響應面法優化高產ACE 抑制肽發酵乳生產工藝及其質構和風味特性研究

王家栩，賈麗麗，李嘉欣，張密霞，王志敏，馬春麗

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

血管緊張素轉換酶（Angiotensin-I converting enzyme，ACE）是一種具有雙結構域的二肽基羧基酶，在機體血壓調節的過程中起著至關重要的生理作用[1]。它可以水解血管緊張素I，使之變成具有收縮血管功能的血管緊張素II，同時水解具有舒張血管作用的緩激肽和N-乙酰基-SDKP，造成機體血壓的升高[2]。因此，抑制ACE 的生物活性對防治高血壓具有十分重要的意義[3]。

來源于食源蛋白質的ACE 抑制肽因原料豐富、安全性高的特點具有顯著優勢[4]，不僅為開發新型ACE 抑制劑藥物提供了新思路，且可以作為功能性成分廣泛應用于保健食品中，起到預防心腦血管疾病的作用。目前，已有報道從乳蛋白如牛乳酪蛋白[5]、羊乳酪蛋白[6]、乳清蛋白[7]；植物蛋白如玉米蛋白[8]、藜麥分離蛋白[9]、花生蛋白[10]；動物源蛋白如肌原纖維蛋白[11]、血紅蛋白[12]等中獲取了ACE 抑制肽，且取得良好效果。乳酸菌發酵是生產ACE 抑制肽的一種常見方法，在發酵過程中，微生物自身的蛋白酶系統能夠水解乳蛋白，產生具有ACE 抑制活性的肽，賦予發酵乳ACE 抑制活性[13]。日本Calpis 公司和芬蘭Evolu 公司推出了含有ACE 抑制肽（VPP和IPP）的發酵乳制品，并廣受消費者好評[14-15]。因此，開發具有降血壓活性的發酵乳對于食品工業有著廣泛的應用價值和前景。

蛋白質強化被證實可以提高發酵乳的ACE 抑制活性并改善其品質[16]。一些研究結果顯示，經過蛋白質強化后的發酵乳組織更加緊密，乳清析出更少，同時彈性模量和黏性膜量顯著提高，形成了更強的凝膠網絡[17]。此外，發酵乳的風味主要由乳酸和揮發性物質在發酵過程中生成，因此蛋白質的改變還會對發酵乳滋味產生影響[18]。Bierzuńska 等[19]研究發現，添加聚合乳清蛋白的酸奶的保水性、內聚性和黏性指數均明顯提高，香味更加濃郁。El-Fattah 等[20]使用乳清蛋白對牛奶進行強化，制備了具有心腦血管保健功能的發酵乳。Iwaniak 等[21]發現經過β-酪蛋白強化后，高達干酪的肽譜發生變化，ACE 抑制活性顯著提高。酪蛋白酸鈉作為一種蛋白質強化劑，具有良好的增稠性、乳化性和起泡性[22-23]，常被用于發酵乳中以起到增加黏度、提高硬度、減少乳清析出的作用[24]。在本研究中，使用酪蛋白酸鈉作為蛋白質強化劑，以提高發酵乳的ACE 抑制活性、改善發酵乳的品質。除此之外，本實驗室在前期研究中發現，分離來自生牛乳的Lb.plantarumM11 具有良好的耐酸、耐鹽、耐膽鹽以及蛋白水解能力，作為附屬發酵劑添加至發酵乳中也可以顯著提高發酵乳的ACE抑制活性。為此，本研究以獲得高產ACE 抑制肽發酵乳為目標，使用響應面法對高產ACE 抑制肽發酵乳的生產工藝進行優化，并研究了Lb.plantarumM11 和酪蛋白酸鈉的添加對發酵乳質構和風味特性的影響，為生產富含ACE 抑制肽的功能性發酵乳提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂乳粉、酪蛋白酸鈉（CS）新西蘭恒天然有限公司；發酵劑YO-MIX 883（含有嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）丹麥Danisco 公司；Lb.plantarumM11 分離來自新鮮無抗牛乳并保藏于東北農業大學實驗室；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、ACE（來自兔肺，酶活0.1 UN） 源葉生物科技（上海）有限公司；其他試劑 均為國產分析純。

UV-1500C 紫外-可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；TA.XT plus 質構儀 英國SMS 公司；SA-402B 型電子舌 日本INSENT 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵乳的制作工藝 12%的脫脂乳中加入8%白砂糖，充分混勻后分裝，于95 ℃條件下滅菌15 min 后冷卻至43 ℃。在超凈工作臺內接入發酵劑發酵至凝乳，然后在4 ℃條件下后熟12 h 備用[25]。

1.2.2 發酵乳ACE 抑制活性的測定 取5 mL 發酵乳樣品，用0.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L HCl 溶液將樣品pH 調至3.5，在4 ℃條件下以8000 r/min 離心15 min，取上清液調節pH 至8.3，再離心20 min，收集上清液備用。參考Roy 等[26]所述的方法測定發酵乳的ACE 抑制活性。按表1 順序依次加入HCl 溶液（1 mol/L）、HHL（5 mmol/L）、樣品、ACE（0.1 U/mL）、HCl 溶液（1 mol/L）以及硼酸緩沖液。然后向每組中加入1.7 mL 乙酸乙酯，振蕩搖勻，于3000 r/min 離心10 min。離心結束后吸取上層乙酸乙酯置于120 ℃恒溫箱中烘干，待溫度降低到室溫之后加入3 倍體積的蒸餾水，混勻之后在228 nm下測定溶液的吸光值。

表1 ACE 抑制率的測定方法Table 1 Detection methods of ACE inhibition

ACE 抑制率計算公式如下：

式中：A、B、C 分別為A 組、B 組和C 組在228 nm處的OD 值。

1.2.3 單因素實驗 參考1.2.1 中所述方法制備發酵乳。在接種量1×107CFU/mL、發酵溫度42 ℃的條件下，考察Lb.plantarumM11 和發酵劑YO-MIX 883 加入比例為0:1、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1 和1:0時發酵乳的ACE 抑制活性；在Lb.plantarumM11和發酵劑YO-MIX 883 接種比例為2:1、發酵溫度42 ℃的條件下，考察菌株總接種量為0.5×107、1×107、1.5×107、2×107、2.5×107CFU/mL 時發酵乳的ACE 抑制活性；在Lb.plantarumM11 和發酵劑YO-MIX 883 接種比例為2:1、菌株總接種量為1×107CFU/mL 的條件下，考察發酵溫度為35、37、39、42、45 ℃時發酵乳的ACE 抑制活性；在Lb.plantarumM11 和發酵劑YO-MIX 883 接種比例為2:1、菌株總接種量為1×107CFU/mL、發酵溫度42 ℃的條件下，考察添加0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%酪蛋白酸鈉對發酵乳ACE 抑制活性的影響。

1.2.4 響應面試驗 根據Box-Behnken 試驗設計原理，在上述單因素實驗的基礎上選擇酪蛋白酸鈉添加量、Lb.plantarumM11 和發酵劑YO-MIX883 的接種量以及發酵溫度作為考察因素進行三因素三水平的響應面試驗。以ACE 抑制率（%）作為響應值，使用Design Expert V8.0.6 建立模型，以獲得生產高產ACE 抑制肽發酵乳的最佳工藝條件。具體試驗因素及水平設計見表2。

表2 響應面試驗因素及水平設計Table 2 Factors and levels for response surface test

1.2.5Lb.plantarumM11 和酪蛋白酸鈉對發酵乳質構和風味特性的影響

1.2.5.1 實驗分組和處理 制備四組不同的發酵乳，以進一步探究Lb.plantarumM11 和酪蛋白酸鈉的強化對發酵乳質構和風味特性的影響。各組發酵乳發酵劑YO-MIX 883、Lb.plantarumM11 的接種量以及酪蛋白酸鈉添加量見表3。

表3 各組發酵乳發酵劑YO-MIX 883、Lb.plantarum M11 的接種量以及酪蛋白酸鈉添加量Table 3 inoculation quantity of YO-MIX 883,Lactobacillus plantarum M11 and additional quantity of sodium caseinate in each group

1.2.5.2 發酵乳質構特性的測定 使用TA-XT plus質構儀對發酵乳貯藏期的質構特性進行測定。將裝有50 mL 發酵乳的發酵杯置于檢測臺中心，用A/BE-d35（盤徑35 mm）探頭測定發酵乳的硬度、稠度、粘聚性和粘性指數[27]。

1.2.5.3 電子舌對滋味的測定 使用電子舌測定發酵乳的滋味。電子舌配有5 根脂質膜傳感器（AAE、CA0、CT0、C00、AE1）分別負責鮮味、咸味、酸味、苦味和澀味的測定。準確稱量20 mL發酵乳樣品，加入三倍體積的去離子水進行稀釋，然后置于電子舌樣品上的品嘗杯中進行測定[28]。

1.3 數據處理

所有實驗重復三次，數據以平均值±標準差表示。使用IBM SPSS 25 對實驗數據進行統計分析，并用GraphPad Prism 9 和Origin 2018 進行繪圖；使用Design Expert V8.0.6 分析響應面試驗結果。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1Lb.plantarumM11 和發酵劑YO-MIX 883 接種比例對發酵乳ACE 抑制活性的影響 如圖1 所示，隨著Lb.plantarumM11 與發酵劑YO-MIX 883的接種比例由0:1 上升至2:1，發酵乳的ACE 抑制活性呈現上升趨勢。但當Lb.plantarumM11 與發酵劑YO-MIX 883 的接種比例繼續增大時，發酵乳的ACE 抑制活性降低，這可能是由于發酵劑含量過低，Lb.plantarumM11、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌之間無法形成良好的協同作用，蛋白水解度降低，ACE 抑制肽含量減少。相比單獨使用發酵劑YOMIX 883 進行發酵（即Lb.plantarumM11 與發酵劑YO-MIX 883 接種比例為0:1 時），添加附屬發酵劑Lb.plantarumM11 的組別ACE 抑制活性都提高了，這是因為附屬發酵劑菌株的添加能夠改變發酵乳的肽譜，促進ACE 抑制肽釋放[29-30]。Moslehishad 等[31]研究證明，使用鼠李糖乳桿菌作為附屬發酵劑可以促進發酵乳中生物活性肽的釋放，提高發酵乳的ACE抑制活性，這與本研究所獲結果相似。綜上，后續實驗中Lb.plantarumM11 和YO-MIX 883 接種比例確定為2:1。

圖1 Lb.plantarum M11 與發酵劑YO-MIX 883 的接種比例對發酵乳ACE 抑制活性的影響Fig.1 Effect of inoculation ratio of Lb.plantarum M11 and YO-MIX 883 on ACE inhibitory activity of fermented milk

2.1.2 菌株接種量對發酵乳ACE 抑制活性的影響 如圖2 所示，隨著接種量由0.5×107CFU/mL 升高到1.5×107CFU/mL，發酵乳的ACE 抑制活性逐漸增強（P<0.05）。當接種量達到1.5×107CFU/mL 時，發酵乳具有最強的ACE 抑制活性，但當接種量進一步提高時，發酵乳的ACE 抑制活性反而下降。這可能是由于隨著接種量的上升，菌株在相同時間內生長速度更快，產肽更多。但當接種量過大時，菌體產酸過快，達到發酵終點所需時間過短，從而抑制了ACE 抑制肽的產生[32]。綜上，后續實驗中菌株接種量取值范圍為1×107～2×107CFU/mL。

圖2 菌株接種量對發酵乳ACE 抑制活性的影響Fig.2 Effect of inoculation quantity on ACE inhibitory activity of fermented milk

2.1.3 發酵溫度對ACE 抑制活性的影響 如圖3所示，發酵溫度的改變對發酵乳的ACE 抑制率有著明顯影響，即每組之間都呈現顯著差異（P<0.05）。當發酵溫度從35 ℃升高到39 ℃時，發酵乳的ACE抑制活性逐漸升高，在39 ℃達到最大值。但隨著溫度進一步升高，發酵乳的ACE 抑制活性呈現下降趨勢。這是因為隨著溫度的升高，菌株生長代謝速度變快，使蛋白水解度上升，產肽量升高；而當溫度超過菌株最適生長溫度時，菌株的生長受到高溫環境影響，產肽降低[32]。綜上，較高或較低的溫度都會降低發酵乳的ACE 抑制活性，后續實驗中發酵溫度的取值范圍應為37～42 ℃。

圖3 發酵溫度對發酵乳ACE 抑制活性的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on ACE inhibitory activity of fermented milk

2.1.4 酪蛋白酸鈉對發酵乳ACE 抑制活性的影響 如圖4 所示，當酪蛋白酸鈉的含量從0%上升至2%時，發酵乳的ACE 抑制活性呈現上升趨勢。相比于不添加酪蛋白酸鈉的組別，酪蛋白酸鈉添加量為2%的發酵乳的ACE 抑制活性顯著增強（P<0.05）。當酪蛋白酸鈉添加量繼續增加至2.5%時，其ACE抑制活性開始下降，但下降趨勢不顯著（P>0.05）。這一結果與Giacomettei 等[33]的研究結果一致，即發酵乳的ACE 抑制活性會隨著蛋白濃度的上升而增加，但當蛋白質濃度達到一定閾值后，ACE 抑制活性不會繼續上升，MALDI-TOF-MS 分析證實蛋白含量的增加在一定程度上可以提高肽的含量，從而起到提高ACE 抑制活性的作用。綜上，為了獲得ACE 抑制活性最強的發酵乳，酪蛋白酸鈉添加量應該控制在1.5%～2.5%。

圖4 酪蛋白酸鈉對發酵乳ACE 抑制活性的影響Fig.4 Effect of sodium caseinate on ACE inhibitory activity of fermented milk

2.2 響應面試驗優化結果

2.2.1 響應面優化試驗設計及結果 在單因素實驗的基礎上，選擇ACE 抑制率作為響應值，酪蛋白酸鈉添加量（A）、接種量（B）以及發酵溫度（C）作為變量，進行響應面試驗，響應面試驗結果如表4 所示。

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Design and results of response surface test

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 對表4 結果進行多元回歸擬合，建立高產ACE 抑制肽發酵乳發酵工藝的回歸模型。最終獲得的二次多項回歸模型方程為：Y=84.40+0.25A+0.68B+3.16C-0.83AB-0.27AC-0.030BC-4.12A2-1.65B2-6.38C2。

二次多項回歸模型的各因素方差分析結果見表5。回歸模型P值為0.0003，表現為極顯著，失擬項P值為0.9901，表現為不顯著，說明其他因素對該試驗結果影響很小，回歸方程擬合效果較好，該試驗設計方案合理可靠，模型具有統計學意義。決定系數R2為0.9624，校正決定系數R2Adj為0.9141，兩者數值相近，說明該模型可以解釋絕大部份的響應值變化，可以用于優化高產ACE 抑制肽發酵乳的生產工藝。變異系數CV 為1.70%，遠小于10%，表明該試驗結果的可信度和精確度較好。二次多項回歸模型中的二次項C、A2、C2對模型影響極顯著，B2對模型影響顯著，各因素對發酵乳ACE 抑制率的影響從大到小依次為C（發酵溫度）>B（接種量）>A（酪蛋白酸鈉添加量）。

表5 二次多項回歸模型的各因素方差分析結果Table 5 Analysis of various factors of the second multiple regression model

2.2.3 響應面交互分析 各因素交互作用的響應面3D 圖見圖5。三因素之間的交互作用響應面3D 圖都表現為開口向下的曲面，曲面最高點即為試驗最終所求的最優工藝條件。圖5a 為接種量和酪蛋白酸鈉添加量之間的交互作用結果，當發酵溫度一定時，隨著接種量和酪蛋白酸鈉添加量的增加，發酵乳ACE 抑制率先升高后降低，響應面曲面連續，存在峰值。圖5b 為發酵溫度和酪蛋白酸鈉添加量之間的交互作用結果，兩個因素的交互作用存在明顯峰值，發酵乳的ACE 抑制率在曲面最高點達到最大值。圖5c 為發酵溫度和接種量之間的交互作用結果，發酵溫度對ACE 抑制率的影響明顯強于接種量，與表3中顯著性檢驗結果相吻合，發酵乳的ACE 抑制率隨著發酵溫度的升高先上升后下降，在所選范圍內存在峰值。

圖5 酪蛋白酸鈉添加量、菌株接種量以及發酵溫度對發酵乳ACE 抑制率影響的響應面3D 圖Fig.5 Response surface 3D plot of the effects of sodium caseinate addition,inoculation quantity and fermentation temperature on ACE inhibition rate of fermented milk

2.2.4 發酵乳ACE 抑制率最優值的確定及驗證試驗響應面交互分析經過預測，當酪蛋白酸鈉添加量為2%，接種量為1.60×107CFU/mL，發酵溫度為40.12 ℃時，發酵乳具有最高的ACE 抑制率，在此條件下模型預測發酵乳ACE 抑制率可以達到84.87%?？紤]到試驗操作的可行性，修正發酵工藝為酪蛋白酸鈉添加量2%、接種量1.5×107CFU/mL，發酵溫度40 ℃。在此條件下進行3 次平行試驗驗證優化結果，其ACE 抑制率穩定在83.15%，與預測值較為接近，說明該模型可以準確地預測酪蛋白酸鈉添加量、菌株接種量以及發酵溫度對發酵乳ACE 抑制率的影響效果。

2.3 Lb.plantarum M11 和酪蛋白酸鈉對發酵乳質構性質和風味特性的影響

2.3.1 發酵乳的質構特性 發酵乳的質構特性是評價發酵乳品質的重要因素，主要包括硬度、稠度、粘聚性以及粘性指數四個方面。四組發酵乳在貯藏期間的質構特性測試結果見表6。

表6 發酵乳在貯藏期的質構特性Table 6 Texture characteristics of fermented milk during storage

硬度代表探頭在下壓過程中達到最大深度所需要的力。四組發酵乳中，883+M11 組具有最低的硬度值。添加酪蛋白酸鈉后發酵乳的硬度顯著增大（P<0.05），且883+M11-CS 組的硬度比883-CS 組更大（P<0.05）。這可能是因為蛋白質濃度越高，發酵乳形成的凝膠強度越大，硬度提高。在貯藏期間，四組發酵乳的硬度都呈現上升趨勢，在第28 d 達到最大值。

稠度代表力與時間之間形成的峰面積，反映了發酵乳的流動能力[34]。883+M11-CS 組的稠度顯著高于其他三組（P<0.05），說明該組發酵乳內部的微觀結構排列更為緊密，穩定性更高[35]。883+M11 組和883-CS 組的稠度都顯著高于883 組（P<0.05），說明酪蛋白酸鈉和Lb.plantarumM11 都可以提高發酵乳的稠度。王鑫磊等[18]也發現了類似的結果，這可能是附屬發酵劑的添加生成了更多的胞外多糖，這些胞外多糖與蛋白質基質之間發生靜電相互作用，使發酵乳膠著性增加，稠度上升。在貯藏期間，883 組和883+M11 組的稠度都呈現下降趨勢，而添加酪蛋白酸鈉的883-CS 組和883+M11-CS 組稠度變化趨勢不明顯。

粘聚性代表樣品的內部粘合力，為負向最大力。883+M11-CS 組的粘聚性顯著高于其他三組（P<0.05），883+M11 組與883 組之間的粘聚性差異不顯著（P>0.05），但883-CS 組與883 組之間呈現顯著性差異（P<0.05），這說明酪蛋白酸鈉對發酵乳的粘聚性存在明顯的影響，這可能是在酸化過程中，酪蛋白顆粒附著在簇和鏈結構上，從而形成由酪蛋白簇和鏈組成的三維網狀結構[36]，使發酵乳內部環境更完整緊密。發酵乳在貯藏期間的粘聚性指標總體呈現上升趨勢，但這種趨勢在貯藏期第1～7 d 內表現不顯著（P>0.05）。

粘性指數代表力與時間之間形成的負峰面積，即發酵乳對返還探頭的粘著力。883+M11-CS 組的粘性指數要顯著高于其他組（P<0.05），883+M11 組和883-CS 組的粘性指數都顯著高于883 組（P<0.05）。這說明酪蛋白酸鈉和Lb.plantarumM11 的添加都提高了發酵乳的凝膠特性，且二者具有協同作用。在貯藏期間，883 組和883-CS 組的粘度指數呈現上升趨勢，而883+M11 組和883+M11-CS 組的變化趨勢不明顯。

2.3.2 發酵乳滋味的測定 電子舌是一種通過模擬人體味覺系統對樣品滋味進行測定的設備。與感官評價相比，電子舌獲得的信息更加客觀，且具有重復性[37]。由滋味雷達圖6 可知，四組發酵乳之間的酸味差異最為明顯，附屬發酵劑Lb.plantarumM11 會增加發酵乳的酸味，而添加酪蛋白酸鈉的883-CS 組和883+M11-CS 組酸味弱于883 組。此外Lb.plantarumM11 還可以增加發酵乳滋味的豐富性，這一結果與Lesme 等[38]研究結果一致，即附屬發酵劑的使用可以提高發酵乳滋味的豐富性。四組發酵乳之間的咸味、苦味、澀味、澀味回味、苦味回味以及鮮味差異均不明顯。滋味的主成分分析如圖7 所示，PC1 貢獻率為88.0%，PC2 貢獻率為9.4%，總貢獻率為97.4%，說明該分析可以解釋絕大部分的發酵乳滋味信息，PC1 遠遠大于PC2，說明樣品在X 軸方向距離越大，差異性越大。883 組和883+M11 組位于X 軸正半軸，與豐富性、鮮味、酸味和苦味呈正相關；而883-CS 組和883+M11-CS 組位于X 軸負半軸，與咸味、澀味、澀味回味和苦味回味呈正相關。此外，883+M11-CS 組與883 組在X 軸方向上距離較近，說明它們整體滋味相似。

圖6 發酵乳的滋味雷達圖Fig.6 Taste radar of fermented milk

圖7 滋味的主成分分析Fig.7 Principal component analysis of taste

3 結論

發酵乳制品是生物活性肽的重要來源，生產研發具有心腦血管保健功能的發酵乳制品具有廣泛的應用價值和前景[39]。本研究通過對原料乳進行酪蛋白強化，并使用Lb.plantarumM11 作為附屬發酵劑，提高了發酵乳的ACE 抑制活性。結果表明，酪蛋白酸鈉的使用和附屬發酵劑Lb.plantarumM11的添加都可以顯著提高發酵乳的ACE 抑制活性，當酪蛋白酸鈉添加量為2%、接種量為1.5×107CFU/mL，發酵溫度為40 ℃時，發酵乳具有最強的ACE 抑制活性，在此條件下其ACE 抑制率為83.15%。此外，酪蛋白酸鈉和Lb.plantarumM11 的添加可以改善發酵乳的質構特性，增強發酵乳的硬度、稠度、粘聚性和粘度指數，能夠在對風味無不良影響的基礎上，滿足消費者對飲食健康的追求。但生物活性肽只有經過腸道吸收進入血液循環后才能發揮其生物活性，胃腸道消化可能會對肽段產生巨大影響，導致生物活性發生改變。因此未來還需要進一步對發酵乳中的肽譜進行分析，驗證其在體內的作用效果和降血壓機制，發掘其健康功效和應用價值。