超聲時間對牛肉干品質及其肌原纖維蛋白結構的影響

董智銘，姜萩婉，蔣澤臨，王 輝，王見釗，孔保華，劉 騫，陳 倩

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

超聲技術是食品加工中一種新興的綠色、消費者友好型技術，具有效率高、耗能低等優點。超聲技術作為非熱加工技術，可在不損害肉類質量的前提下促進加工進程、提高產品安全[1]。超聲處理對肉類的影響可歸因于空化效應、機械效應和熱效應。空化效應是指超聲頻率在20～100 kHz 下，傳播介質中會形成空化泡并迅速生長、變大、崩潰，整個環節會產生大量能量，從而改變肌肉組織內部環境[2-3]。許多研究表明，超聲的空化效應可以誘導細胞膜破裂，破壞肌原纖維結構，從而促進肉類腌制、干燥和嫩化[4]。機械效應是超聲處理的原發效應，可以通過影響結締組織的原有結構，增強傳質[5]。熱效應是指由空化效應釋放熱能，機械效應摩擦生熱，從而導致局部高溫的一種現象，能夠造成肉類品質改變[6]。

腌制是肉制品加工中重要的工藝環節，常用的腌制方法包括干腌法和濕腌法[7]。干腌法是利用食鹽和混合鹽，涂擦在肉的表面，依靠外滲汁液形成鹽液進行腌制的方法，該法腌制時間較長、食鹽不均，且大量的水分流失導致產品質地堅硬[8]。濕腌法是將原料肉浸泡在提前配制好的食鹽溶液中，通過擴散和水分遷移使得腌制劑滲入肉的內部，該法食鹽分布均勻，但色澤和風味欠佳，腌制時間與干腌法相近[9]。相關研究表明，超聲技術結合濕腌法可以通過提高肉中食鹽滲透速率，加速腌制進程，且不會對肉類的感官屬性、氧化穩定性產生負面影響[10]；還可以通過破壞溶酶體，釋放組織蛋白酶和鈣蛋白酶，增加蛋白質溶解度，破壞纖維結構，從而改善肌肉嫩度[11]；增大肌肉纖維間距，降低蒸煮損失，增加保水性[12]。

牛肉干作為一種具有高蛋白、低脂、美味等優點的傳統特色干肉制品，因其易食、耐貯存和便于攜帶等特點被廣大消費者所喜愛。然而，傳統牛肉干由于質地硬、色澤深、品質不穩等問題，已不能很好的適應市場需要[9]。目前，對于牛肉干品質改善的研究大多集中在嫩化及保水技術的開發、成品配方的優化、營養與風味的提升等方面[13-14]。關于超聲技術改善牛肉干品質的研究相對較少，且缺乏超聲技術對牛肉干品質及蛋白結構影響的系統分析。前期研究已明確了超聲功率對牛肉干品質的影響，并且獲得最佳的超聲功率，基于此，本研究進一步探究超聲時間對牛肉干品質特性及其蛋白結構的影響，以期為牛肉干品質改善及實際生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛里脊肉、食鹽、白糖、味精 購于哈爾濱家樂福超市；食品級亞硝酸鈉 購于億人添加劑有限公司（哈爾濱）；砂仁、桂皮、茴香、胡椒、八角、肉豆蔻、草蔻、丁香、白芷 購于襄陽高新技術開發區食化香精商行；所用化學試劑均為國產分析純。

ZE6000 色差計 日本電色工業有限公司；GL-21M 冷凍離心機 湖南湘儀有限公司；PB-30 pH 計 德國Sartorius 科學儀器有限公司；202 型電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；S-3400N 型掃描電鏡、E-1010 型離子濺射儀 日本Hitachi 公司；超聲波輔助冷凍機 南京先歐有限公司；TA-XT plus 型質構分析儀 英國Stabel Micro System 公司；智能水分活度儀 美國Decagon 公司；T6 新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛肉干的制作 按照課題組前期牛肉干制作方法[15]，并略做調整。將牛里脊去除筋膜，順著肌纖維的方向將其切成2 cm×2 cm×10 cm 的長條狀。按肉液比1:3（g:mL）制備腌制液，根據肉重添加水和料包（12%砂仁、3%草寇、15%桂皮、6%茴香、6%胡椒、6%八角、6%肉豆蔻、3%丁香和3%白芷）進行熬煮，水沸后繼續煮30 min，并維持水量在肉重的三倍，冷卻后加入6%姜粉、6%白糖和6%味精，根據水的總重加入6%氯化鈉、0.01%亞硝酸鈉，攪拌均勻即可。將切好的牛肉浸沒于腌制液中，根據前期試驗結果，在溫度10 ℃、頻率30 kHz、功率300 W 下進行超聲處理，超聲時間設置為0、15、30、45、60 min，每40 s 一次，間隔5 s。隨后，將經不同超聲時間處理后的牛肉條繼續在10 ℃靜置腌制10 h。將腌制好的牛肉條放入發酵箱中進行自然發酵和干制，設置溫度25 ℃，濕度75%～80%，發酵6 d 后成品，即為牛肉干。具體工藝流程如下：牛里脊→修割切條→制備腌制液→不同超聲時間處理（0、15、30、45、60 min）→靜置腌制10 h（牛肉條）→自然發酵、干制6 d→成品（牛肉干）。

本試驗分別對發酵前的牛肉條和發酵后的牛肉干進行理化及品質特性的分析（包括水分含量、水分活度、pH、食鹽含量、剪切力和色差），同時對發酵前的牛肉條微觀結構進行觀察，并提取其中的肌原纖維蛋白，進行結構分析（包括羰基、總巰基、活性巰基含量和表面疏水性）。

1.2.2 水分含量和水分活度的測定 水分含量按照GB 5009.3-2016 進行測定[16]；水分活度按照于秋影等[17]的方法進行測定。

1.2.3 pH 和食鹽含量的測定 pH 按照GB 5009.237-2016 進行測定[18]；食鹽含量按照GB 5009.91-2017 進行測定[19]。

1.2.4 剪切力的測定 將肉干進行熟制（100 ℃蒸制20 min），然后將其冷卻至室溫，修割成1 cm×1 cm粗細的肉干，然后進行剪切力的測定。刀頭型號為BSW，測力傳感器30 kg，測前速度10 mm/s，測量長度1.5 cm，切割時刀頭需垂直肌纖維方向，進行6 次重復試驗，取平均值。

1.2.5 色差的測定 色差按照吳九夷等[20]的方法進行測定，將樣品切碎處理，鋪滿色差杯底部。使用配備有8 mm 孔徑、D65 光源和10°觀察角的ZE6000色差計測定樣品的亮度值（L*），紅度值（a*）和黃度值（b*）。在進行顏色讀數之前，用黑色和白色標準板校準儀器。

1.2.6 掃描電鏡的觀察 按照Zhou 等[21]光學顯微鏡分析肉樣的方法進行測定，并略做調整。將牛肉樣品切成5 mm×5 mm×1 mm 的肉片，固定在2.5%戊二醛緩沖液中，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）沖洗三次，再用乙醇梯度溶液（50%、70%、90%和100%，V/V）脫水。然后，立即用叔丁醇洗滌三次，并在-20 ℃下冷凍。在冷凍干燥和噴金后，使用電子顯微鏡觀察樣品微觀結構。

1.2.7 肌原纖維蛋白的提取 按照杜洪振等[22]的方法提取超聲處理后牛肉條中的肌原纖維蛋白。將切碎的牛肉條與四倍體積的磷酸鹽提取液混合后均質90 s，所得勻漿在3000 r/min 下冷凍離心15 min 后去除上清液。用四倍體積的相同提取液重復勻漿離心兩次，隨后用四倍體積的氯化鈉洗液（0.1 mol/L）將沉淀溶解，均質60 s，在3000 r/min 下離心15 min，重復上述操作三次，通過四層80 目紗布過濾，用鹽酸（0.1 mol/L）調節濾液pH 至6.0，收集蛋白并在24 h內立即分析。

1.2.8 肌原纖維碎片化指數（myofibril fragmentation index，MFI）MFI 按照馬旭華等[23]的方法進行測定，使用緩沖液調節提取的蛋白溶液濃度至0.5 mg/mL，記錄波長540 nm 處的吸光度，其平均值乘以200 即為MFI。

1.2.9 羰基含量的測定 羰基含量按照Fan 等[24]的方法進行測定，并略做調整。取1 mL 2,4-二硝基苯肼（10 mmol/L）與1 mL 蛋白溶液（2 mg/mL）混勻，在室溫下避光反應1 h。此后加入1 mL 20%三氯乙酸溶液，經10000 r/min 離心5 min，取其沉淀用1 mL 乙醇-乙酸乙酯溶液（1:1，V/V）洗滌三次，并用3 mL 鹽酸胍溶液（6 mol/L）將沉淀完全溶解，記錄樣品在波長370 nm 處的吸光度。對照組在開始時以1 mL HCl 溶液（2 mol/L）取代2,4-二硝基苯肼，此后操作相同。

1.2.10 總巰基含量的測定 總巰基含量按照扈瑩瑩等[25]的方法進行測定，并略作調整。將蛋白溶液調整至2 mg/mL，取1 mL 蛋白溶液加入到8 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，8 mol/L 尿素，4 mmol/L EDTA，pH=8.0）中進行均質。取4.5 mL 混合溶液與0.5 mL Ellman 試劑（10 mmol/L DTNB）避光反應30 min，對照組以4.5 mL Tris-甘氨酸緩沖液取代混合液。經DTNB衍生后，10000 r/min 離心15 min，記錄上清液在波長412 nm 處的吸光度，測定總巰基含量。

1.2.11 活性巰基含量的測定 活性巰基含量按照Pan 等[26]的方法進行測定，并略做調整。將8 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，8 mol/L 尿素，4 mmol/L EDTA，pH=8.0）與1 mL 蛋白溶液（2 mg/mL）進行均質。在4.5 mL 混合液中加入0.5 mL Ellman 試劑，并在室溫下避光反應30 min，Tris-甘氨酸緩沖液作為空白對照。然后10000 r/min 離心15 min，通過記錄上清液在波長412 nm 和540 nm 處的吸光度測定活性巰基含量，計算公式如下：

式中：73.53=106/13600；13600 L/（mol·cm）為摩爾消光系數；C（mg/mL）為蛋白溶液濃度。

1.2.12 表面疏水性的測定 表面疏水性按照陳臘梅等[27]使用溴酚藍的方法進行測定。將溴酚藍（1 mg/mL）添加到蛋白溶液（1 mg/mL）中，在室溫下充分混合后，以3500 r/min 的速度離心，記錄稀釋10 倍的上清液在波長595 nm 處的吸光度。對照組用pH7.0的磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L）代替蛋白溶液。通過溴酚藍結合量反映蛋白表面疏水性，計算公式如下：

式中：A0為對照組的吸光度；Ax為樣品的吸光度。

1.3 數據處理

所有數據來自三次重復的獨立試驗，均以平均值±標準差（SD）來表示。使用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計分析，并通過單因素方差分析（ANOVA）和Duncan 檢驗確定平均值之間的顯著性差異（P<0.05）。其他繪圖用Excel 和Origin 2021 完成。

2 結果與分析

2.1 超聲時間對牛肉干水分含量和水分活度的影響

由表1 可知，發酵后的牛肉干中水分含量和水分活度均顯著低于牛肉條（P<0.05），0、15、30、45和60 min 處理組的牛肉條經6 d 自然發酵后，水分含量分別降低至25.22%、25.80%、27.11%、28.62%和29.87%，水分活度分別降至0.704、0.711、0.722、0.728 和0.747，這主要因為發酵過程中牛肉條失水所致。此外，隨著超聲時間的增加，牛肉條與牛肉干中水分含量和水分活度均呈逐漸上升趨勢，特別是超聲時間在45 和60 min 時（P<0.05）。這說明延長超聲時間有助于肌纖維保留更多的水分，本研究結果與Zhao 等[12]報道的一致。一方面可能是因為超聲處理可以使肌纖維直徑膨脹，纖維間空隙逐漸增大，可以容納更多的水分；另一方面，空化效應引起的鹽加速滲透提高了纖維之間的靜電斥力和蛋白溶解，更多水分被束縛在肌肉組織中[28]。

表1 超聲時間對牛肉條及牛肉干水分含量和水分活度的影響Table 1 Effects of ultrasound time on the moisture content and water activity of fresh beef strip and beef jerky

2.2 超聲時間對牛肉干pH 和鹽含量的影響

pH 是發酵肉制品的重要指標之一，對牛肉干品質形成和安全性有影響。由圖1A 可知，經過6 d 發酵后的牛肉干pH 顯著降低（P<0.05），這主要與發酵過程中優勢微生物代謝有關，這些微生物主要源于材料自身以及加工環境和設備。隨著超聲時間的增加，牛肉條pH 從5.8 升高至5.96，發酵后的牛肉干pH從5.24 升高至5.34（P<0.05）。這可能是因為超聲的空化效應導致蛋白水解酶與脫氨基酶的釋放，蛋白質結構的變化會導致離子基團位置發生改變，表現為pH 升高[29]。Jayasooriya 等[30]在研究超聲處理對牛半腱肌和最長肌物理性質的影響時，也得出了相同的結論。

圖1 超聲時間對牛肉條及牛肉干pH（A）和鹽含量（B）的影響Fig.1 Effects of ultrasound time on the pH (A) and salt content(B) of fresh beef strip and beef jerky

超聲時間對牛肉干鹽含量的影響如圖1B 所示，發酵后的牛肉干中鹽含量較牛肉條顯著增加（P<0.05），這主要與發酵過程中牛肉水分損失有關，導致食鹽溶液濃縮，鹽含量增高。隨著超聲時間的增加，牛肉條和發酵后的牛肉干中鹽含量均顯著上升（P<0.05）。這與Mcdonnell 等[31]的研究結果一致，超聲輔助處理可以顯著改善雞胸肉腌制過程中的鹽滲透，主要是因為當空化氣泡在肉表面附近不對稱坍塌時，會產生具有瞬時高速（100 m/s）的微射流，將鹽水微注射到肉中，從而改善肌肉組織中的鹽擴散。此外，超聲處理會破壞肌肉組織，排出內部氣體，肌肉組織內形成負壓降低了腌制液進入肉塊的阻力，從而提高食鹽滲透效果；超聲波產生的湍流和攪動作用也可以進一步增強食鹽的轉移。

2.3 超聲時間對牛肉干剪切力的影響

由圖2 可知，牛肉條各組剪切力均在13.96 N 以下，經6 d 發酵后，0、15、30、45 和60 min 處理組的牛肉干剪切力分別升高至33.19、30.64、25.01、24.10和23.85 N（P<0.05）。這主要因為牛肉在發酵過程中失水，導致牛肉質地變硬。牛肉條和牛肉干的剪切力均隨超聲時間的增加（0～30 min），呈顯著降低趨勢（P<0.05），30 min 后隨著超聲時間的增加，其剪切力沒有顯著變化（P>0.05）。這說明適當增加超聲時間可顯著提升牛肉干的嫩度，這與劉夢等[32]的研究結果一致，超聲處理可以破壞牛肉肌原纖維結構，且對肌束膜等結締組織也有很強的破壞性。超聲輔助腌制可以促進肌肉中肌間線蛋白降解，肌原纖維Z-線斷裂程度進一步增大，導致肌原纖維結構被破壞，從而改善牛肉的嫩度[33]。

圖2 超聲時間對牛肉條及牛肉干剪切力的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on the shear force of beef strip and beef jerky

2.4 超聲時間對牛肉干色差的影響

由表2 可知，發酵后的牛肉干與牛肉條相比，其L*值、b*值顯著增加，a*值顯著降低（P<0.05）。并且牛肉條與牛肉干的L*值均隨著超聲時間的增加逐漸提高，超聲處理后的L*值顯著高于未經處理組（P<0.05）。L*值的升高可能是由于空化氣泡在破裂時產生的小范圍高溫、高壓環境導致的肌紅蛋白部分變性引起的，也可能是肌肉水分含量增加，提高了其光反射率，產生了顏色增白效果，進而提高了L*值[34]。Pohlman 等[35]研究也發現，經過超聲輔助腌制的牛胸肌，其L*值顯著增加。

表2 超聲時間對牛肉條及牛肉干色差的影響Table 2 Effects of different ultrasound time on the color properties of fresh beef strip and beef jerky

a*值隨著超聲時間的增加先增大后減小，在超聲30 min 時達到最大（P<0.05），牛肉條a*值達到17.88，牛肉干a*值達到16.8。這是因為隨著超聲時間的增加，空化氣泡破裂產生了大量自由基，氧合肌紅蛋白的形成，導致a*值升髙[36]；然而經過長時間超聲處理后，氧合肌紅蛋白進一步氧化成高鐵肌紅蛋白，牛肉的a*值降低。此外，可能是因為長時間超聲處理在破壞肌纖維的同時，促進纖維中的肌紅蛋白釋放到腌制液中，降低了牛肉中的肌紅蛋白含量，導致a*值降低。b*值隨著超聲時間的增加而變大，在超聲60 min 時達到最大，b*值的增加可能與脂質氧化有關。然而，Carrillo-lopez 等[37]發現增加超聲時間對牛肉的b*值沒有顯著影響，這可能是因為使用的超聲強度太低，釋放的能量不足以誘導蛋白質和色素變性，并且與原料肉的差異有關。

2.5 超聲時間對牛肉條微觀結構的影響

肌肉組織的嫩度和保水性與其微觀結構密切相關，對超聲處理后的牛肉條樣品進行掃描電鏡觀察，結果如圖3 所示。超聲處理0 min 的對照組，肌束排列良好，彼此緊密接觸；超聲處理15 min 后，肌肉組織的相鄰肌束間存在明顯間隙；超聲處理30 min 后，肌束間隙進一步變大；超聲處理60 min 后，出現了明顯的肌束斷裂。這說明增加超聲時間，空化和機械效應會對肌肉微觀結構造成更明顯的破壞效果，這也是促使牛肉干嫩度提高的重要原因，與Reynolds 等[38]研究結果一致。

圖3 不同超聲時間處理的牛肉條掃描電鏡圖（500×）Fig.3 Scanning electron microscope of fresh beef strip with different ultrasound time (500×)

2.6 超聲時間對牛肉肌原纖維蛋白結構的影響

通過上述研究發現不同超聲時間對牛肉干的品質產生了不同程度的影響，為了進一步揭示其影響機制，對經超聲處理后的牛肉條的肌原纖維蛋白結構進行了解析。由表3 可知，隨著超聲時間的增加，牛肉MFI 呈上升趨勢，當超聲處理60 min 時達到最大。這說明增加超聲時間能夠提高牛肉肌原纖維碎片化指數，超聲處理的機械效應作為改善肉質的關鍵因素，可在較短時間內產生強烈的剪切作用，引起肌原纖維蛋白結構弱化、斷裂，從而降低剪切力，提高肉的嫩度[39]。

表3 超聲時間對牛肉肌原纖維蛋白MFI、羰基、總巰基、活性巰基含量和表面疏水性的影響Table 3 Effects of ultrasound time on the MFI,carbonyl,total sulfhydryl,active sulfhydryl content and surface hydrophobicity of myofibrillar proteins of fresh beef strip

羰基衍生物的形成主要歸因于氨基酸側鏈遭受自由基攻擊氧化所致，其變化情況如表3 所示。未經超聲處理的對照組羰基含量為0.31 nmol/mg 蛋白，隨著超聲時間的增加羰基含量逐漸增加，在60 min時達到1.22 nmol/mg 蛋白（P<0.05），約為30 min 時的2 倍。這主要是因為超聲空化效應引起的鹽加速滲透增強了組織內部離子強度，由此膨脹的肌原纖維導致自由基更易攻擊氨基酸側鏈生成羰基，從而增加了羰基含量[40]。

蛋白質的氧化程度可以用巰基的含量來衡量，總巰基含量是蛋白質表面及包埋在內部所有巰基的總和。在本研究中，隨著超聲時間的延長，蛋白總巰基含量逐漸降低，初始總巰基含量為58.66 nmol/mg蛋白，在超聲60 min 后顯著降至53.24 nmol/mg 蛋白（P<0.05），且30 min 和45 min 處理組間差異不顯著（P>0.05）。這可能是因為長時間超聲處理導致巰基中的氫原子被空化產生的自由基捕獲，巰基發生氧化，并在肽鏈間或內部形成二硫鍵[41]。Zhang 等[42]也報道了相同的結論，超聲處理的豬臀中肌總巰基含量隨超聲時間的增加而降低。

隨著超聲時間的增加，活性巰基含量從0 min的32.17 nmol/mg 蛋白顯著增至38.57 nmol/mg 蛋白（60 min）（P<0.05）。這可能是因為長時間的超聲處理會使肌原纖維蛋白充分舒展，暴露出更多的活性巰基基團，從而導致含量升高，康大成[36]也證明了此結論。

表面疏水性是評估蛋白質結構的指標之一，肌原纖維蛋白與溴酚藍相互結合可以反映蛋白質的疏水情況。超聲時間越長，表面疏水性越強，當超聲時間60 min 時，其值達到51.30 μg（P<0.05）。這是因為超聲空化效應引起的機械力會破壞肌原纖維蛋白分子間作用力，蛋白質的展開和重折疊導致包埋的疏水性氨基酸暴露于表面，疏水性增加，這與Gulseren等[43]的研究結果一致。

3 結論

本研究表明增加超聲時間可以提高牛肉干的保水性、嫩度，促進食鹽滲透，改善產品色澤；并且，增加超聲時間促進了牛肉肌原纖維蛋白的氧化程度，表現為總巰基含量的降低，羰基含量、活性巰基含量的增加及表面疏水性的增強。當超聲時間大于30 min，牛肉干嫩度改善不明顯，且過長時間的超聲處理會增加顏色劣變、蛋白過度氧化等問題。綜上，確定超聲為30 min 牛肉干的整體品質最佳，該研究為超聲技術在肉干制品中的應用提供了思路，為工業化生產提供了理論參考。但目前關于超聲處理對膠原蛋白等其他蛋白組分的影響研究較少，超聲處理對牛肉干風味的影響也鮮見報道，因此，在這些方面有待進一步探究。