基于虛擬篩選、分子對接和分子互作解析兩種大球蓋菇十肽的呈味特性和ACE 抑制活性作用機制

李 文，陳萬超，馬海樂，吳 迪，張 忠，楊 焱,

（1.上海市農業科學院食用菌研究所，上海 201403；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013）

大球蓋菇，又名赤松茸，是以稻秸稈為主要栽培基質生長的草腐菌，在上海郊區廣泛種植，為農業廢棄物的循環利用提供了新途徑。大球蓋菇子實體滋味鮮美，富含蛋白質、肽及氨基酸等營養物質，不僅能帶來愉悅的味覺感受，在保障人體健康中也發揮著重要的營養作用和生物活性。成熟的大球蓋菇子實體中蛋白含量可達到40%～50%干重，游離肽含量可達到11%～14%干重[1]。大球蓋菇是開發天然風味基料和營養健康產品的優質原料。

血管緊張素轉化酶（angiotensin-I converting enzyme，ACE）在誘導體內血壓升高中起到關鍵作用，是治療高血壓、心力衰竭等疾病的理想藥物靶點[2]。ACE 抑制肽能夠抑制ACE 的活性，從而起到降血壓的作用。食源性ACE 抑制肽具有高生物活性、低毒性，且易于在體內代謝，不會表現出抗高血壓藥物常見的副作用，對患高血壓、心血管疾病等特殊人群有著重要的利用價值[3]。前期研究發現，多模式超聲提取和輔助酶解制備的大球蓋菇肽基料具有較好的降血壓、抗氧化等生物活性，愉悅的咸鮮味呈味特性[1,4-5]。將味覺活性與食鹽相當的咸鮮味呈味肽，以部分替代食鹽的方式應用到食品領域，可降低因食鹽攝入過量引發的高血壓、冠心病等心血管疾病患病風險；同時，在不影響食品風味品質與保質期等前提下減少食鹽的添加量，將天然食源性咸鮮味肽作為食鹽的替代品，達到“減鹽不減咸”目的，在國家倡導的減鹽策略執行上，有著重要的研究意義。目前，以大球蓋菇為原料開發兼具ACE 抑制功能活性及愉悅呈味特性的風味活性肽研究較少，肽的功能活性和呈味特性聯動作用機制尚未有報道。因此，進一步挖掘大球蓋菇風味活性肽，解析其活性、呈味機制，推進其在食品、藥品領域的應用，仍然十分有必要。

近年來，肽組學及生物信息學方法在食品科學中的重要性與日俱增[6-7]。國內外學者已有較多的應用肽組學分析方法解析食源性肽功能活性或呈味結構基礎，利用分子對接、分子互作等技術手段探究食源性肽活性作用機制[8-11]或呈味感知機制[12-15]。本研究基于前期采用肽組學等方法構建的大球蓋菇十肽肽譜庫（94 種，http://139.224.23.107），以二級質譜峰面積排名前十、峰面積相當的兩種大球蓋菇十肽RIEDNLVIIR（質譜峰面積2.58×10-7）和SLPIKPRVPF（質譜峰面積2.17×10-7）為研究對象，采用虛擬篩選、分子對接和分子互作技術探究兩種大球蓋菇十肽的呈味特性、ACE 抑制活性作用機制，為大球蓋菇風味活性肽開發利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

DOJINDO 同仁化學ACE Kit-WST 試劑盒上海宥露生物科技有限公司；ACE 受體蛋白 北京艾普希隆生物科技有限公司；Genemore G-MMIGT 生物素化試劑盒 江蘇博美達生命科學有限公司；兩種大球蓋菇十肽 委托吉爾生化（上海）有限公司對兩種大球蓋菇十肽RIEDNLVIIR（RR-10）和SLPIKPRVPF（SL-10）進行合成，合成肽純度大于98%；檸檬酸、蔗糖、異亮氨酸、氯化鈉、谷氨酸鈉北京索萊寶科技有限公司；其他試劑（分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

TS-5000Z Insent 電子舌味覺分析系統 北京盈盛恒泰科技有限責任公司；Bio-Tek Epoch 2 酶標儀 美國BioTek 公司；Allegra 25R 高速冷凍離心機 美國Beckman 公司；MS3002TS/02 電子天平 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；TA NANO ITC 等溫滴定量熱儀 沃特世科技（上海）有限公司；ForteBio Octet Red96e Biolayer Interferometry（BLI）實時無標記分子相互作用儀 美國ForteBio 公司；GE PD MiniTrap G-25 預裝脫鹽柱 GE 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大球蓋菇十肽呈味特性及活性預測 利用BIOPEP-UWM（https://biochemia.uwm.edu.pl/biopepuwm/）的Sensory peptide and amino acids 模塊，預測RR-10 和SF-10 的呈味特性及呈味肽片段[5]。利用BIOPEP-UWM 的Bioactive peptide 模塊，預測RR-10 和SF-10 是否是潛在的ACE 抑制劑及其潛在的活性肽片段[16-17]。利用BIOPEP-UWM 的Enzyme（s）action 模塊，預測RR-10 和SF-10 經胃腸蛋白酶消化后潛在的活性肽片段及其抑制率[18]。采用admetSAR（http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/predict/）預測肽的血腦屏障穿透性、腸道上皮細胞Caco-2 細胞穿透性和AMES toxic 急性口服毒性[19]。

1.2.2 大球蓋菇十肽呈味特性分析 采用TS-5000Z Insent 電子舌味覺分析系統對RR-10 和SF-10 的呈味特性及呈味強度進行分析。準確稱取0.1 g 合成肽，加入100 mL 純水溶解，逐級稀釋為濃度梯度1.0、0.75、0.5、0.375 和0.25 mg/mL 的肽溶液。以同濃度梯度的氯化鈉（NaCl）和谷氨酸鈉（MSG）做呈味對照[5]。

1.2.3 大球蓋菇十肽體外ACE 抑制活性分析 準確稱取0.1 g 合成肽，加入50 mL 純水溶解，逐級稀釋為濃度梯度2.0、0.4、0.08、0.016 和0.0032 mg/mL的肽溶液。采用DOJINDO ACE Kit-WST 試劑盒對肽溶液的ACE 抑制活性進行測定，分析方法同試劑盒方法。以樣品濃度和抑制率做ACE 抑制活性曲線，計算抑制率50%時的樣品濃度（IC50）。

1.2.4 大球蓋菇十肽ACE 抑制機制預測 從PDB數據庫中獲得ACE 受體蛋白（1O8A）的晶體結構作為靶標蛋白。利用分子對接技術，分析大球蓋菇十肽與ACE 受體結合程度。以肽-受體結合打分值、成鍵數量及氨基酸殘基結合能為指標，篩選緊密結合的肽-受體復合物，解析肽-受體結合方式和結合位點，預測大球蓋菇十肽的ACE 抑制作用機制[4]。

1.2.5 大球蓋菇十肽ACE 抑制機制驗證 采用ITC和BLI 分子相互作用儀分析十肽和ACE 受體之間的結合模式。

將PBS 緩沖液配制的ACE 受體蛋白溶液注射到ITC 樣品池中，樣品池溫度25 ℃，攪拌器轉速1000 r/min，開始至第一次滴定間隔時間60 s，總注射次數20 次，單次注射緩沖液配制的肽配體溶液2 μL，兩次滴定時間間隔150 s，單次注射時間2 s。測量受體蛋白、肽分子結合過程中反應體系溫度變化情況，ITC Nano 分析軟件計算受體配體結合親和力（KD）、化學計量（N）、焓（ΔH）和熵（ΔS），對受體、配體是否有相互作用進行驗證。

將PBS 緩沖液配制的ACE 受體蛋白溶液進行蛋白生物素化。蛋白生物素化孵育30～60 min 后進行脫鹽處理。BLI 的4 根SSA 傳感器固化生物素化的蛋白，4 根傳感器做參比電極。設置基線平衡時間60 s，負載樣本時間800 s，基線平衡時間60 s 程序固化受體蛋白。設置基線平衡時間60 s，結合時間120 s，解離時間120 s 生物分子互作循環程序進行受體蛋白與肽分子結合、解離互作反應。使用BLI 分析程序獲取受體與肽配體間結合常數Kon、解離常數Koff、親和力KD等動力學相關信息，確定ACE 受體與肽配體互作結合模式。

1.3 數據處理

采用電子舌味覺分析系統軟件進行肽段呈味強度數據采集及處理，試驗所得數據以3 次測定結果的平均值±標準差表示。肽段抑制活性采用Excel 軟件處理和分析。采用MOE 2019 進行分子對接、結合方式和結合位點分析。采用GraphPad Prism 9 軟件繪制ITC 和BLI 分析程序獲得的熱力學和動力學數據。

2 結果與分析

2.1 大球蓋菇十肽呈味特性及活性預測分析結果

BIOPEP-UWM 分析預測的大球蓋菇十肽呈味及活性片段結果顯示，RR-10 具有呈咸鮮味的ED 肽片段，SF-10 具有呈咸味提升的RV 肽片段。RR-10和SF-10 均是潛在的ACE 抑制劑。RR-10 具有的ACE 抑制活性肽片段為IE；SF-10 具有的ACE 抑制活性肽片段為IKP、PR、VP、KP 和LP。

由BIOPEP-UWM 虛擬酶切位點分析結果可知，RR-10 經胃蛋白酶和胰蛋白酶連續消化后，理論水解度為11.11%。RR-10 存在一個胃蛋白酶酶切位點L-V。RR-10 及胃蛋白酶酶切片段RIEDNL、VIIR 不能進一步被胰蛋白酶酶切，由此推測RR-10 及其消化肽片段通過細胞旁轉運和跨胞途徑被小腸上皮細胞完整吸收。SF-10 存在一個胃蛋白酶酶切位點L-P，兩個胰蛋白酶酶切位點K-P 和R-V。SF-10 經胃蛋白酶和胰蛋白酶消化理論水解度為40%，產生的潛在抑制ACE 活性肽片段PR。SF-10模擬消化后產生的活性肽片段分子量低，可通過載體介導（PepT1 介導）轉運到細胞內部發揮活性作用[20]。基于admetSAR 預測結果可知，RR-10 和SF-10 均無毒（Non AMES toxic，評價數值分別為0.6671 和0.7318），血腦屏障透過性（評價數值分別為0.8235 和0.9928）和Caco-2 細胞穿透性（評價數值分別為0.7015 和0.7849）良好。

2.2 大球蓋菇十肽呈味特性驗證結果

大球蓋菇十肽電子舌呈味分析結果顯示，RR-10 具有咸味和濃厚感呈味特性，SF-10 具有鮮味和濃厚感呈味特性。RR-10 在1.0 mg/mL 時開始呈現較優的咸味呈味強度，等同于同濃度NaCl 呈咸強度的1.86 倍。SF-10 在低濃度下即可達到較好的呈鮮效果，與同濃度MSG 呈鮮強度相當；隨著肽段濃度增加，呈鮮效果反而減弱（表1）。相較于MSG 在一定濃度范圍（0.25～1.0 mg/mL）內呈鮮強度與劑量濃度正相關的呈味特性，電子舌評價結果顯示SF-10 與MSG 呈味機制明顯不同，SF-10 的呈鮮機制有待進一步解析。因此，在一定配比濃度下，RR-10 可作為增咸劑、SF-10 作為增鮮劑，應用于天然調味品開發。

表1 大球蓋菇十肽RR-10 和SF-10 呈味特性評價結果Table 1 Evaluation results of the taste characteristics of the decapeptides RR-10 and SF-10 from Stropharia rugosoannulata

2.3 大球蓋菇十肽體外ACE 抑制活性分析結果

RR-10 在配制濃度0.4 mg/mL 時，其體外ACE抑制率可達到92.61%±0.51%；SF-10 在2.0 mg/mL時，體外ACE 抑制率為83.41%±0.49%；RR-10 和SF-10 均具有體外ACE 抑制活性。從兩種十肽體外ACE 抑制率擬合曲線計算可知，RR-10 和SF-10 的ACE 抑制IC50值分別0.012 mg/mL 和0.221 mg/mL。一定濃度范圍內（0.0032～2.0 mg/mL），RR-10 體外ACE 抑制效果優于SF-10。

2.4 大球蓋菇十肽ACE 抑制機制分析結果

兩種十肽與ACE 受體分子對接結果圖1～圖3所示。RR-10 和SF-10 均可進入ACE 受體的活性空腔（圖1）。RR-10 與ACE 受體對接得分-15.05（同一肽段-受體不同構象結合得分越低，形成的復合物越穩定），RR-10 與ACE 的氨基酸殘基GLU403、GLU411、GLU384 等形成14 個氫鍵和5 個離子鍵。RR-10 中R1、I2、E3、N5 和R10 是與受體形成相互作用的氨基酸殘基，其中，R1 和R10 與受體之間形成的結合鍵數量多，結合鍵能量均較低，在維持肽-受體形成的復合物穩定性中發揮重要作用（圖2A，圖3A）。SF-10 與ACE 受體對接得分-14.69。SF-10與ACE 受體形成9 個氫鍵和8 個離子鍵相互作用。ASP415、LYS454、GLU403、ARG124 等是ACE 受體中結合到SF-10 的關鍵氨基酸殘基。肽段中S1、I4、K5、R7、V8 和F10 均與ACE 受體產生相互作用，其中，S1、R7 和F10 與ACE 受體氨基酸殘基之間形成的結合鍵能量低，成鍵數量多，是SF-10 中發揮主要結合作用的氨基酸殘基（圖2B，圖3B）。綜上所述，氫鍵和靜電相互作用是兩種十肽與ACE 受體的主要作用方式。肽段C、N 端氨基酸殘基及肽段中的R 殘基，易被受體識別形成結合能量較低的作用鍵。兩種十肽可與ACE 受體活性口袋氨基酸殘基（ALA354、GLU384 和HIS353）[19,21]、鋅離子（Zn701，2.98 ?和2.08 ?）或結構域上的關鍵氨基酸強結合，是肽段具有ACE 抑制活性的主要原因。RR-10 與ACE 受體活性口袋氨基酸殘基、鋅離子之間的結合鍵數量及結合強度，均高于SF-10，說明RR-10 的氨基酸序列組成及空間結構，更易被ACE受體識別及結合，這可能是RR-10 的ACE 抑制活性高于SF-10 的主要原因。

圖1 大球蓋菇十肽與ACE 相互作用3D 圖Fig.1 3D interaction plots between peptides and ACE receptor

圖2 大球蓋菇十肽與ACE 受體互作2D 圖Fig.2 2D interaction plots between peptides and ACE receptor

圖3 大球蓋菇十肽與ACE 受體互作結合能量圖Fig.3 Docking amino acids and binding emerge between peptides and ACE receptor interactions

考慮到大球蓋菇十肽RR-10 體外ACE 抑制活性、分子對接預測的ACE 受體結合抑制作用效果更好，采用RR-10 進行分子互作熱力學和動力學層面的ACE 抑制機制研究。大球蓋菇十肽RR-10 與ACE 受體之間結合反應熱力學結果如圖4 所示。在RR-10 與ACE 受體的結合反應中，熱力學結合常數為1.471×10-4，焓值（ΔH）和熵值（ΔS）的變化均為負值，表明RR-10 與ACE 受體的結合反應是焓驅動反應。研究表明，焓驅動反應比熵驅動反應更有利于活性肽對ACE 的抑制作用[9]。RR-10 和ACE 受體之間結合反應動力學結果顯示（圖5），RR-10 與ACE受體之間屬于特異性結合，動力學結合常數為5.61×10-4。分子互作熱力學和動力學結果表明，焓驅動反應的RR-10 與ACE 受體特異性結合，是生物分子基團之間的氫鍵和靜電結合，這與分子對接結果具有一致。

圖4 大球蓋菇十肽RR-10 與ACE 受體相互作用分子熱力學圖Fig.4 Molecular thermodynamics diagram of RR-10 interacting with ACE receptors

圖5 大球蓋菇十肽RR-10 與ACE 受體相互作用分子動力學圖Fig.5 Molecular dynamics diagram of RR-10 interacting with ACE receptors

3 討論與結論

食源性活性肽因來源廣泛，安全性高，靶向效果好，近十年在臨床及臨床前研究中比例大幅度提升[22]。活性肽在降血壓[9,23-26]、降血糖[27-30]、降血脂[8,31]等保健食品和藥物開發上具有良好潛力和應用前景。基于肽組學、分子對接等技術開展的食源性功能肽、肽與靶標受體蛋白互作機制研究，已取得突破性進展。Li 等[25]從郫縣豆瓣醬中獲得的ACE抑制肽RGLSK，可與ACE 受體的ALA354，TYR523和GLU384 形成氫鍵、與Zn2+形成配位鍵相互作用。Ma 等[32]從紋鱧水解產物中篩選出潛在的ACE抑制肽，氫鍵、靜電和疏水相互作用是肽段與ACE受體的主要作用方式。Wei 等[26]從酒糟中鑒定得到的IC50值較好（50.01 μmol/L）且含量較高的ACE 抑制肽PR，與ACE 受體結合為競爭性抑制結合方式。Fu 等[33]從牛膠原蛋白中分離得到的ACE 抑制肽，未與ACE 受體口袋活性氨基酸殘基結合，主要通過非競爭機制顯示ACE 抑制活性。本研究基于BIOPEP-UWM 肽譜庫等虛擬篩選及預測，獲得了兩種大球蓋菇十肽RR-10 和SF-10 的特征性呈味和活性肽片段、消化特性、毒理性等理論評價結果。體外呈味及活性驗證結果表明，RR-10 和SF-10 在一定濃度配比下，可呈現愉悅咸鮮味呈味特性；RR-10具有較優的ACE 抑制活性（IC50，0.012 mg/mL）。兩種大球蓋菇十肽可與ACE 靶標蛋白受體結合形成氫鍵和靜電相互作用，與已報道文獻研究結果具有一致性。基于分子互作熱力學和動力學技術解析的大球蓋菇十肽RR-10，與ACE 靶標受體焓驅動反應特異性結合發揮ACE 抑制活性，為食源性肽ACE抑制機制驗證及解析提供方法和思路。

風味肽分子量低，能帶來愉悅的味覺感受，可與食鹽、谷氨酸鈉等相互作用提升食品咸鮮味醇厚口感，增強滋味豐富度和協調性[34-36]。開發兼具功能活性和呈味特性的風味活性肽產品，既可在保障人體健康中發揮重要的營養作用和生物活性，亦可滿足消費者對天然高品質呈味基料、風味休閑食品的需求，具有廣闊的應用前景。本研究基于虛擬篩選、體外呈味及活性評價、分子對接和分子互作技術解析的大球蓋菇十肽呈味特性和ACE 抑制作用機制，還未與真正的味覺傳感、生理作用產生直接聯系。考慮到不同技術的檢測原理不同，檢測結果之間的相同趨勢是值得關注的。未來仍需進一步開展基于感官受體、胃腸受體分子互作過程中的呈味機制和活性作用機制解析，為開發兼具功能活性及風味特性的大球蓋菇風味活性肽提供理論支撐。