桑黃子實體多糖的提取工藝優化、結構解析及免疫活性分析

張琨霖，王賀琪，郭慶彬,2，劉歡歡,2，梁宏合，王 樂，李貞景,2,

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津科技大學食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；3.廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001；4.河南省食品檢驗研究院，河南鄭州 450003）

隨著人民生活水平的不斷提高，慢性病已成為嚴重威脅人類健康、影響國民經濟和社會發展的重大公共衛生問題[1-2]。食用菌對糖尿病、心血管疾病和消化系統疾病等慢性疾病具有良好的治療效果[3]。食用菌中不僅含有如黃酮，多酚和多糖等多種功能成分[4]，而且還含有豐富的微量元素、膳食纖維、蛋白質、維生素和礦物質等營養物質[5-6]。因此，食用菌在醫藥、功能食品等領域有著廣泛的應用。

桑黃（Phellinus igniarius），屬真菌界，擔子菌門，擔子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，木層孔菌屬，是一種珍稀的食藥用真菌，主要分布和種植在東亞，特別是中國、日本和韓國[7]。兩千年前，漢代的《神農本草經》記載其具有疏通血脈、祛除瘀血、緩解腹痛和治療慢性腹瀉等功效[8]。現代醫學研究表明，桑黃具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖和免疫調節等多種藥理活性[9-10]，這些生理活性與桑黃的化學成分密切有關[11]。

多糖是一類主要的生物活性大分子，普遍存在于微生物、植物和動物等自然資源中[12]。桑黃多糖是桑黃中最重要的活性成分之一，其具有抗氧化[7]、抗腫瘤[9]、降血糖[11]和免疫調節[13]等潛在的生物活性。目前，雖然對桑黃多糖的化學結構和生物活性已有大量研究，但因為桑黃種屬較多，不同品種的桑黃中多糖的結構及生物活性具有較大差異。本研究采用單因素實驗及正交試驗優化桑黃子實體多糖的提取工藝條件，采用水提醇沉法提取多糖、經酶解法和透析法對多糖進行除雜純化，并通過相對分子質量測定、傅里葉紅外光譜、單糖組成及甲基化分析其化學結構。然后，采用RAW-Blue?細胞分泌胚胎堿性磷酸酶（SEAP）實驗、吞噬實驗研究其免疫調節活性，旨在為桑黃的利用和進一步的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

楊樹桑黃（Phellinus igniarius）天津市園藝工程研究所提供；無水乙醇、甲醇、氨水、二氯甲烷、二甲基亞砜 均為分析純，天津市江天化工有限公司；濃硫酸、苯酚、硝酸鈉 均為分析純，天津市化學試劑一廠；復合蛋白酶、葡萄糖標準品、單糖標準品、葡聚糖標準品、脂多糖 均為優級純，美國Sigma 公司；氫氧化鈉 分析純，上海生工生物有限公司；冰乙酸、無水硫酸鈉 均為分析純，天津市大茂有限公司；三氟乙酸 分析純，北京百靈威有限公司；DMEM 培養基（生物試劑）美國Gibco 公司；磷酸鹽緩沖液 優級純，上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清（生物試劑）美國Gemini 公司；雙抗（生物試劑）美國Hyclone 公司；RAW-Blue?細胞、QUANTI-Blue?顯色劑 均為生物試劑，美國Invivogen 公司。

X622-ZH 型電子天平 奧豪斯中國分公司；RE-2000 型旋轉蒸發儀 上海亞榮儀器廠；INFINITE 200 PRO 型酶標儀 瑞士TECAN 公司；6890N 型氣質聯用儀 安捷倫科技有限公司；IS50 型傅里葉紅外光譜 尼高利公司；Prominence LC-20A 型示差高效液相色譜儀 日本島津公司；ICS-5000+離子色譜儀 美國Dionex 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑黃子實體多糖的提取

1.2.1.1 提取方法 桑黃子實體多糖采用水提醇沉法提取[14]。桑黃子實體經烘干、粉碎過60 目篩后，加入蒸餾水（料液比1:40），加熱100 ℃，攪拌2 h，離心（6000 r/min，25 ℃，30 min）并收集上清液，重復3 次。加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置48 h。離心（6000 r/min，20 ℃，20 min）后取沉淀烘干得到桑黃水提物（SP-1）。

通過酶解法和透析法對桑黃水提物進行除雜純化。桑黃水提物經完全溶解后，向其中添加3%復合蛋白酶，在40 ℃、pH7 的條件下攪拌2 h 去除蛋白，煮沸滅酶。離心（6000 r/min，20 ℃，20 min）后將上清液用透析袋（8000～14000 Da）透析2 d。離心（6000 r/min，20 ℃，20 min）去掉沉淀，將上清液旋蒸濃縮后，加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置48 h。離心（6000 r/min，4 ℃，20 min）取沉淀，經真空冷凍干燥得到桑黃子實體多糖（SP-2）。

1.2.1.2 總糖純度及多糖得率的測定 總糖純度的測定采用苯酚-硫酸法[15]。

標準曲線制備：以2 mL 不同濃度的葡萄糖溶液為標準品，分別加入50 μL 80%苯酚和3 mL 濃硫酸，混勻，冷卻至室溫，490 nm 處測其吸光度。

樣品測定：稱取10 mg 樣品，加入1 mL 72% H2SO4，室溫攪拌30 min，使樣品完全溶解，稀釋至0.2 mg/mL，取2 mL 稀釋液，加入50 μL 80%苯酚溶液，3 mL 濃硫酸，混勻，冷卻至室溫后測定吸光度，根據下式計算樣品中總糖純度：

式中：C 為從標準曲線查得總糖濃度（mg/mL）；V 為測定時樣品的體積（mL）；m 為樣品的質量（mg）。

多糖得率的計算公式如下：

式中：m 為樣品的質量（mg）；m1為提取后多糖的質量（mg）；C1為提取后多糖的總糖純度（%）。

1.2.1.3 單因素實驗設計 提取溫度：稱量5 g 樣品，在料液比為1:30（g/mL）、提取時間為1.5 h、提取次數為1 次、醇沉時加入無水乙醇的倍數為4 倍、醇沉時間為靜置過夜的條件下，考察不同提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）對多糖得率的影響。

提取時間：稱量5 g 樣品，在提取溫度為80 ℃、料液比為1:30（g/mL）、提取次數為1 次、醇沉時加入無水乙醇的倍數為4 倍、醇沉時間為靜置過夜的條件下，考察不同提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對多糖得率的影響。

料液比：稱量5 g 樣品，在提取溫度為80 ℃、提取時間為1.5 h、提取次數為1 次、醇沉時加入無水乙醇的倍數為4 倍、醇沉時間為靜置過夜的條件下，考察不同料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL）對多糖得率的影響。

提取次數：稱量5 g 樣品，在提取溫度為80 ℃、提取時間為1.5 h、料液比為1:30（g/mL）、醇沉時加入無水乙醇的倍數為4 倍、醇沉時間為靜置過夜的情況下，考察不同提取次數（1、2、3、4、5 次）對多糖得率的影響。

1.2.1.4 正交試驗設計 根據文獻[16-17]調研及單因素實驗確定的條件范圍設計正交試驗方案，因為提取溫度、提取時間以及料液比對實驗的影響較大，所以本實驗采用以上三者作為實驗因素，提取次數選擇3 次，依據L9（34）正交表開展三因素三水平正交試驗，探究桑黃子實體多糖的最優提取條件。正交試驗因素水平設計如表1 所示。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.2 相對分子質量的測定 用高效凝膠排阻色譜法測定桑黃子實體多糖的分子量[18]，不同分子量的葡聚糖（10、40、70、500 和2000 kDa）為標準品。色譜條件如下：

色譜柱：Ultrahydrogel 7.8×300 mm 線性柱和Ultrahydrogel 6×40 mm 保護柱；流動相：0.1 mg/mL NaNO3；流速：0.6 mL/min；柱溫箱溫度：40 ℃。

1.2.3 傅里葉紅外光譜的測定 稱取1 mg 樣品和150 mg 干燥的KBr。用研缽研磨均勻，壓片后進行傅里葉紅外光譜掃描[19]。得到波數范圍為4000～400 cm-1的傅里葉紅外光譜圖。

1.2.4 單糖組成的測定 根據文獻[20]方法并做適當改進，進行桑黃子實體多糖的單糖組成測定，具體操作方法如下：

樣品測定：稱取1.5 mg 樣品于安瓿瓶中，加入1.5 mL 2 mol/L 三氟乙酸，封口，120 ℃水解3 h，減壓旋干。加入0.5 mL 甲醇，減壓旋干（重復5 次），最后將產物完全溶于1.5 mL 超純水中，使用離子色譜儀鑒定樣品單糖組成。

標品測定：稱取單糖標準品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）1 mg，分別溶于1 mL 水中，各取500 μL 混合加水稀釋至5 mL，使用離子色譜儀鑒定標準品單糖組成。離子色譜條件如下：

色譜柱：Dionex CarboPacTMPA20，3×150 mm；流動相：A 相為超純水，B 相為0.2 mol/L NaOH 溶液，C 相為1 mol/L 醋酸鈉溶液；流動相體積比例：A 相:B 相:C 相=5:2:1；流速：0.45 mL/min；柱溫箱溫度：30 ℃。

1.2.5 甲基化分析 參考文獻[1]的方法進行多糖的甲基化分析。稱取3 mg 樣品溶于0.5 mL 二甲基亞砜中，加入20 mg 氫氧化鈉和0.5 mL 碘甲烷，攪拌2.5 h。加入3～5 mL 去離子水，振蕩萃取，去掉水層，重復3 次。吸取有機相，過無水硫酸鈉柱，再用0.5 mL二氯甲烷洗2 次柱子，得到的有機相組分進行氮氣吹干。再加入0.5 mL 4 mol/L 三氟乙酸100 ℃水解6 h，氮氣吹干，加入0.3 mL 去離子水、50 μL 50 mg/mL氨水和3 mg 硼氘化鈉，室溫攪拌12 h。加入250 μL冰乙酸，再加入0.5 mL 含5%醋酸的甲醇，氮氣吹干，重復4 次，加入0.5 mL 乙酸酐，100 ℃加熱2 h，冷卻后加250 μL 無水乙醇，氮氣吹干后加入0.5 mL二氯甲烷溶解，過無水硫酸鈉柱，用0.5 mL 二氯甲烷清洗2 次柱子，得到最終產物進行GC-MS 檢測。檢測條件如下：

色譜柱：5%苯基～95%甲基硅氧烷毛細管色譜柱；檢測器：火焰離子檢測器；色譜柱程序升溫：120 ℃保持3 min，以3 ℃/min 速度升溫至210 ℃，210 ℃再保持4 min；色譜柱流速：10 mL/min；進樣口溫度：280 ℃；進樣體積：2 μL；N2流速：25 mL/min；H2流速：30 mL/min；空氣流速：400 mL/min。

1.2.6 桑黃子實體多糖的免疫調節活性測定

1.2.6.1 細胞復蘇 在無菌37 ℃水浴鍋中，將凍存的RAW-Blue?巨噬細胞迅速融化。將細胞轉移至放有9 mL 完全培養基（由基礎培養基加上10%的胎牛血清和1%由青霉素-鏈霉素組成的雙抗配制而成）的離心管中，1000 r/min 離心5 min 后棄上清液，加入完全培養基重懸細胞，轉移至培養瓶中，再加入適量完全培養基，混勻后放入37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。

1.2.6.2 細胞傳代 取處于對數生長期的RAWBlue?細胞進行傳代。將培養瓶中的培養基棄去，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，然后加入適量完全培養基，用細胞刮刀將細胞刮下，制成細胞懸液，吸取部分細胞液轉移至新培養瓶中，加入適量完全培養基，吹打均勻，放入37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。

1.2.6.3 多糖對RAW-Blue?細胞分泌SEAP 的影響 棄去培養瓶中的培養基后用PBS 洗2 次，加適量完全培養基刮下細胞，吸取細胞計數，配制濃度為5.5×105個/mL 的細胞液。在96 孔板中每孔加入195 μL 配制完成的細胞液，再加入5 μL 50 μg/mL多糖溶液，空白用PBS 補全，陽性對照加入5 μL 2 μg/mL 的脂多糖（LPS），放入培養箱中培養24 h。將40 μL 細胞液轉移至新的96 孔板中，加入160 μL的QUANTI-Blue?顯色劑，放入培養箱中培養2 h，測定620 nm處吸光度。

1.2.6.4 多糖的細胞吞噬能力測定 采用中性紅實驗分析多糖對RAW-Blue?細胞吞噬能力的影響[21]，取對數生長期的巨噬細胞，經PBS 清洗、吹打混勻后，取100 μL 按5×104個/孔的細胞密度將細胞懸液接種于96 孔板中，在培養箱中培養12 h 使細胞貼壁完全，棄去完全培養基，加入不同樣品，培養24 h，棄上清液，加入100 μL 中性紅溶液，培養30 min，棄上清，用PBS 清洗3 次，加入200 μL 醋酸-乙醇細胞裂解液，測定540 nm 處吸光度，根據下式計算細胞吞噬中性紅的能力：

式中：A實為實驗孔吸光度值；A零為調零孔吸光度值。

1.3 數據處理

采用Excel 2010 軟件進行數據處理，采用SPSS 26 軟件做差異顯著性分析，其中所有實驗均為3 次重復，以平均值±標準差表示，采用Origin 2022 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 桑黃子實體多糖提取條件的優化

2.1.1 桑黃子實體多糖提取條件的單因素實驗

2.1.1.1 提取溫度對桑黃子實體多糖得率的影響提取溫度是影響多糖得率的一個重要因素。如圖1所示，隨著提取溫度增加，多糖得率也增加，當提取溫度增至80 ℃時，多糖得率達到最高值為5.31%。隨著提取溫度的繼續增加，多糖得率反而出現下降。這可能是因為加熱促進了多糖的浸出，提高了多糖得率，但是過高的溫度又引起了多糖的降解[22]，從而導致得率下降。因此，提取溫度選擇80 ℃為宜。

圖1 提取溫度對桑黃子實體多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of polysaccharide from Phellinus igniarius

2.1.1.2 提取時間對桑黃子實體多糖得率的影響提取時間是多糖提取時的一個重要參數。如圖2 所示，隨著提取時間增加，多糖得率也增加，當提取時間增至1.5 h 時，多糖得率達到最高值為5.31%。當提取時間為2.5 h 時，多糖得率反而出現下降。這可能是因為繼續增加提取時間可能會導致多糖的分解[23]。因此，提取時間選擇1.5 h 為宜。

圖2 提取時間對桑黃子實體多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of polysaccharide from Phellinus igniarius

2.1.1.3 料液比對桑黃子實體多糖得率的影響 料液比對多糖得率的影響較大。如圖3 所示，隨著料液比增加，多糖得率也增加，當液料比增至1:30（g/mL）時，多糖得率達到最高值為5.31%。繼續加大料液比，多糖得率并未出現顯著變化。提取過程中增加料液比可以在一定程度上促進原料與提取液充分接觸，從而提高得率，當提取液達到飽和，繼續增加提取液可能對多糖的浸出沒有明顯的影響，甚至有時還會增加其他雜質的溶出，導致多糖得率降低[24]。因此，料液比選擇1:30（g/mL）為宜。

圖3 料液比對桑黃子實體多糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on yield of polysaccharide from Phellinus igniarius

2.1.1.4 提取次數對桑黃子實體多糖得率的影響由圖4 可知，隨著提取次數的增加，桑黃子實體多糖得率呈增加趨勢。且當提取次數增至3 次后，多糖得率未出現顯著性增長。考慮經濟因素，最終選擇提取次數為3 次，此條件下的多糖得率為6.23%。

圖4 提取次數對桑黃子實體多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on yield of polysaccharide from Phellinus igniarius

2.1.2 桑黃子實體多糖提取條件的正交試驗 上述單因素實驗確定了正交試驗的因素和水平，以多糖得率為指標，進行L9（34）正交試驗。由極差分析結果可知（表2），影響多糖得率的因素主次順序為提取時間（B）>提取溫度（A）>料液比（C），最優水平組合為A3B3C3，即料液比為1:40（g/mL），提取溫度為100 ℃，提取時間為2.0 h。由于最優組合A3B3C3未出現在正交表中，因此與正交表中的最高得分組A3B3C2進行驗證實驗。驗證實驗結果A3B3C3的多糖得率6.71%顯著高于A3B3C2的多糖得率6.53%（P<0.05），證明A3B3C3為最優組合。

表2 桑黃多糖提取正交試驗Table 2 Orthogonal test of extracting polysaccharides from Phellinus igniarius

2.2 桑黃子實體多糖的總糖純度及相對分子質量測定

以葡萄糖為標準品，葡萄糖濃度mg/mL 為橫坐標，OD 值（490 nm）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線：y=11.997x+0.0776，R2=0.9996。經測定得出SP-1的總糖純度為60.05%±0.11%，SP-2 的總糖純度為81.69%±0.19%。以分子量的對數值為橫坐標，保留時間為縱坐標繪制標準曲線：y=-1.7962x+17.918，R2=0.9936。根據分子量標準曲線，可計算出SP-2 的分子量約為10.77 kDa。有研究表明[11]，桑黃多糖的分子量約為17.7 kDa，與本研究結果略有不同，這可能與實驗所采用的提取方法不同有關。

2.3 傅里葉紅外光譜分析

通過傅里葉紅外光譜分析，能比較準確地對多糖的官能團進行分析。使用KBr 壓片法[25]對SP-2 進行傅里葉紅外光譜掃描，其結果如圖5 所示。SP-2具有糖類物質的特征吸收峰。其中，3397.25 cm-1處出現一個吸收強度較大的峰，是桑黃多糖分子中O-H 的伸縮振動所形成的；2922.88 cm-1處的峰，是C-H 的伸縮振動所形成的；1624.56 cm-1處為C=O的伸縮振動峰；1200～1400 cm-1處的3 個峰，是C-H的彎曲振動所形成的；1000～1200 cm-1處的2 個峰，是C-O-R 的伸縮振動峰。綜上所述，該物質是一種糖類化合物。

圖5 桑黃子實體多糖傅里葉紅外光譜圖Fig.5 FT-IR of polysaccharides from Phellinus igniarius

2.4 單糖組成測定

用離子色譜法對SP-2 進行單糖組分分析。離子色譜法是單糖組成分析的常用方法，根據單糖標準品的保留時間確定樣品中單糖的種類，利用不同濃度單糖標準品的峰面積繪制標準曲線，根據樣品峰面積確定單糖含量[26]。對照標準品的離子色譜圖圖6 可看出，SP-2 的單糖組分比較簡單，主要為葡萄糖，幾乎不含有其他單糖，所以可以推測SP-2 是一種葡聚糖。有研究表明[27]，桑黃多糖的主鏈由葡萄糖組成，支鏈由甘露糖組成，與本研究結果略有不同，可能與桑黃的品種、提取方法及條件等不同有關。

圖6 桑黃子實體多糖單糖組成圖Fig.6 Monosaccharide composition of polysaccharides from Phellinus igniarius

2.5 甲基化分析

甲基化分析是一種測定多糖中糖苷鍵類型的常用方法。采用GC-MS 對SP-2 進行甲基化分析，通過對色譜峰的保留時間及質譜信息進行對比，如表3所示，SP-2 主要由（1→4）-Glc、T-Glc、（1→4,6）-Glc、（1→3,4）-Glc、（1→6）-Glc 構成，其摩爾百分比為61.36:19.51:8.90:5.58:4.64。根據單糖組成和甲基化分析的結果，推測SP-2 的主要由（1→4）-Glc 組成，并含有少量的（1→6）-Glc 和（1→3）-Glc。

表3 桑黃子實體多糖的單糖連接方式Table 3 Monosaccharide linkage mode of polysaccharides from Phellinus igniarius

2.6 桑黃子實體多糖的免疫調節活性分析

2.6.1 多糖對RAW-Blue?細胞分泌SEAP 的影響 采用比色法測定多糖對RAW-Blue?細胞分泌SEAP 的影響[28]，RAW-Blue?細胞來源于RAW 264.7巨噬細胞。它們能穩定表達NF-κB 和AP-1 轉錄因子誘導的SEAP 基因。在細胞上的受體作用下RAWBlue?細胞能夠激活NF-κB 和/或AP-1，導致SEAP分泌，當使用QUANTI-Blue? SEAP 檢測介質時，即可觀察到SEAP 的分泌量[29]。實驗結果如圖7 所示，LPS 陽性對照組能顯著（P<0.05）增強RAWBlue?細胞分泌SEAP 的活性，與空白對照組相比，桑黃子實體多糖均能夠影響RAW-Blue?細胞分泌SEAP 的活性，且均顯著（P<0.05）高于空白對照組，說明桑黃子實體多糖促進了RAW-Blue?細胞分泌SEAP 的活性。SP-2 能夠顯著（P<0.05）增強RAWBlue?細胞分泌SEAP 的活性，然而，與SP-2 相比，SP-1 對RAW-Blue?細胞分泌SEAP 活性促進作用較小。

圖7 桑黃子實體多糖對RAW-Blue?細胞分泌SEAP 的影響Fig.7 Effects of polysaccharides from Phellinus igniarius on SEAP secretion in RAW-Blue? cells

2.6.2 多糖對細胞吞噬能力的影響 吞噬作用是巨噬細胞活化的主要指標之一，所以可以通過測定巨噬細胞的吞噬能力來研究其免疫調節活性[30]，采用中性紅法測定多糖對巨噬細胞吞噬能力的影響。RAWBlue?巨噬細胞的吞噬能力實驗結果如圖8 所示，LPS 陽性對照組能顯著（P<0.05）促進巨噬細胞的中性紅吞噬能力，實驗組中，SP-2 能夠顯著（P<0.05）增強RAW-Blue?巨噬細胞的吞噬活性。然而，與SP-2 相比，SP-1 對RAW-Blue?巨噬細胞吞噬活性促進作用較小，這可能和多糖的含量差異有關。Liu等[31]研究發現，桑黃多糖能促進RAW 264.7 細胞增殖，增強其吞噬能力，促進其分泌IL-6 和TNF-α細胞因子，并增強細胞周期中的S 期，顯示出明顯的免疫調節活性，這與本實驗的結果相似。

圖8 桑黃子實體多糖對RAW-Blue?細胞吞噬能力的影響Fig.8 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the phagocytosis of RAW-Blue? cells

3 結論

本研究采用水提醇沉法提取桑黃子實體多糖、經酶解法和透析法對桑黃子實體多糖進行除雜純化，通過單因素實驗及正交試驗確定了多糖提取的最優工藝條件為料液比為1:40（g/mL），提取溫度為100 ℃，提取時間為2.0 h，提取次數為3 次，該條件下多糖得率為6.71%；總糖純度為81.69%±0.19%，分子量為10.77 kDa，其主要由（1→4）-Glc 組成，并含有少量的（1→6）-Glc 和（1→3）-Glc。免疫調節活性實驗表明，桑黃子實體多糖可以增強RAW-Blue?細胞分泌SEAP 的活性，并能增強RAW-Blue?巨噬細胞的吞噬能力，故其具有較好的免疫調節活性。本研究為桑黃的推廣應用和深度開發提供了技術支持和理論依據。但是，本研究對桑黃子實體多糖的研究尚處于初級階段，對其活性研究還不夠完全，對其化學結構和在體內的作用機制尚不完全清楚，對桑黃子實體多糖的深層次的結構及構效關系還有待于進一步的研究。