19.6‰降低至8.8‰時,毛蚶血淋巴細胞中活性氧的含量增加了3.5倍[40];低鹽脅迫也能夠導致鮑魚活性氧產量增加[41-42];低氧脅迫后菲律賓蛤仔體內抗氧化酶基因表現出先升高而后恢復的過程,表明蛤仔在低氧脅迫條件下能夠導致體內活性氧的增加[43]。因此,本研究中蛤仔RpTauT在低鹽脅迫后短時間內表現出升高過程可能是由于缺氧導致的活性氧數量增加而大量消耗的牛磺酸所產生的補償效應。牛磺酸含量也是影響牛磺酸轉運體蛋白表達量的重要原因之一,當牛磺酸含量降低時可通過提高轉運體蛋白的表達來增加細胞對牛磺酸的轉運能力進行補償,反之當牛磺酸濃度升高時可抑制轉運體蛋白的表達[44]。將文蛤從鹽度20‰的海水轉移至鹽度為10‰的低鹽海水中,在本研究的低鹽脅迫過程中,3種殼色蛤仔牛磺酸含量的變化是導致蛤仔RpTauT表達量變化的原因之一。前期研究發現,不同殼色菲律賓蛤仔在低鹽脅迫條件下表現出不同的抗逆性[45-46],而3種殼色蛤仔RpTauT基因表達量變化在低鹽脅迫過程中表現出的差異性可能是不同殼色菲律賓蛤仔抗逆性差異的原因之一。

4 結論

(1)鑒定出6條菲律賓蛤仔RpTauT基因,推測其蛋白具有保守的12個跨膜結構域和鈉離子結合位點,進化分析表明蛤仔RpTauT與其他雙殼貝類的遺傳距離較近。(2)組織表達分析表明,蛤仔的RpTauT基因主要在外套膜和水管這2個與外界環境之間有較大接觸界面,且滲透壓波動較大的組織中高表達。(3)低鹽脅迫條件下,蛤仔水管組織中的RpTauT表現出升高過程,原因可能主要是對低鹽脅迫導致的水管組織細胞內牛磺酸的流失和抗氧化過程中消耗牛磺酸的一種補償機制。