霍山石斛茶飲的制備工藝優化及其免疫調節作用

黃 科，林啟焰，楊 迎，侯婷婷，韓邦興，劉 東,

（1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽合肥 230012；2.安徽省中藥生態農業工程研究中心，安徽六安 237012；3.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安 237012）

霍山石斛（Dendrobium hooshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng，蘭科）的莖在許多東南亞國家被用作泡茶、湯和粥的原料，已有數百年的歷史[1]，其中霍山石斛是蘭科石斛屬（Dendrobium）的一種重要的食用藥用植物[2]。主產地為安徽大別山，常生長于石縫，樹木以及地勢陡峭之地。霍山石斛具有多種活性成分，如多糖類、雙芐基類、倍半萜類、酚類等化學成分，其中多糖類成分是其主要成分，藥理活性也多來源于霍山石斛多糖[3]。近年來，霍山石斛被報道具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤和免疫調節作用[3-6]，因此霍山石斛的價值也飛速上漲，但是關于霍山石斛的產品開發卻還處于探索之中。目前關于霍山石斛的產品主要有石斛花茶，石斛鮮葉速溶粉，石斛功能性酸奶等[7]，仍需進一步的研究和探索。

茶是世界上最暢銷的飲料，根據發酵程度分為綠茶、烏龍茶和紅茶[8]，其中紅茶在世界范圍內受到廣泛的追捧和喜愛[9]。紅茶作為一種健康飲料，對人體有許多有益的作用，如增強免疫力、降壓、抗腫瘤、抗癌等[10-13]。而茶多酚是茶葉中主要的活性成分，有報道表明其具有免疫調節作用[14-15]。紅茶中的祁門紅茶作為中國四大紅茶之一，具有口感好，營養價值豐富等優點[16]。而作為一種日常飲品來說，祁門紅茶具有容易被人接受，價格親民等優勢，因此在將來，茶類資源會得到更為充分的利用，而增強其核心競爭力便要對其進行改良和創新。

隨著年齡的增長，大多數人免疫力的下降是不可避免的，部分人群也會因為工作，生活節奏等原因導致免疫力下降[17-18]。而免疫能力的下降對機體免疫外界病原微生物有著巨大影響。霍山石斛與祁門紅茶都具有調節免疫的功效，同時廣大人民對紅茶的接受程度性較高，因此開發一款具有免疫調節功能，同時能為廣大消費者接受的飲品不僅是對茶類資源的充分利用，對霍山石斛的資源開發也有著重要意義。本研究主要是通過對祁門紅茶和霍山石斛有效成分的提取條件優化，再以細胞免疫活性為指標制備出增強免疫能力的茶飲，同時進一步探索其體外免疫活性，為后續的霍山石斛資源的開發和應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

霍山石斛干莖（生產批號：20220622133612）中國中藥霍山石斛科技有限公司；祁門紅茶（生產批號：SC11434102405025）祁門縣祁雅茶業有限公司；苯酚（生產批號：200705）西隴科學股份有限公司；RAW264.7 細胞T25（批號：CL-0190）武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培養基（生產批號：8121701）南京錦在生物科技有限公司；PBS（磷酸緩沖鹽溶液）（生產批號：8122056）賽默飛世爾生物化學制品有限公司；胎牛血清 武漢普諾賽生命科技有限公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）試劑 亞科因生物技術有限公司；冰醋酸（生產批號：20181101）天津市大茂化學試劑廠；無水乙醇（生產批號：E809056）、環磷酰胺（生產批號：Art.No.C849559-500 mg）上海麥克林生化科技有限公司；中性紅染劑 上海碧云天生物技術有限公司；清潔級KM 小鼠（許可證號：SCXK（豫）2020-0005）（生產批號：No.410000000000002551）河南斯克貝斯生物科技股份有限公司；小鼠IL-2、IL-6、TNF-αELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）試劑盒（生產批號：YXL-20176、YNL-20188、YXL-20852）四川成都源諾天成科技有限公司；4%多聚甲醛（生產批號：22105339）合肥蘭杰柯科技有限公司。

UPT-II-10 純水機 上海杲森儀器設備有限公司；H1-16K 離心機 湖南可成儀器設備有限公司；Synergy H1 多功能酶標儀 合肥遠明科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 祁門紅茶與霍山石斛煎煮工藝 稱取一定量的祁門紅茶與霍山石斛，分別按照不同料液比加入超純水，經過不同煎煮時間和次數進行提取，分別得到霍山石斛與祁門紅茶提取液。

1.2.1.1 單因素提取實驗 準確稱取祁門紅茶1.0 g，放入圓底燒瓶中，用冷凝回流法煎煮提取，以煎煮后提取液的茶多酚得率為指標，以福林酚法[19]測定提取液中的多酚含量，考察不同料液比（g/mL）（1:15、1:30、1:45、1:60、1:80）、提取時間（5、15、25、35、45 min）、提取次數（1、2、3、4、5）對祁門紅茶煎煮效果的影響。在固定提取時間為25 min、提取次數為3 次的條件下，考察料液比（g/mL）（1:15、1:30、1:45、1:60、1:80）對祁門紅茶提取效果的影響；在固定料液比為1:80（g/mL）、提取次數為3 次的條件下，考察提取時間（5、15、25、35、45 min）對祁門紅茶提取效果的影響；在固定料液比為1:80（g/mL）、提取時間為45 min 的條件下，考察提取次數（1、2、3、4、5）對祁門紅茶提取效果的影響。

準確稱取霍山石斛粉末1.0 g，放入圓底燒瓶中，用冷凝回流法煎煮提取，以石斛多糖得率為指標，以硫酸苯酚法[20]測定提取液中的多糖含量，考察不同料液比（g/mL）（1:20、1:40、1:60、1:80、1:100）、提取時間（20、40、60、80、100 min）、提取次數（1、2、3、4、5）對霍山石斛提取效果的影響。在固定提取時間為60 min、提取次數為3 次的條件下，考察料液比（g/mL）（1:20、1:40、1:60、1:80、1:100）對霍山石斛提取效果的影響；在固定料液比為1:100（g/mL）、提取次數為3 次的條件下，考察提取時間（20、40、60、80、100 min）對祁門紅茶提取效果的影響；在固定料液比為1:100（g/mL）、提取時間為60 min 的條件下，考察提取次數（1、2、3、4、5）對祁門紅茶提取效果的影響。

1.2.1.2 正交試驗 根據單因素實驗結果，采用L9（34）正交試驗設計，分別對祁門紅茶和霍山石斛的工藝參數進行優化，因素水平如表1、表2 所示。

表1 祁門紅茶提取工藝正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment for Keemum black tea extraction process

表2 霍山石斛提取工藝正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal experiment for Dendrobium huoshanensis extraction process

1.2.1.3 標準曲線的制作 采用福林酚法和硫酸苯酚法繪制標準曲線和作為后續測試提取液中指標成分的檢測方法。

茶多酚標準曲線：以沒食子酸標準工作液濃度為橫坐標（X），反應液吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線。標準曲線線性方程為：Y=0.0052X+0.0137（R2=0.9984）。

多糖標準曲線：以葡萄糖標準工作液濃度為橫坐標（X），反應液吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線。標準曲線線性方程為：Y=8.4223X-0.0058（R2=0.9990）。

1.2.1.4 得率的計算

注：C1為石斛多糖濃度（g/mL），V1為石斛水提物總體積（mL），M1為霍山石斛質量（g）；C2為祁門紅茶多酚濃度（g/mL），V2為祁門紅茶水提物總體積（mL），M2為祁門紅茶質量（g）。

1.2.2 茶與石斛提取液混合液對細胞增殖活力的影響 根據文獻[21]方法，將霍山石斛提取液和祁門紅茶提取液按照不同比例混合，再將其稀釋成不同的濃度梯度后過0.22 μm 微孔濾膜除菌。將購買的RAW264.7 細胞在添加了10%胎牛血清的DMEM培養基中，放置于細胞培養箱中培養，培養箱條件為37 ℃，5% CO2的潮濕環境。培養一段時間后，將1×105的RAW 264.7 細胞接種在96 孔板中，每組平行6 孔，并培養24 h 以供其貼壁生長。用不同配比（100%石斛，100%祁門紅茶，75%的祁門紅茶加25%霍山石斛，50%祁門紅茶加50%霍山石斛，25%祁門紅茶加75%霍山石斛）和不同濃度（0、2.5、5、10、20、40、50、100 μg/mL）的茶與石斛提取混合液（KTDH）處理細胞24 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑后，在細胞培養箱中孵育RAW 264.7 細胞4 h。使用酶標儀在450 nm 波長下測量吸光度值。

1.2.3 茶與石斛提取液混合液對細胞吞噬活力的影響 RAW264.7 細胞接種于96 孔板中，每組平行6 孔，使每孔細胞為1×105。培養24 h 后，棄去上清液。用10 μL 不同配比（100%石斛，100%祁門紅茶，75%的祁門紅茶加25%霍山石斛，50%祁門紅茶加50%霍山石斛，25%祁門紅茶加75%霍山石斛）和不同濃度（2.5、5、10、20、40、50、100 μg/mL）的茶與石斛提取混合液（KTDH）和10 μL 的10 μg/mL LPS 預處理RAW264.7 細胞24 h，然后加入100 μL的5%中性紅溶液，將RAW264.7 細胞置于細胞培養箱中培養4 h，棄上清液，用pH7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次。最后加入200 μL 細胞裂解緩沖液（乙醇:1%冰醋酸=1:1），室溫孵育30 min，使用酶標儀在540 nm 波長下測量吸光度值。根據不同配比對免疫細胞的影響篩選出最佳配方以供后續實驗使用。

1.2.4 茶與石斛提取液混合液對環磷酰胺造成的免疫抑制的預防作用

1.2.4.1 動物分組與處理 KM 小鼠適應性飼養3 d后用于實驗。在實驗之前和在實驗期間，將小鼠飼養在溫度（25±2）℃和12 h 明暗循環的受控環境條件下，并且充足飼料和水源的條件下自由進食。將小鼠隨機分為5 組（n=10）：正常對照組（NC）、Cy（環磷酰胺）模型組（MC）、Cy+低劑量組（KTDH（100））、Cy+中劑量組（KTDH（200））、Cy+高劑量組（KTDH（400））。第1～10 d 給NC 組和MC 組灌胃生理鹽水，給KTDH（400）組，KTDH（200）組和KTDH（100）組分別以400、200、100 mg/kg 劑量的KTDH灌胃小鼠；從第8～10 d，除NC 組外，其余各組小鼠腹腔注射80 mg/kg Cy，NC 組注射等量生理鹽水，每天一次，連續3 d。末次給藥后24 h 禁食禁水，稱量體重，取血，取脾臟，脫脊椎處死小鼠。

1.2.4.2 指標測定及病理形態觀察 摘眼球取血后，靜置1 h，離心（6000×g，3 min，4 ℃）獲得血清。按照試劑盒說明通過試劑盒檢測血清中IL-2、IL-6、TNF-α水平。

將脾臟切片依次置于二甲苯I 中20 min，二甲苯II 中20 min，無水乙醇I 中5 min，無水乙醇II 中5 min，75%乙醇中5 min，最后用自來水沖洗。切片浸蘇木精染色液3～5 min 后，用自來水沖洗，用分化液分化，再用自來水沖洗，反藍液反藍，最后用流水沖洗。切片在85%、95%梯度酒精中脫水5 min，在伊紅染色液中染色5 min。切片先后置于無水乙醇I 中5 min、無水乙醇II 中5 min、無水乙醇III 中5 min、二甲苯I 中5 min、二甲苯II 中5 min，最后用中性膠密封。顯微鏡檢查后采集圖像并進行分析。

所有動物實驗皆經過皖西學院科學研究倫理審查委員會的許可，批準編號為202207001。

1.3 數據處理

實驗數據采用SPSS.26.0 軟件進行統計分析，用Origin 2019b 作圖，所有檢測結果以均值±標準差（±SD）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）比較各組間的均值。

2 結果與分析

2.1 祁門紅茶提取工藝單因素實驗結果

料液比對祁門紅茶的提取效果的影響如圖1 中所示，茶多酚得率在料液比小于等于1:80（g/mL）時隨著料液比的升高而逐漸升高且后續增多的量逐漸減少，其主要原因應該是由于溶劑的增多導致多酚溶出率的增加。得率在料液比1:80（g/mL）時達到最高值，多酚得率為（8.16±0.37）%。考慮到濃度過低會影響后續產品保健效果，因此選取1:80（g/mL）的料液比進行后續實驗。

圖1 料液比、提取時間和提取次數對祁門紅茶多酚得率的影響（n=3）Fig.1 Effects of solid-liquid ratio,extraction time and extraction times on the yield of polyphenols from Keemun black tea (n=3)

提取時間對祁門紅茶的提取效果如圖1 中所示，茶多酚得率在45 min 時提取效果最佳，多酚得率為（8.25±0.49）%。可能是因為提取時間較長，茶葉完全舒展之后接觸面積增大導致多酚溶出率增加。考慮到后續工業化生產的因素，提取時間更長對多酚含量的影響已經很小，因此綜合時間成本考慮選取45 min 的提取時間進行后續實驗。

提取次數對祁門紅茶的提取效果影響如圖1 所示，在提取次數達到3 次時，其提取效果較好，多酚得率為（8.13±0.05）%，后續繼續增加提取次數對多酚得率的影響并不大，綜合考慮性價比和提取效率等因素，將提取次數定為3 次。

2.2 霍山石斛提取工藝單因素實驗結果

料液比對霍山石斛多糖得率的影響如圖2 中所示，其多糖得率隨著料液比的增加逐漸增加，在料液比1:100（g/mL）時達到最大值，此時的多糖得率為（63.83±8.34）%。考慮到后續濃度較低會對產品的保健效果有影響，因此選取料液比1:100（g/mL）進行后續實驗。

圖2 料液比、提取時間和提取次數對霍山石斛多糖得率的影響（n=3）Fig.2 Effects of solid-liquid ratio,extraction time and extraction times on polysaccharide yield of Dendrobium huoshanensis (n=3)

提取時間對霍山石斛多糖得率的影響如圖2所示，多糖得率在60 min 時達到最大值，其主要原因應是提取液中多糖含量過高時，提取時間過久反而導致溶液過于粘稠，導致石斛粉末成團，接觸面積下降，導致溶出率下降。因此最后多糖得率為（68.11±1.01）%。因此選取最佳提取時間為60 min 進行后續實驗。

提取次數對霍山石斛多糖得率的影響如圖2 所示，多糖得率在提取次數為3 次時最高，為（53.57±2.40）%。主要原因可能是在多次提取中石斛粉末多次反復接觸溶劑導致提取率升高。且后續增加提取次數對多糖得率的影響并不大，因此選取最佳提取次數3 次進行后續實驗。

2.3 正交試驗結果

祁門紅茶的正交試驗結果由表3 所示，根據極差分析，對祁門紅茶的提取因素影響程度大小順序為C>A>B，也就是提取次數>料液比>提取時間。因此可以確定在實際操作中提取次數對祁門紅茶提取效果影響最大，提取時間影響最小。由表3 可知其組別中得率最高的提取條件為A3B1C3，而根據各條件K 值推斷得出的最佳提取條件則是A3B3C3，對兩種方法進行重復實驗對比，發現兩種提取條件無顯著性差異，為了節約時間成本，因此最終選用A3B1C3作為最后的提取條件。將該條件經過3 次重復性驗證，確定其方法具有穩定性和較好的提取效果。

表3 祁門紅茶正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal test of Keemun black tea

霍山石斛的正交試驗結果如表4 所示，根據極差分析，影響霍山石斛多糖得率的各提取因素的主次順序為A>C>B，也就是料液比>提取次數>提取時間。說明在提取過程中料液比對霍山石斛多糖得率的影響最大，提取時間影響最小。由表4 可知，最佳提取條件為A2B3C2。將該條件經過3 次重復性驗證，確定其方法具有穩定性和較好的提取效果。

表4 霍山石斛正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal test of Dendrobium huoshanensis

2.4 提取混合液對免疫細胞增殖活力與吞噬活力的影響

以不同濃度的KTDH（0、2.5、5、10、20、40、50、100 μg/mL）孵育RAW264.7 細胞24 h，觀察KTDH對RAW264.7 細胞的毒性作用。從圖3 可以看出，KTDH（100%霍山石斛）對細胞活力沒有明顯增強甚至略有降低，該結果可能是由于霍山石斛多糖具有免疫調節作用，而其他成分對細胞有微弱毒性，細胞吞噬過程中二者皆有攝入，因此導致本組的免疫細胞活力增強不明顯甚至降低。KTDH（100%祁門紅茶）對細胞的抑制作用隨著濃度的增加而增強可能是由于祁門紅茶中的細胞毒性成分含量較高。KTDH（75%霍山石斛加25% 祁門紅茶）對細胞的抑制趨勢與KTDH（100%霍山石斛）相似，皆呈現抑制效果，但KTDH（75%霍山石斛加25% 祁門紅茶）抑制作用更強，原因可能是由于加入了祁門紅茶配比的提取液整體中具有細胞毒性的物質增多。KTDH（50%霍山石斛加50%祁門紅茶）和KTDH（25%霍山石斛加75%祁門紅茶）在一定濃度范圍內顯著增強細胞活力（P<0.05），且增強幅度相似的原因有可能是因為霍山石斛的多糖成分和祁門紅茶的多酚成分發揮的免疫調節作用[6,10]。

圖3 不同濃度和比例的混合溶液對細胞增殖活性的影響（n=6）Fig.3 Effects of different concentrations and ratios of mixed solution on cell proliferation activity (n=6)

以不同濃度的KTDH（2.5、5、10、20、40、50和100 μg/mL）和LPS（10 μg/mL）孵育細胞24 h，用中性紅染色法檢測細胞的吞噬活性。從圖4 中可以看出，除KTDH（100%霍山石斛）和KTDH（25%霍山石斛加75%祁門紅茶）外，其他處理對細胞吞噬活性的增強效果都不如LPS，KTDH（25%霍山石斛加75%祁門紅茶）的免疫增強效果強于KTDH（100%霍山石斛）。綜合考慮，選擇KTDH（25%霍山石斛加75%祁門紅茶）作為后續動物實驗的給藥配方。

圖4 不同濃度和比例的混合溶液對細胞吞噬活性的影響（n=6）Fig.4 Effects of different concentrations and ratios of mixed solution on cell phagocytic activity (n=6)

2.5 茶與石斛提取液混合液對環磷酰胺造成的免疫抑制的預防作用

通過建立環磷酰胺誘導的動物模型，探討KTDH對血液生化指標的影響；采用相關試劑盒檢測血清IL-2、IL-6 和TNF-α水平。不同組小鼠IL-2 和IL-6的含量如圖5a 和圖5b 所示，與NC 組相比，MC 組IL-2 和IL-6 水平顯著降低（P<0.05）。同時，圖5a 顯示各濃度KTDH 對IL-2 水平的恢復均有積極作用（P<0.01），圖5b 顯示KTDH（400）對IL-6 水平的恢復有積極作用（P<0.01）。從圖5c 可以看出，與NC 組相比，MC 組的TNF-α水平明顯升高（P<0.01）。KDTH（400）對TNF-α水平的恢復起正向作用（P<0.01），而KDTH（100）對TNF-α水平的恢復起負向作用（P<0.05）。

圖5 不同濃度KTDH 對血清細胞因子水平的影響（n=10）Fig.5 Effect of different concentrations of KTDH on serum cytokine levels (n=10)

如圖6 所示，NC 組和KDTH（400）組細胞形態相似。脾髓、脾體形態結構規整有序。脾臟內淋巴細胞數量多，排列緊密。脾紅髓形態正常，無異常充血。MC 組脾體結構疏松，淋巴細胞數量較少。而且，脾的紅髓淤血也很嚴重。與MC 組比較，KTDH組（100、200、400 mg/kg）脾小體數量和面積增加，紅髓充血程度也不同程度減輕。因此，環磷酰胺可能部分通過減少脾小體發揮免疫抑制作用，而KTDH 可能通過保護脾小體，恢復淋巴細胞數量，增強免疫功能。實驗結果表明，祁門紅茶與霍山石斛的提取物混合液對于環磷酰胺導致的免疫力低下有明顯預防作用。

圖6 不同濃度KTDH 對脾臟的影響Fig.6 Effects of different concentrations of KTDH on the spleen

3 結論與討論

環磷酰胺是臨床上常用的用于腫瘤治療和血液及骨髓移植的藥物，具有良好的免疫抑制效果[22]。因此，通過注射環磷酰胺在小鼠中誘導免疫抑制是一種被廣泛接受的免疫抑制模型。白細胞和單核巨噬細胞是免疫系統的重要組成部分，血清中IL-2、IL-6 和TNF-α的水平變化是反映免疫活動的重要指標[23-24]。細胞因子作為機體免疫應答系統中的重要因素，不僅可以單獨起效，還可以與其他細胞因子相互誘生，相互影響而在免疫反應過程中發揮生物學效應[25]。因此IL-2、IL-6 和TNF-α水平變化在一定程度上會影響到免疫反應的進程。有報道表明，霍山石斛多糖可通過激活p38、ERK、JNK 和核NF-κB 易位，顯著刺激RAW 264.7 巨噬細胞分泌NO、TNFα、IL-6 和IL-10，具有良好的免疫調節活性[26]。而關于茶多酚的研究表明其對白細胞介素的表達具有一定的抑制作用[27]。因此推測霍山石斛與祁門紅茶之間的配伍可以發揮免疫調節作用，不僅可以預防免疫系統被抑制，還可以在免疫系統活動過強時抑制其炎癥相關因子的分泌，機制可能是與IL-2、IL-6 和TNF-α等炎癥因子的表達通路相關。

本研究通過KTDH 連續灌胃10 d，隨后腹腔注射環磷酰胺的方法，研究了KTDH 對免疫抑制的預防作用。結果表明，模型組IL-6、IL-2 水平顯著性降低（P<0.05），這與之前的研究一致。經KTDH 治療后，小鼠血清中細胞因子IL-6、IL-2 水平較模型組有明顯升高，證明KTDH 可能是通過提高IL-6、IL-2 血清水平改善免疫功能。有研究表明，環磷酰胺可引起炎癥反應[28]。從血清TNF-α水平的變化來看，環磷酰胺明顯引起炎癥反應，從而使血清TNF-α水平顯著升高（P<0.01）。經KTDH 處理后，高劑量組TNF-α水平明顯受到抑制（P<0.01）。表明高劑量KTDH 可抑制環磷酰胺誘導的炎癥反應。

實驗結果表明，祁門紅茶與霍山石斛的提取物混合液對于環磷酰胺導致的免疫力低下有明顯預防效果，可以作為日常生活中的免疫調節劑以及在臨床上對病患的免疫預防起到一定作用。本研究為探究中草藥與一些常規飲品的配伍奠定基礎以及開發方向。同時，此研究對于霍山石斛資源和紅茶的資源開發具有重要意義，對未來的本草產品和茶產品的開發應用也具有指示意義。最后，本研究為霍山石斛茶飲作為一種有效的免疫調節劑的應用奠定了基礎，并為未來發現和開發具有醫療價值的本草產品提供了豐富的理論支持和數據支持。