3種拮抗煙草疫霉及產IAA內生細菌的分離鑒定

李穎穎, 康業斌, 李成軍, 李淑君

(1.河南科技大學園藝與植物保護學院,河南洛陽 471000;2.煙草行業黃淮煙區煙草病蟲害綠色防控重點實驗室/河南省農業科學院煙草研究所,河南許昌 461000)

由煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)侵染煙草引起的黒脛病在全球普遍發生,嚴重威脅煙草農業生產[1]。生物防治成為煙草病害防治的發展趨勢[2]。內生細菌豐富多樣,幾乎存在于地球上所有的植物中,不少內生細菌具有促進植物生長、提高產品品質與增強植株抗病、抗逆能力的作用[3]。陳澤斌等通過培養皿發芽試驗,從煙草植株中初步篩選出 4 株能提高煙草種子發芽率、促進根系生長的內生細菌,浮育苗試驗發現用這些內生細菌處理過的煙苗生長發育更好[4]。雷麗萍從白肋煙 TN90 中分離出一株內生芽孢桿菌(Bacillussp.)菌株WT能顯著降低煙株中的亞硝胺(TSNA)含量[5]。邢穎等發現,相比普通煙株,感染內生菌的煙草中亞硝胺類物質含量更低,煙草品質更佳[6]。梁志超等發現,用內生解淀粉芽孢桿菌制成微生物功能基質,能達到促生煙苗的效果[7]。夏體淵等發現,通過控制生物炭的不同施用量可以調整煙草內生細菌的種類和數量[8]。周燕等在黃煙上發現了能夠防治煙草青枯病的內生細菌[9]。云南省煙草農業科學研究院建立了國內首個煙草內生菌資源庫,保存了具有較高殺線蟲活性、提高煙草種子發芽率、促進根系生長與對煙草黑脛病、空莖病、野火病等具有明顯拮抗作用的內生菌菌株[10]。周崗泉等研究發現,煙草中具有抑菌作用的內生細菌幾乎均來自抗病品種,抗病品種比感病品種具有更多的拮抗內生細菌[11]。目前,已經報道的煙草內生細菌有 30 多個屬,51 個種[10]。不同煙草種植地區、不同氣候條件和土壤類型,煙草植株體內內生細菌種類和數量存在差異。本研究報道了河南省洛陽地區煙株內生功能細菌的分離鑒定結果,旨在為煙株內生有益微生物的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙草植株 2021年6—9月,選擇河南省洛陽市宜陽、汝陽、洛寧、嵩縣等4個縣區煙田,于煙草團棵期、旺長期及成熟期采集健康煙株164株,帶回實驗室備用。

1.1.2 供試菌株和煙草品種 煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)、輪枝鐮刀菌(F.verticillioide)、異絲腐霉(Pythiumdiclinum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、層出鐮刀菌(F.proliferatum)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothide)以及煙草品種(秦煙96)均由河南科技大學植物病害分子鑒定與綠色防控實驗室提供。

1.1.3 供試培養基 主要培養基有NA培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、LB液體培養基、糖醇發酵培養基、M.R培養基、淀粉水解培養基、硝酸鹽還原培養基、明膠液化培養基、苯丙氨酸脫氨酶培養基、石蕊牛乳培養基、檸檬酸鹽培養基、休和賴夫森二氏培養基、半固體瓊脂培養基、丙二酸鹽培養基[12]。

1.2 試驗時間與地點

煙株樣品采集工作于2021年6、7、8、9月在河南省洛陽市宜陽縣石村煙草種植田、河南省洛陽市汝陽縣劉家凹煙草種植田、河南省洛陽市洛寧縣王村煙草種植田、河南省洛陽市嵩縣流澗峪村煙草種植田進行。

其他試驗部分于2021年6月至2022年12月在河南科技大學植物病害分子鑒定與綠色防控實驗室進行。

1.3 試驗方法

1.3.1 煙草內生細菌的分離、純化 將根、莖、葉通過清水沖洗后自然晾干,隨機稱取0.4 g,依次用70%乙醇、3%次氯酸鈉消毒,無菌水沖洗3次,以最后1次沖洗的無菌水涂布平板作為空白對照,檢驗樣品表面的微生物是否消毒徹底,通過稀釋涂布平板法分離[13]。

1.3.2 拮抗煙草疫霉內生細菌的篩選 (1)初篩:采用平板對峙法測定分離所得菌株對煙草疫霉的抑菌率[13]。(2)復篩:選擇初篩對煙草疫霉抑菌率大于50%的內生菌株,通過菌絲生長速率法檢驗其發酵液對煙草疫霉的抑菌率[14]。

1.3.3 產IAA內生細菌的篩選 參照桂楚伊的方法制備吲哚-3-乙酸(IAA)標準曲線[15],利用Salkowski比色法對菌株產IAA能力進行定性、定量測定[16]。

1.3.4 內生有益細菌的鑒定 選擇對煙草疫霉初篩抑菌率大于50%與菌株發酵液IAA含量在 3.7 mg/L 以上的菌株進行鑒定。(1)形態學鑒定:采用平板劃線法接種待鑒定菌株于NA平板,28 ℃倒置培養3 d,至平板長出單一菌落。觀察單菌落的顏色、形狀、大小、黏稠度、透明度、邊緣等形態特征。革蘭氏染色和芽孢染色后[15],通過光學顯微鏡觀察菌體和芽孢形態。(2)生理生化鑒定:菌株的M.R試驗、淀粉水解與糖醇類發酵等生理生化指標測定參照劉麗輝等的方法進行[17]。(3)16S rDNA 序列測定:根據生工生物工程(上海)股份有限公司細菌基因組DNA試劑盒方法提取DNA作為模板,采用細菌通用引物27F、1492R進行PCR擴增[18]。為了使鑒定結果更加準確,同時選用gyrB基因引物UP-1、UP-2R進行擴增測序驗證[19]。PCR擴增體系和反應條件見表1。擴增產物經過電泳檢測后,送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果在GenBank(NCBI)數據庫中進行BLAST比對,以同源性較高的模式菌株基因序列作為參比對象,通過MEGA 7.0軟件構建系統發育樹[20]。

表1 通用引物及PCR反應信息

1.3.5 細菌的抑菌譜測定 采用平板對峙培養法測定12株細菌對 7 種煙草病原菌的抑菌譜。以只接種病原真菌為空白對照,28 ℃倒置培養3～7 d,計算抑菌率。

1.3.6 細菌對煙草種子促生作用的測定 采用培養皿濾紙保濕法測定12株細菌對煙草種子萌發率的影響及促生效果[21]。將健康的煙草種子置于孢子懸浮液(1×107孢子/mL)中浸泡 16 h,整齊擺放于鋪有滅菌脫脂棉和濾紙保濕的培養皿中,以無菌水浸種為空白對照,每皿30粒(5×6),重復3次。第14天統計種子萌發率、煙苗根長、莖長和總長(以種子生長節點區分根長和莖長,總長為根長與莖長之和),計算增長率。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離

從164份煙株樣品的根、莖及葉片中分別分離出細菌單菌落133、99、157株,依據這些菌株在NA培養基上菌落的顏色、形態等特征進行歸類,共分離純化獲得206株細菌菌株。

2.2 拮抗煙草疫霉菌株的篩選

通過平板對峙法測定206株細菌對煙草疫霉的抑菌活性,抑菌率達50%以上的有24株(表2),其中菌株LYYY63-1、LYSX141的抑菌效果最好,抑菌率分別為74.79%、72.58%。菌株LYYY61-2的抑菌率為62.10%,抑菌帶最大,為1.48 cm。復篩結果表明,增加拮抗菌的接種量可以明顯提高菌株的抑菌效果,當PDA培養基中添加菌株發酵液至體積濃度為10%時,菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141對煙草疫霉的抑菌率分別達到88.10%、84.55%、73.33%(表3),說明增加空間用量能有效提高菌株的抑菌作用。

表2 內生細菌菌株對煙草疫霉的平板抑制效果

表3 內生細菌菌株發酵液對煙草疫霉的抑菌效果

2.3 產IAA菌株的篩選

2.3.1 IAA標準曲線 通過IAA不同質量濃度標準品溶液與Salkowski比色計進行顯色反應,用紫外分光光度計測量樣品溶液在波長535 nm處的吸光度。IAA標準品質量濃度分別為10、20、30、40、50 mg/L 時,測得吸光度分別為0.238、0.659、0.993、1.326、1.685,得到標準曲線y=0.035 6x-0.088 1,r2=0.998 1(圖1)。

2.3.2 IAA定性測定和定量測定 定性檢測篩選出能產生IAA的細菌菌株。利用紫外分光光度計法測定菌株發酵液的吸光度, 通過IAA標準曲線計算出各菌株產IAA含量,IAA產量在7 mg/L以上的有28株(表4)。

表4 產吲哚-3-乙酸優勢菌株的篩選結果

2.4 煙草內生功能細菌的鑒定

2.4.1 形態學特征 供試菌株在NA平板上劃線接種,置于28 ℃條件下恒溫培養3 d,大部分菌株呈現乳白色和白色,少部分呈現黃色,菌落整體上不透明,多為圓形或者近圓形。大小、表面特征和黏稠度特征存在差異。12株細菌革蘭氏染色結果表明,其中5株為陽性反應,7株為陰性反應(表5)。菌體呈桿狀,少數為卵球形,部分產芽孢,呈柱形。

表5 12株內生細菌的形態特征

2.4.2 生理生化鑒定 生理生化試驗結果表明,12株細菌多為兼性厭氧細菌, 菌株LYRY8、LYYY63-1為厭氧性菌。檸檬酸鹽利用、接觸酶、明膠液化和產酸反應試驗結果呈陽性,具有一定的運動性。可以利用葡萄糖、蔗糖和甘露糖,大部分能夠利用石蕊產酸,菌株LYRY45利用葡萄糖時能夠產氣(表6)。結合《常見細菌系統鑒定手冊》將11株拮抗細菌鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillusspp.),菌株LYRY45鑒定為變形桿菌屬(Proteussp.)。

表6 12株內生細菌的生理生化檢驗結果

2.4.3 12株內生細菌16S rDNA序列分析 將測序得到的12株細菌基因序列上傳至GenBank數據庫(獲得登錄號分別為OP646622、OP646623、OP646624、OP646625、OP646626、OP503441、OP646627、OP646628、OP646629、OP646630、OP646631、OP646632),并將基因測序結果進行序列分析及同源性對比。結果表明,菌株LYRY8的基因序列與B.safensisEGI287 (MN704552.1)同源相似性為99.68%,菌株LYYY61-2和LYRY69-2與B.safensisS21 (MN062620.1)同源相似性為99.55%,菌株LYYY117與B.safensisEGI287 (MN704552.1)同源相似性為98.39%,菌株LYRY25與B.subtilisJX-2 (KX708699.1)同源相似性為99.28%,菌株LYLN27與B.subtilisH10-7 (FJ392727.1)同源相似性為99.37%,菌株LYRY39-1與B.subtilisUK19 (ON357947.1)同源相似性為97.53%,菌株LYYY63-1與B.subtilisB11 (KJ870191.1)同源相似性為98.50%,菌株LYYY63-3與B.subtilisHGUP332 (MK103123.1)同源相似性為97.81%,菌株LYSX73與B.subtilisSRCM102750 (CP028215.1)同源相似性為98.69%,菌株LYSX141與B.subtilisACHB-2 (KU867636.1)同源相似性為99.46%。構建系統發育樹(圖2)發現有4株細菌與沙福芽孢桿菌位于同一進化分支,親源關系最近;另7株細菌與枯草芽孢桿菌位于同一進化分支,親源關系最近。菌株LYRY45與ProteusmirabilisM3-1-17 (CP053681.1) 同源相似性為99.13%。構建系統發育樹(圖3)發現LYRY45與奇異變形桿菌位于同一進化分支。gyrB序列測定結果也與上述一致。

結合形態學鑒定、生理生化檢驗及16S rDNA序列分析,將YRY25、LYLN27、LYRY39-1、LYYY63-1、LYYY63-3、LYSX73、LYSX141菌株鑒定為枯草芽孢桿菌 (B.subtilis),LYRY8、LYYY61-2、LYRY69-2、 LYYY117菌株鑒定為沙福芽孢桿菌(B.safensis),均屬厚壁菌門,芽孢桿菌綱,芽孢桿菌目,芽孢桿菌科,芽孢桿菌屬。LYRY45菌株鑒定為奇異變形桿菌 (P.mirabilis),屬變形菌門,變形菌綱,腸桿菌目,腸桿菌科,變形桿菌屬。

2.5 功能細菌的抑菌譜測定

試驗結果證明,12株功能細菌對7種常見的煙草病原真菌均表現出不同程度的拮抗作用,抑菌率介于0.68%～71.28%(表7),具有較好的抑菌廣譜性。對比結果發現,12株細菌對輪枝鐮刀菌、異絲腐霉和立枯絲核菌的拮抗效果最好,抑菌率平均值高于其他病原真菌。沙福芽孢桿菌菌株LYYY61-2、LYRY8、LYYY117對立枯絲核菌的防治效果最好,抑菌率分別為71.28%、70.95%、61.15%。

表7 12株細菌對常見煙草病原真菌的抑制作用

2.6 功能細菌對煙草種子促生作用的測定

培養皿濾紙保濕法結果顯示(表8),浸種處理后,除菌株LYRY8、LYLN27、LYSX73未表現出明顯促生作用外,9株細菌的萌發率、根長均高于空白對照組。菌株LYRY45促生效果顯著,出芽率達到98%,促進根部生長37.76%,LYYY117菌株次之。

表8 12株細菌懸浮液浸種對種子萌發及生長的影響

3 討論與結論

煙草中已報道的內生細菌資源包括芽孢桿菌屬、微桿菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬等[6]。陳澤斌等報道芽孢桿菌是煙草內生菌的優勢類群[22-23]。本研究篩選出的12株內生細菌,有11株鑒定為芽孢桿菌屬,占比91.67%,與陳澤斌等的報道[22]相符。楊桃從煙株上分離出內生枯草芽孢桿菌Itb57,證實該菌株對煙草疫霉抑菌效果良好,研究發現其抑菌活性與蛋白物質有關[24]。馬冠華等先后報道了枯草芽孢桿菌對煙草黑脛病、煙草青枯病具有良好的防治效果[25-27]。本試驗得到的7株枯草芽孢桿菌對茄病鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、異宗腐霉、立枯絲核菌以及尖孢鐮刀菌均表現出明顯的抑制作用。菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141對煙草疫霉的平板抑制拮抗效果可達88.10%、84.55%和73.33%,形態和顏色特征與馬冠華分離鑒定的Itb57菌落較相似[25],生理生化特征略有差異,分析這與菌落培養環境條件不同有關。

沙福芽孢桿菌作為生防內生細菌,目前已在核桃、槐樹、瓜果類和木豆等植物體內發現[28-31],煙草方面相關研究甚少。焦蓉等曾在煙草種子部位發現一株具有拮抗和促生作用的沙福芽孢桿菌菌株YN201702[32]。本研究獲得的沙福芽孢桿菌菌株LYRY8、LYYY117、LYYY61-2對煙草疫霉的室內抑菌率分別達到67.06%、64.72%和62.10%,菌株LYYY69-2的抑菌率為69.04%,在煙草植株的莖部、葉部均有分離發現,具備作為生防菌的良好潛力。抑菌譜試驗結果說明菌株LYRY8、LYYY61-2、LYYY117針對立枯絲核菌具有顯著的抑制效果。煙種經菌株LYYY117發酵液處理后,萌發率達到96.67%,較空白對照組根長、莖長及總長指標均具有明顯提高。相比于室內培養,室外田間環境易受各種因素干擾影響,情況更加復雜多變,生防菌的作用效果尚需要結合盆栽或田間試驗進行驗證。

本研究首次于煙株體分離出奇異變形桿菌菌株LYRY45。奇異變形桿菌常作為動物體的病原菌存在[33]。試驗分離得到的菌株LYRY45相比其他11株細菌產IAA含量更高,在LB液體培養基中IAA產量為11.06 mg/L。種子萌發試驗的萌發率達98.00%,促進根長增長37.76%,莖長增長21.43%,總長增長33.96%,其促生效果明顯高于其他菌株處理,與IAA含量測定試驗結果一致,促進作用顯著。內生菌促生作用的機制途徑復雜,這種產生植物生長素的機制在煙株體內能否表達及對植株生長的促進作用是否穩定仍需驗證研究。

本研究篩選得到的12株煙草內生細菌,經鑒定為枯草芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、奇異變形桿菌3類,對煙草疫霉具有顯著的抑制作用及產IAA能力,抑菌譜廣且具備一定的促生作用,具有較好的應用潛力。