Box-Behnken 設計-響應面法優化桔梗醇提工藝及醇提物美白活性分析

蔡鐵全，龐會娜，黃意情，萬志強,，嚴銘銘,3,

（1.國家市場監督管理總局食品審評中心，北京 100070；2.長春中醫藥大學東北亞中醫藥研究院，吉林長春 130117；3.吉林省中藥保健食品科技創新中心，吉林長春 130117）

桔梗為桔梗科植物桔梗（Platycodon gradiflorum（Jacq.）A.DC.）的干燥根，始載于《神農本草經》，被列為下品[1-2]，具有利咽，宣肺[3-4]，祛痰[5]，排膿等功效，為我國衛生部批準的藥食兼用中藥材之一[6]。現代研究表明，桔梗的化學成分主要包括皂苷類[7]、黃酮類[8]、脂肪油、脂肪酸[9]、無機元素[10]等成分，具有抗氧化[11]、降血糖[12]、抗腫瘤[13]等生物活性。經查閱文獻可知，近年來桔梗研究主要集中在抗腫瘤、心血管保護及提高人體免疫力方面[14]，而在桔梗美白活性方面的研究上，除本課題組前期研究外并未見其相應的研究。

人體的皮膚顏色除了受遺傳因素的影響外，還會受到外界因素的影響，如紫外線、光照時間、海拔等，而這些因素就是造成膚色差異的原因。自古以來，中國女性就有對美的追求，所以對色素沉著、雀斑等皮膚問題也越來越重視，從而使美白成為人們生活中不可或缺的一部分[15]。傳統的美白劑（氫醌、鉛粉等）細胞毒性大，副作用較強，已經無法滿足現代人追求美白所要求的安全、滋潤、溫和等條件，同時“致癌”事件屢發也讓人們對美白產品安全性的擔憂日益增加。隨著美白保健品的研究與開發，發現從植物中提取的活性成分更具有安全、高效的特性，其作為美白保健產品的有效組分深入人心。如今，研發更多天然植物原料已是美白保健品領域研究的熱點之一[16-17]。

我國作為桔梗生產大國，在桔梗美白保健品的研發方面具有很大上升空間，因此，從桔梗中尋找和提取功能性物質對桔梗美白保健品的研究與開發具有重要意義。因此，本實驗以酶抑制活性和抗氧化為考察指標，優化桔梗醇提工藝，探究桔梗醇提物體外美白功效，為其進一步研究提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桔梗藥材（批號：C359180401b）吉林省仙草醫藥藥材有限公司，經長春中醫藥大學藥學院姜大成教授鑒定為桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根；B16F10 小鼠黑色素瘤細胞 中國上海生物科學研究所細胞資源中心；桔梗皂苷D 標準品（批號：24588-201708）、熊果苷對照品（批號：21402-201823）、桔梗對照藥材（批號：121028-201612）中國食品藥品檢定研究院；氫氧化鈉、DPPH、ABTS+、過二硫酸鉀、乙酰丙酮、埃爾利希國藥集團化學試劑有限公司；酪氨酸酶（≥500 U/mg）、L-酪氨酸、透明質酸酶（400～1000 U/mg）、透明質酸鈉 北京索萊寶科技有限公司。

ALB-224 萬分之一分析天平、AB265-S 十萬分之一分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；KQ-250 超聲波清洗器 昆山市儀器有限公司；HX-400A高速中藥粉碎機 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；LC-2010AHT 高效液相色譜儀 日本島津公司；ELSD 6000 蒸發光散射檢測器 Alltech CHROM Thermo；DZTW 電子調溫電熱套 北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.2.1 桔梗醇提物的制備 將桔梗藥材進行粉碎，過65 目，稱取適量藥粉，加8 倍量的95%乙醇，加熱回流提取3 次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，濃縮至浸膏，80 ℃干燥，粉碎，過80 目，即得桔梗醇提物（PGE-ME5）[18]。

1.2 實驗方法

1.2.2 指標的測定

1.2.2.1 桔梗總皂苷提取率的測定 參考但漢龍等[19]的方法，稍作修改，分別吸取0.5 mg/mL 的桔梗皂苷D 對照品0、0.2、0.4、0.6、1.2、1.4 mL，揮干后，首先加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，然后加入0.8 mL 的高氯酸，混勻之后于水浴中以60 ℃的溫度加熱15 min，放冷后加入冰醋酸5 mL 震蕩混勻后，于550 nm 處測定其吸光度值并記錄。將桔梗皂苷D 取樣量的質量和吸光度值分別作為橫坐標和縱坐標，所得到的標準曲線為Y=0.0016X+0.0148，R2=0.9992。精密配制1.0 mg/mL 的桔梗醇提物，按照上述方法進行測定，桔梗總皂苷提取率的計算公式如下：

式中：Y 為樣品的吸光度值；m 為所測樣品對應藥材的質量，mg。

1.2.2.2 桔梗皂苷D 提取率的測定 桔梗皂苷D 提取方法按2015 年版《中國藥典》項下方法提取，測定前過0.45 μm 有機濾膜，采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD）法對其進行測定，選用反向C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm），選用乙腈和水作為流動相，以1.0 mL/min 流速進行等度洗脫，流動相乙腈:水的比例為25:75，蒸發光散色檢測器的溫度是103.8 ℃，氣體流量為2.8 L/min。對照品溶液進樣量為5、10 μL，供試品溶液進樣量為15 μL，采用外標兩點法對數方程進行計算[18]，所得標準曲線為Y=2.8978X+13.362，R2=0.9994，桔梗皂苷D 的提取率計算公式如下：

式中：Y 為樣品的吸光度值，m 為所測樣品對應藥材的質量，mg。

1.2.2.3 熊果苷提取率的測定 精密稱取0.5 g 桔梗醇提物于具塞錐形瓶中，加甲醇提取溶劑10 mL，稱重，超聲30 min 進行提取，放至室溫后補足失重，含量測定前過0.45 μm 有機濾膜，選用反向C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm），采用HPLC-ELSD 法測定熊果苷單體，以乙腈和0.1%甲酸水作為流動相（乙腈:0.1%甲酸水=5:95），以0.8 mL/min 的流速等度洗脫，蒸發光散色檢測器的溫度為105 ℃，氣體流量是2.8 L/min。對照品溶液進樣量為5、10 μL，供試品溶液進樣量為15 μL，采用外標兩點法對數方程計算[18]，所得標準曲線為Y=4.3033X+12.762，R2=0.9996，熊果苷的提取率計算公式如下：

式中：Y 為樣品的吸光度值，m 為所測樣品對應藥材的質量，mg。

1.2.3 單因素實驗 溶媒量8 倍，提取時間1 h，提取次數3 次作為固定的反應條件，選擇提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、提取次數（1、2、3、4 次）、溶媒量（6、7、8、9、10 倍）進行單因素實驗，平行3 次，考察其對桔梗總皂苷、桔梗皂苷D、熊果苷的提取率的影響。

1.2.4 響應面設計試驗 根據單因素實驗結果，以提取次數（A）、提取時間（B）、溶媒量（C）為影響因素，以桔梗總皂苷、桔梗皂苷D、熊果苷的提取率為綜合評分（綜合評分=（30%×桔梗皂苷D 提取率/桔梗皂苷D 提取率最大值+30%×熊果苷提取率/熊果苷提取率最大值+40%×桔梗總皂苷提取率/桔梗總皂苷提取率最大值）×100）作為評價指標（Y），用Box-Behnken進行響應面試驗設計[20-23]，因素水平見表1。

1.2.5 桔梗醇提物美白活性研究

1.2.5.1 酪氨酸酶活性抑制實驗 根據文獻修改如下[24]，用磷酸緩沖溶液將待測樣品和熊果苷配制成質量濃度為3.125、6.25、12.5、18.75、25 mg/mL 的溶液備用，在96 孔板中設置240 μL 總反應體系（見表2），按照表2 數據將試劑依次加入，震蕩混勻后，37 ℃水浴中反應20 min 后，于475 nm 下測定吸光度，酪氨酸酶抑制率計算公式如下：

表2 酪氨酸酶催化反應體系（μL）Table 2 Tyrosinase catalytic reaction system (μL)

酪氨酸酶抑制率(%)=[(A-B)/(C-D)]/(A-B)×100

式中：A：等量緩沖液代替樣品溶液的吸光度；B：等量緩沖液代替樣品溶液和酪氨酸酶溶液的吸光度；C：樣品溶液吸光度；D：等量緩沖液代替酪氨酸酶溶液的吸光度。

1.2.5.2 透明質酸酶活性抑制實驗 采用Elson-Morgan 法進行透明質酸酶體外抑制實驗，用pH5.6 的醋酸緩沖溶液配置透明質酸鈉（0.5 mg/mL）、透明質酸酶（600 U/mL）及待測樣品（3.125、6.25、12.5、18.75、25 mg/mL）溶液待用，將0.2 mL CaCl2溶液與0.5 mL的透明質酸酶溶液混勻后于37 ℃下孵育20 min，然后加入待測樣品溶液0.5 mL，37 ℃下孵育20 min，加入0.5 mL 的透明質酸鈉溶液37 ℃孵育30 min，取出后加入0.1 mL 的NaOH，冰水浴中冷卻8 min，加入0.1 mL 的埃爾利希，常溫下放置20 min 后，于555 nm 下測定吸光度[18]。透明質酸酶抑制率計算公式如下：

透明質酸酶抑制率(%)=[(A-B)/(C-D)]/(A-B)×100

式中：A：醋酸緩沖液代替樣品的吸光度；B：醋酸緩沖液代替樣品和透明質酸酶的吸光度；C：樣品吸光度；D：醋酸緩沖液代替透明質酸酶的吸光度。

1.2.5.3 細胞黑色素生成抑制活性 將B16F10 黑色素瘤細胞接種到24 孔的培養板中，每個孔的細胞個數為1×104個，細胞貼壁后，加入α-黑素細胞刺激激素（100 nmol/Lα-MSH）繼續培養48 h，然后加入不同濃度（100、150、200 μg/mL）的PGE-ME5 提取物和熊果苷，分別培養24、48、72 h，每組5 個復孔，給藥時間結束后，去除培養基，用PBS（pH7.2）洗滌細胞兩次，加入200 μL 含有1% tritonx-100 的PBS，通過冷凍和解凍使細胞破裂。以12000 r/min 離心30 min 后去除上清液，在細胞顆粒中加入300 μL 含10%二甲基亞砜的1 mol/L NaOH，在80 ℃下反應2 h 以溶解細胞的黑色素[25]，使用酶標儀在450 nm處測量溶解的黑色素的吸光度值。

黑色素抑制率(%)=(給藥組A450-空白組A450)/(對照組A450-空白組A450)×100

1.2.6 桔梗醇提物體外抗氧化活性研究

1.2.6.1 DPPH 自由基清除能力測定 根據文獻[26]修改如下：將配制好的桔梗醇提物溶液2 mL 加入到2 mL 0.004% 的DPPH 溶液中，渦旋，避光反應30 min 后，于517 nm 下測定吸光度值A1；以等量乙醇溶液代替DPPH 溶液，得吸光度值A2；以等量蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照，得吸光度值A0。以VC作為陽性對照。按下列公式計算：

DPPH 自由基清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力測定 根據文獻[27]修改如下：使用pH7.4 PBS 緩沖溶液對ABTS+工作液進行稀釋，使其在734 nm 處的吸光度值范圍在0.5～0.9 之間即可；取10 μL 桔梗醇提物樣品溶液與0.2 mL ABTS+工作液進行混合，室溫下避光反應6 min，于734 nm 波長測定吸光度，以VC為陽性對照，按下列公式計算：

ABTS+自由基清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式中：A1：樣品+ABTS+測得的吸光度值；A0：PBS+ABTS+測得的吸光度值。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3 次，采用Origin 2019 和Design-Expert V8.0.6 進行實驗數據分析及圖像繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取次數對桔梗醇提物桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷提取率的影響 結果如圖1 所示，桔梗美白活性提取物中桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷的提取率的高低與提取次數有關，隨著提取次數的增加，各指標性成分的提取率呈現先升高后趨于平緩的趨勢，當提取次數小于3 時，各指標性成分隨著提取次數的增加，其提取率顯著升高（P<0.01），當提取次數達到3 次時，桔梗總皂苷的提取率基本達到最高值。其原因可能是當提取次數較低時，各指標性成分并未完全溶出，因此當提高提取次數時，目標提取物的提取率則會相應的提高，當提取次數達到一定值時，各指標性成分的提取率會達到最高值，因此再增加提取次數時，各個指標成分的提取率將增加不明顯。考慮到當提取次數達到3 時，桔梗皂苷D 和熊果苷的提取率并未達到最高值，因此選擇2、3、4 次進行響應面優化分析。

圖1 提取次數對桔梗醇提物各指標成分提取率的影響Fig.1 Effect of extraction times on extraction rate of each index component of Platycodon grandiflorum ethanol extract

2.1.2 提取時間對桔梗醇提物桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷提取率的影響 提取時間是影響各指標性成分提取率的關鍵因素之一，充足的提取時間有利于各指標性成分的溶出。結果如圖2 所示，桔梗醇提取物中，桔梗皂苷D 和熊果苷的提取率在測定時間內（0.5～2.5 h）變化不顯著（P>0.05），當提取時間在0.5～1.0 h 時，桔梗總皂苷的提取率顯著升高（P<0.01），而當提取時間到達1.0～2.5 h 時，桔梗總皂苷的提取率基本保持不變，其原因可能是隨著時間的進一步增加，溶解度達到飽和時，桔梗總皂苷不再被溶解，提取率不再有明顯提高[28]。因此選擇0.5、1.0、1.5 h 進行響應面優化分析。

圖2 提取時間對桔梗醇提物各指標成分提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of each index component of Platycodon grandiflorum ethanol extract

2.1.3 溶媒量對桔梗醇提物桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷提取率的影響 溶媒量是影響細胞內外滲透壓的主要因素，適當的溶媒量對各指標性成分的溶出是有利的，還可以節約提取溶液[29]。從圖3 中可以看出，當溶媒量為6 倍時，桔梗總皂苷的提取率明顯較低，而后隨著溶媒量的增加各指標性成分的提取率有了一定的提高，其中當溶媒量由6 提高到8 時，桔梗總皂苷的提取率顯著升高（P<0.01）。這是因為適當增大溶媒量，能擴大指標性成分在桔梗內外的濃度差，有利于指標性成分的溶出，但溶媒量對于各指標性成分溶出的增強效應也是有一定的界限的，因此當達到一定的溶媒量時，再繼續提高溶媒量也不會顯著地增加指標性成分的提取率[30]。因此選擇7、8、9 倍進行響應面優化分析。

圖3 溶媒量對桔梗醇提物各指標成分提取率的影響Fig.3 Effect of solvent amount on extraction rate of each index component of Platycodon grandiflorum ethanol extract

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立與數據分析 在單因素實驗基礎上，根據單因素實驗結果，以提取次數（A）、提取時間（B）、溶媒量（C）為影響因素，以桔梗總皂苷、桔梗皂苷D、熊果苷提取率的綜合評分（Y）為響應值，采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行3 因素3 水平共17 個試驗設計，結果如表3 所示，得到關于提取次數（A）、提取時間（B）和溶媒量（C）綜合評分的二元多項回歸方程：Y=9.68-0.08A-0.036B+0.32C-2.50E-0.3AB+0.023AC-0.015BC-0.95A2-0.44B2-0.27C2。

表3 Box-Behnken 響應面試驗設計與結果Table 3 Box-Behnken response surface test design and results

對所得實驗數據模型進行方差分析，結果如表4所示。結果表明，本模型的F值為110.73，P<0.0001，模型顯著；失擬項F值為0.095，P值為0.9591>0.05，失擬不顯著；模型的調整決定系數R2adj值為0.9158，擬合度較高，表明本模型對綜合評分進行的分析和預測是準確有效的。由回歸模型和方差分析可知，方程一次項A、C 對綜合評分的影響達到顯著水平（P<0.05）；方程二次項A2、B2、C2對綜合評分的影響達到極顯著水平（P<0.01），而AB、AC、BC 之間的交互作用對綜合評分的影響并不顯著，根據F值可知，各因素對綜合評分影響的大小順序為：C（溶媒量）>A（提取次數）>B（提取時間）。

表4 二次回歸模型方差分析結果Table 4 Results of variance analysis of quadratic regression model

2.2.2 驗證實驗 運用Design-Expert V8.0.6 軟件對模型進行解析，得到了一組桔梗醇提物的最佳提取條件：提取次數2.96 次，提取時間0.97 h，溶媒量8.58 倍。根據工業化生產等實際情況進行調整，最終確定的最佳工藝參數為：提取次數3 次，提取時間1 h，溶媒量8 倍。按照上述優選提取工藝參數制備的提取物作為桔梗最佳美白活性提取物（PGEME5）。通過三次平行驗證實驗得，PGE-ME5 中桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷的提取率，與預測值相差不大，指標性成分桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷的提取率分別為0.122%±0.003%、0.128%±0.005%、0.582%±0.007%，表明工藝合理穩定，可為后續相關規模化生產奠定基礎。

2.3 PGE-ME5 美白活性實驗結果

2.3.1 對酪氨酸酶及透明質酸酶的抑制結果 熊果苷是常見的美白劑，它通過競爭性抑制人類酪氨酸酶活性而減少色素沉著，在研究中常用作陽性對照[31]，PGE-ME5 對酪氨酸酶及透明質酸酶的抑制效果如圖4 所示，實驗結果表明，隨著PGE-ME5 的濃度升高，其對酪氨酸酶及透明質酸酶的抑制率呈上升的趨勢，與陽性藥熊果苷相比，當給藥濃度為18.75 mg/mL時，其抑制效果相當，抑制率分別為92.39%、88.26%，其原因可能是PGE-ME5 中含有多種美白活性成分（熊果苷、桔梗總皂苷等），因此表現出良好的美白活性。

圖4 PGE-ME5 對酪氨酸酶及透明質酸酶抑制率Fig.4 Inhibition rate of PGE-ME5 on tyrosinase and hyaluronidase

2.3.2 抑制細胞黑色素結果 與空白對照組比較，以100 nmol/Lα-MSH 刺激的B16F10 細胞（對照組）的黑色素含量明顯高于未刺激的細胞，表明造模成功；隨著PGE-ME5 提取物濃度的增加，使α-MSH 刺激的B16F10 細胞中黑色素含量呈劑量依賴性顯著減少。當給藥時間為48 h 時，α-MSH 刺激的B16F10細胞中黑色素生成抑制效果最佳，結果見圖5。

圖5 PGE-ME5 對細胞黑色素的抑制率Fig.5 Inhibition rate of PGE-ME5 on cell melanin

2.4 PGE-ME5 體外抗氧化活性實驗結果

PGE-ME5 對DPPH·、ABTS+自由基清除效果如圖6 所示，實驗結果表明，隨著PGE-ME5 的濃度升高，其對DPPH·及ABTS+自由基的清除率呈上升的趨勢，與陽性藥VC相比，其抑制效果相當，當給藥濃度達到3.13 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率達到最高值為97.19%，當給藥濃度達到4.69 mg/mL時，對ABTS+自由基的清除率達到最高值為80.57%，該實驗結果表明PGE-ME5 具有良好的抗氧化活性。

圖6 PGE-ME5 對DPPH、ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of PGE-ME5 to DPPH and ABTS+free radicals

3 結論

本研究利用響應面法對桔梗醇提工藝進行了優化，得到最佳提取工藝為：提取次數3 次，提取時間1 h，溶媒量8 倍，在此條件下提取得到的桔梗美白活性提取物（PGE-ME5）中桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷的提取率分別為0.122%±0.003%、0.128%±0.005%、0.582%±0.007%。美白功效評價結果顯示，PGE-ME5具有良好的美白活性，對酪氨酸酶和透明質酸酶的抑制率分別為92.39%和88.26%，此時的給藥濃度為18.75 mg/mL，且對B16F10 細胞中黑色素的生成具有良好的抑制效果。抗氧化結果表明，PGE-ME5 具有良好的抗氧化活性，對DPPH·、ABTS+自由基的清除率，分別為97.19%、80.57%。

皮膚的顏色主要是由黑色素決定的。當細胞受到內源性刺激物作用時，就會激活酪氨酸酶，促進黑色素的生成[32]。另外，活性氧（ROS）在黑色素生成過程中也起到十分重要的作用，ROS 在酪氨酸酶催化氧化過程中既是引發劑也是反應物，并通過相關蛋白的作用來誘導黑色素合成基因的表達，從而導致黑色素含量的升高[33]。故抑制酪氨酸酶活性、抗氧化是目前公認美白的兩個關鍵靶點。

DPPH 法及ABTS 法為兩大常用的體外抗氧化評價實驗，廣泛用于評價植物提取物的抗氧化性能[34]。而本實驗發現PGE-ME5 在抗氧化、抑制酪氨酸酶活性上均顯示出良好的作用，由此初步得出，桔梗醇提物作為一種抗氧化劑可能是通過阻斷或減弱酪氨酸酶活性、抑制酶表達，從而達到協同美白效果，具體的美白作用機制還需進一步研究，綜上所述，PGE-ME5 具有良好的美白及抗氧化活性，因此，桔梗醇提物可能會成為潛在的天然美白活性成分，用于美白保健產品的研發。