利用畢赤酵母底盤產生大麻二酚酸合成酶及其催化活性分析

牛庭莉，田 媛，張利國，張樹權，李志江，康 悅，遲 建，高寶昌,，戴凌燕,

（1.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省科學院大慶分院植物化學研究所，黑龍江大慶 163316；3.黑龍江省農業科學院經濟作物研究所，黑龍江哈爾濱 150086；4.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319）

大麻是一年生麻科草本植物，被稱為大麻或漢麻，在世界各地種植已有數千年，主要應用在醫藥、化工和食品領域[1-2]。天然產物大麻素是大麻植物產生的獨特次級代謝物，主要存在于大麻的毛狀體油室中，是由聚酮和單萜亞結構組成。目前為止，已分離出100 多種大麻素[3]。其中，酸性大麻素四氫大麻酚酸（THCA）、大麻二酚酸（CBDA）和大麻環萜酚酸（CBCA）含量最豐富，且三者均以CBGA 為底物經酶催化而成。其他類型大麻素大多是由這三種物質在熱和光照下通過非酶轉化、降解反應和自氧化等方式獲得[4-5]。在這些代謝物中，具有精神活性的Δ9-四氫大麻酚（THC）[6]，由于具有潛在的治療價值，包括鎮痛、抗驚厥、止吐和開胃性而備受關注[7-8]。大麻二酚（CBD）是一種與THC 具有不同環狀結構的同分異構體，近年來在治療阿爾茲海默病、帕金森病、癲癇，以及抗腫瘤和神經保護等方面發揮著重要作用[9-11]。此外，CBD 在食品和化妝品上的應用也比較廣泛。CBD 油可緩解焦慮，CBD 糖漿可以安神和緩解疼痛，CBD 蘇打水可以舒緩痛癥和調節亞健康問題；還有加入適量CBD 的餅干、巧克力、啤酒、披薩等食品，具有獨特香氣，讓人身心愉悅[12]；含有CBD 的化妝品具有舒緩皮膚敏感，抗炎及治療粉刺等作用[13]。但目前CBD 原料短缺、價格高昂、生物提取得率低等問題，限制了其產業發展和應用領域拓展。

酵母表達系統在上個世紀70 年代被發現，在2006 年經美國FDA 批準，獲得“最安全微生物”稱號[14-15]。畢赤酵母（Pichia pastoris）是在甲醇培養基中生長的一種甲基營養菌，可利用AOX1 啟動子來驅動外源蛋白的高水平表達[16-17]。酵母異源表達系統有許多優點，發酵培養基取材穩定、成本低廉、繁殖快速；與細菌相比，具有翻譯后修飾，易于遺傳操作等優勢[18]。外源目的基因線性化后，利用同源重組方式可將外源基因高效整合到酵母細胞的染色體中，產生穩定的細胞系[19-23]。

大麻二酚酸合成酶（CBDAS）可催化底物CBGA生成CBDA，而CBDA 在高溫下易脫羧形成CBD。以大麻花葉為材料生物提取大麻素的粗提液中含有很多組分，其中還有一定含量的CBGA 未被完全轉化。若能利用操作簡便，經濟高效的方法獲得CBDAS，便可通過體外反應將粗提液中殘存的CBGA 進一步單一轉化成CBD。本研究以高含量CBD 品種為材料，采用PCR 克隆技術獲得CBDAS基因，并構建酵母表達載體，在畢赤酵母中重組表達，利用高效液相色譜分析CBDAS 合成酶的催化活性。研究結果可為工業化定向提高CBD 生物提取率奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麻材料 由黑龍江省農業科學院經濟作物所提供；畢赤酵母GS115 和大腸桿菌DH5α感受態購自昂羽生物技術（上海）有限公司；pPIC9K-His 載體 購自淼靈生物技術（武漢）有限公司；GreenGate克隆載體C000 本實驗室保存；植物DNA 提取試劑盒 天根生化科技（北京）公司；質粒提取試劑盒索萊寶科技（北京）有限公司；膠回收試劑盒 Omega（美國）公司；限制性內切酶EcoRI、NotI、SacI 和PstI NEB（美國）公司；高保真酶Phanta Super-Fidenlity DNA Polymerase 諾唯贊生物科技（南京）有限公司；ThunderbirdTM SYBR? qPCR Mix TOYOBO（日本）公司。

5428 高速冷凍離心機 德國艾本德公司；Veriti96梯度PCR 擴增儀 美國賽默飛公司；HB-96D 恒溫槽 韓國WiseTherm 公司；HV-50 高壓蒸汽滅菌器 日本Hirayama 公司；V-1300 可見光分光光度計 上海美析儀器公司；NS-100B 恒溫振蕩搖床 杭州川恒實驗儀器公司；CFX96 實時熒光定量PCR 儀 美國伯樂公司；1260 高效液相色譜儀 美國安捷倫。

1.2 實驗方法

1.2.1 大麻基因組提取 稱取適量高CBD 含量的大麻葉片經液氮研磨后，按照植物DNA 提取試劑盒說明書提取總基因組。使用NanoDrop2000 檢測DNA 濃度和質量。DNA 保存在-20 ℃備用。

1.2.2CBDAS基因的克隆 使用Primer3 plus（https://www.primer3plus.com/）在線網站設計特異引物。以大麻基因組DNA 為模板進行PCR 擴增。本實驗選用高保真聚合酶進行目的片段的擴增，PCR 擴增程序：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共32 個循環，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，按照膠回收試劑盒說明書進行純化。將純化產物與C000 載體連接生成C000-CBDAS 載體，轉化DH5α感受態后選取陽性克隆進行測序。引物合成和測序均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息學分析 使用Snapgene 軟件將測序后的CBDAS基因序列翻譯成氨基酸，利用在線軟件Expasy（https://www.expasy.org/）中的ProtParam-和ProtScale 分析CBDAS 蛋白的基本理化性質和親/疏水性，利用Smart（http://smart.embl-heidelberg.-de/）和NCBI 的CD-search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）在線軟件分析CBDAS 蛋白的保守結構域，利用NetNGlyc-1.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）在線軟件分析CBDAS蛋白的糖基化位點。

1.2.4 酵母表達載體的構建 設計含有NotI 和EcoRI酶切位點的特異性引物ppCBDAs-F 和ppCBDAs-R，保護堿基和酶切位點用下劃線表示（見表1）。以C000-CBDAS 質粒為模板，用帶接頭引物進行PCR擴增，PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收。使用NotI 和EcoRI 酶分別對回收產物和pPIC9K載體進行雙酶切，純化后連接成pPIC9K-CBDAS 質粒，并轉化大腸桿菌，通過測序和酶切鑒定篩選陽性克隆。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.5 酵母轉化和陽性重組菌的篩選 將重組質粒pPIC9K-CBDAS 經SacI 限制性內切酶進行線性化，再通過電轉化方式導入畢赤酵母GS115 感受態中；將細胞液均勻涂布于MD 固體培養基上，于30 ℃倒置培養3～5 d。參考趙明明等[24]方法，用去離子水沖洗平板上的菌落并收集，吸取200 μL 菌液涂布于不同G418 濃度（1、2、4、6 mg/mL）的YPD 平板上，于30 ℃倒置培養3～5 d。挑取YPD 平板上的單克隆，采用高溫-乙酸乙酯法提取酵母基因組[25]；以AOX1-F 和CBDAS-R 為引物進行PCR 鑒定。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 15 s，32 個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.6 重組蛋白的誘導表達 參考盧可心[26]方法，挑取鑒定為陽性的重組菌接種至YPD 液體培養基，于30 ℃、190 r/min過夜培養；將活化的菌液按1%接種于20 mL BMGY 培養基，于30 ℃、190 r/min培養至OD600為2～6 時，利用血球計數板計算酵母菌數量，收集菌體后用BMMY 培養基重懸至菌數約為8.0×109個/mL，再于30 ℃、190 r/min 培養，每隔24 h 補充1%體積比的甲醇，連續誘導96 h。每組3 個重復，取菌體破碎后進行SDS-PAGE 分析。

1.2.7 Western blot 分析 將pPIC9K-CBDAS 重組蛋白通過SDS-PAGE 電泳分離后轉移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h 后，用TBST 沖洗表面。將PVDF 膜轉至含有His 抗體（1:5000）的TBST中，4 ℃孵育過夜。TBST 搖晃清洗6 次（5 min/次）后移至含有HRP 標記的二抗TBST 中（1:4000），室溫孵育2 h，TBST 搖晃清洗6 次（5 min/次）。最后用ECL 超敏化學發光檢測試劑盒和成像分析儀檢測條帶。

1.2.8 熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測基因表達情況

培養方法同1.2.6，在誘導48 h 后收集酵母菌，用Trizol 法提取總RNA，核酸蛋白測定儀檢測RNA 濃度及純度，符合A260/A280=1.8～2.1 后用于逆轉錄反應。使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，反應體系10 μL，反應條件：37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min；4 ℃，保存。采用SYBR? Green Realtime PCR MasterMix 進行qRT-PCR 反應，反應體系20 μL，反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，共39 個循環，引物序列見表1。反應完成后，確認擴增曲線及融解曲線，導出ct 值，以畢赤酵母菌的Actin基因為內參，相對定量用2-?Ct來分析基因的表達水平[27]。

1.2.9 重組蛋白誘導表達的條件篩選 選取可以成功表達的重組菌株進行后續篩選，誘導時間為0、12、24、48、72、96 h；誘導培養基BMMY 的pH 分別為3.0、4.5、6.0、6.5、7.0、7.5；甲醇添加量為0.5%、0.75%、1%、2%、4%，為保證甲醇濃度不變，每隔24 h 再次添加；具體操作同1.2.6，每組三個重復。

1.2.10 CBDAS 酶活性測定

1.2.10.1 大麻萜酚酸（CBGA）的提取 取高CBGA含量大麻品種的烘干葉片，每0.1 g 中加入50 mL 甲醇，超聲破碎30 min 后，4 ℃離心20 min 收集上清液，再用0.22 μm 濾膜去除雜質，-20 ℃保存備用。

1.2.10.2 反應液的制備 反應體系參照修改的Taura等[28]方法，體系一中加入100 μL CBGA 粗提液，0.5 μL TritionX-100，超濾濃縮后的重組蛋白液25 μg，用0.1 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液（pH5.0）定容至500 μL。在37 ℃反應0、2、4、8、12 h 后，加入600 μL甲醇終止反應，每組三次重復；將反應液離心3 min，取上清，過0.22 μm 濾膜，用于HPLC 檢測；體系二中將CBGA 粗提液換成終濃度為25 μmol/L CBGA標準品，在37 ℃反應12 h 后，加入600 μL 甲醇終止反應，其余成分和反應過程均和體系一相同。通過產生CBDA 和CBD 的含量來反映酶的生物活性。

1.2.10.3 液相色譜條件 色譜柱：Shimadzu sil-16 C18柱（150 mm×4.6 mm×3 μm），柱溫：30 ℃；流動相：A 為水溶液中含有0.1%甲酸，B 為乙腈中含有0.1%甲酸；等度洗脫：25% A，75% B，保留時間30 min；紫外檢測器：230 nm；流速：0.7 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3 數據處理

DNA 序列和氨基酸序列數據用Snapgene 軟件處理。使用統計學軟件SPSS23.0 和Prism 5.0 進行分析作圖，采用單因素方差分析比較各組間數據，t檢驗法進行組間差異顯著性分析，P<0.05 差異顯著。

2 結果與分析

2.1 CBDAS 基因的克隆

以大麻的基因組為模板，使用引物CBDASF 和CBDAS-R 進行PCR 擴增，電泳圖如圖1。通過測序可知CBDAS基因全長1635 bp，編碼544 個氨基酸，Taura 等[28]在克隆纖維型大麻CBDAS基因時，也得出該基因編碼544 個氨基酸的結論。將克隆的CBDAS基因序列信息提交到NCBI 數據庫（登錄號OP627908），但與NCBI 數據庫已公布大麻CBDAS基因序列（登錄號NC_044378.1）比較，有6 處堿基不同，引起2 個氨基酸發生改變（Cys-Tyr和Lys-Gln），其余4 個為同義突變（圖2）。可見，不同大麻品種間CBDAS基因存在差異。

圖1 CBDAS 基因擴增結果Fig.1 Amplification results of CBDAS gene

圖2 CBDAS 基因序列比對Fig.2 Alignments of CBDAS gene sequences

2.2 CBDAS 蛋白的生物信息學分析

利用在線分析軟件ProtParam 預測了大麻CBDAS蛋白的基本理化性質。結果表明，CBDAS 蛋白分子量為62.3 kD，理論等電點pI 為8.84；具有51 個酸性氨基酸殘基（Asp+Glu），59 個堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）；分子式為C2843H4351N745O793S20；在酵母中估算的半衰期大于20 h。此外，CBDAS 蛋白的不穩定系數為29.28（小于40 屬于穩定蛋白），親水性平均系數（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.219，因此，CBDAS 是穩定的親水性蛋白。常麗等[29]利用ProtPScale 軟件預測大麻品種Carmen的CBDAS 蛋白時，得出其不穩定系數為30.57，GRAVY 為-0.202，與本研究的結論相似。利用NetNGlyc-1.0 在線軟件分析發現CBDAS 蛋白存在7 個N-糖基化位點，分別是位于45、65、168、296、304、328、498 位的天冬酰胺。利用Smart 和NCBI的CD-search 軟件分析CBDAS 蛋白的保守結構域，兩者結果一致（圖3），氨基酸479-537 范圍的結構域為BBE，存在于小檗堿橋和小檗堿橋樣酶中，這些酶參與許多異喹啉生物堿的生物合成；而81-218 結構域家族由多種利用FAD 作為輔助因子的酶組成，大多數酶類似于氧化還原酶。

圖3 CBDAS 蛋白的保守結構域分析Fig.3 Analysis of conservative domains of CBDAS protein

2.3 重組酵母表達載體構建與鑒定

以C000-CBDAS 為模板，以ppCBDAS-F/R 為引物，擴增獲得的CBDAS基因片段大小約為1635 bp。CBDAS基因回收產物與酵母表達載體pPIC9K 用EcoRI 和NotI 分別進行雙酶切，經回收、連接、轉化后進行鑒定。用AOX-F 引物對載體進行測序，比對后表明序列正確。再用SacI 限制性內切酶對測序正確的重組子進行線性化，再用PstI 酶切，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，可見5297、2555、1827 和1241 bp等不同片段（圖4）。測序和酶切驗證后表明，重組酵母表達載體pPIC9K-CBDAS 構建成功。

圖4 重組酵母表達載體pPIC9K-CBDAS 的酶切鑒定Fig.4 Enzymatic digestion identification of recombinant yeast expression vector pPIC9K-CBDAS

2.4 畢赤酵母轉化和陽性重組菌篩選

將線性化質粒電轉入畢赤酵母GS115 感受態中，30 ℃培養3～5 d，再利用不同濃度G418 篩選高拷貝菌后，挑取單菌落提取基因組DNA，用pPIC9K載體中AOX1 和CBDAS基因序列設計的引物進行PCR 擴增，獲得2002 bp 的條帶（圖5），表明pPIC9KCBDAS 質粒已經整合到畢赤酵母GS115 的染色體中。

圖5 重組酵母菌株PCR 鑒定Fig.5 PCR identification of the recombinant yeast

2.5 Western blot 和qRT-PCR 驗證重組蛋白表達

以酵母菌的Actin基因為內參，經qRT-PCR 分析后發現，在以水為陰性對照（CK）和轉入空載體pPIC9K 的酵母菌中，均未檢測到CBDAS基因的表達，而在重組菌中有該基因的表達（圖6A）。Western blot 分析顯示，重組蛋白CBDAS 在畢赤酵母中能正常表達，在75 kD 處具有特異性條帶，而在導入空載體酵母菌中無表達（圖6B），比利用Protparam 軟件預測的蛋白分子質量（62.3 kD）略大，在前面糖基化位點分析時發現CBDAS 蛋白存在多個N-糖基化位點，推測該酶在酵母表達中可能發生糖基化修飾而導致分子量變大。姚昌陽等[30]也在利用畢赤酵母誘導表達裂解多糖單加氧酶（LPMO）的研究中發現，重組的LPMO 蛋白條帶大小范圍為46～50 kD，比預測的分子量34 kD 大，認為該蛋白發生了糖基化修飾。

圖6 qRT-PCR 基因表達分析和重組蛋白的Western blot 驗證Fig.6 Gene expression analysis by qRT-PCR and Western blot validation of the recombinant protein

2.6 重組CBDAS 蛋白誘導表達的條件篩選

pPIC9K 為分泌型載體，理論上應會在胞外分泌出大量重組蛋白。但可能由于多肽鏈在內質網中聚集，導致加工以及囊泡運輸等過程影響外源蛋白分泌表達，從而使一定量外源蛋白仍滯留在胞內[31]。由于上清中CBDAS 蛋白較少所以收集菌體經超聲破碎后的蛋白用于后續實驗。為使重組CBDAS 蛋白高效表達，對主要影響其表達的誘導時間、甲醇濃度和誘導培養基BMMY 的pH 等因素進行篩選，結果如圖7。誘導時間、甲醇濃度和培養基的pH 對重組蛋白表達確有較大影響，重組菌在培養48 h，誘導培養基pH6.0，1%甲醇添加量時表達量最大。

圖7 重組蛋白誘導表達的條件篩選Fig.7 Screening conditions for inducing expression of recombinant protein

2.7 CBDAS 酶活性分析

將轉入空載體pPIC9K 酵母菌株和導入目的基因的重組酵母菌株pPIC9K-CBDAS 同時在誘導培養基BMMY（pH6.0），1%甲醇添加量下進行誘導培養，48 h 后收集菌體經超聲破碎收集上清液，用超濾管進行濃縮制備成待測酶液，利用BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度，畢赤酵母重組酶活性測定如圖8。反應體系的總體積保持不變，設置一組只加底物不加酶液的空白對照（CK），另兩組分別加入pPIC9K 和pPIC9K-CBDAS 重組菌株提取的酶液。當使用大麻葉片粗提液中CBGA 為底物發生反應時，由于粗提液中含有CBDA 和CBD，因此，在0 h 時三組均會檢測到這兩種物質。隨著反應時間增加（0～12 h），CK 組和pPIC9K 組的CBDA 和CBD 的含量略微下降，但差異不顯著。對于pPIC9K-CBDAS 組來說，反應2 h 后，CBDA 和CBD 的含量未發生顯著變化；當反應4 h 后，CBDA 含量顯著增加（P<0.05）；在8h 后CBD 含量顯著增加（P<0.05），12 h 時生成的CBDA 和CBD 含量達到最大值；在重組酶CBDAS作用下，新合成CBDA 60.64 ng/mL，CBD 128.01 ng/mL，分別比pPIC9K 組的高15.67 倍和37.87 倍（圖8A～圖8E）。為進一步確定重組CBDAS 的生物活性，減少大麻葉片粗提液中其他物質對反應的干擾，以CBGA 標準品為底物，反應12 h 后分析重組酶催化底物CBGA 產生CBDA 和CBD 的情況，結果如圖8F。CK 組和pPIC9K 組中未檢測到CBDA，但有CBD 檢出，這是因為CBGA 標準品中含有少量的CBD 而導致；pPIC9K-CBDAS 組中新合成CBDA 20.12 ng/mL，CBD 207.87 ng/mL，CBD 含量比pPIC9K組高9.34 倍。CBDAS 酶和底物發生反應直接生成CBDA，但當反應時間長于4 h 后，CBDA就會發生脫羧反應生成CBD，所以在8 和12 h 時會產生大量的CBD。由上可知，通過畢赤酵母重組產生大麻的CBDAS 無論在大麻葉片粗提液還是標準品中，都可以催化底物CBGA 生成CBDA 和CBD。經對比，以CBGA 標準品為底物的轉化效率明顯低于大麻葉片粗提液，這可能由于在CBGA粗提液中含有的復雜物質成分所致，可促進CBDAS酶催化活性，并增強CBDA 脫羧作用。

圖8 重組酶催化底物CBGA 產生CBDA 和CBD 的情況Fig.8 Production of CBDA and CBD by catalyzing substrate CBGA by the recombinant enzyme

3 結論

大麻品種間CBDAS基因存在差異，從而使蛋白的基本理化性質發生改變，本研究中克隆得到CBDAS經生信預測認為是一種穩定的親水性蛋白。目前，人們多以大麻花葉為材料來提取大麻素，存在季節依賴、周期長、純度低等問題，且在提取CBD 過程中會浪費粗提液中尚存的CBGA。利用經濟高效的方法獲得CBDAS，便可通過體外反應將粗提液中殘存的CBGA 進一步轉化成CBD。本文通過構建酵母表達載體，轉化畢赤酵母獲得重組菌，經qTRPCR 和Western blot 驗證后認為CBDAS基因可在酵母中得到表達。而重組菌在培養48 h、培養基pH6.0 和1%甲醇添加量等誘導條件下CBDAS 蛋白表達量最大。通過畢赤酵母重組產生大麻的CBDAS無論在大麻葉片粗提液還是標準品中，都可以催化底物CBGA 生成CBDA 和CBD，具有很強的生物活性。研究結果為今后CBD 在醫療、食品和化妝品等領域的應用開發提供基礎。重組CBDAS合成酶在大麻葉片粗提液中的催化活性高于CBGA標準品，其具體原因還有待于進一步研究。