蕎麥麩皮黃酮穩(wěn)定性和抗氧化活性分析及其殼聚糖共混膜的制備

郭佩佩，李 琳，金麗娜，章 中，傅 婧

（寧夏大學食品科學與工程學院，寧夏銀川 750021）

蕎麥（Fagopyrum esculentumMoench.）是一年生草本植物，是藥食同源食物[1]，主要生產地有中國、俄羅斯、烏克蘭、法國和波蘭等地[2]。蕎麥通常分為普通蕎麥（甜蕎）和苦蕎。普通蕎麥味甜，種子大，易于脫殼，消量高；苦蕎味苦，種子小，皮包裹緊，不易脫殼。蕎麥粉在加工過程中會產生大量的副產物蕎麥麩皮，其中含有多種類黃酮，但因其口感較差，且不易被人體消化吸收，常被用作飼料或直接丟棄，致其浪費且污染環(huán)境。

黃酮類化合物是由三原子碳單元C6-C3-C6 連接而成的碳骨架[3]，可分為花青素、黃烷酮、黃酮、異黃酮、黃酮醇和查耳酮[4]，其具有重要的生物學特性，包括降血糖、降血壓、降血脂、增強免疫力、抗炎[5]、抗癌[6]及抗病毒等生物活性。此外，黃酮類化合物作為抗氧化劑可以有效地清除自由基，從而維持體內的氧化平衡，并減弱自由基對機體的損害[7]。劉東旭[8]研究發(fā)現(xiàn)蕎麥殼、蕎麥麩皮及蕎麥面粉中黃酮含量最高的是蕎麥麩皮。因此，提取蕎麥麩皮中的黃酮類化合物加以利用，可減少資源浪費提高經濟價值。

殼聚糖（chitosan，CS）是甲殼素的衍生物，成膜性能良好，因此常被用作制備生物活性薄膜[9]，但因其易溶于酸且分子量高，導致其抗氧化及抗菌活性弱，純CS 膜不足以保護食品的氧化變質，從而限制了其在各種食品應用中的使用[10]。因此，將具有抗氧化性的生物活性物質摻入CS 薄膜中是改善CS 薄膜物理和生物學特性的有效途徑。目前，通過添加具有抗氧化或抗菌活性的不同天然產物，例如細菌素、精油、植物提取物和酚類化合物，已經開發(fā)出許多基于CS 的共混膜[11]。在CS 膜中加入黃酮類化合物可提高共混膜的整體機械性能，減少殼聚糖分子內和分子間的氫鍵，從而增強共混膜的抗氧化及抗菌活性。何惠利等[12]發(fā)現(xiàn)蒲公英黃酮-殼聚糖共混膜能抑制微生物繁殖，延緩脂肪氧化，保持雞胸肉的風味品質。

本研究以蕎麥麩皮為研究對象，通過使用超聲輔助提取法從蕎麥麩皮中提取黃酮類化合物，對其穩(wěn)定性及體外抗氧化活性進行研究，并制備蕎麥麩皮黃酮-殼聚糖共混膜（BBF-CS），探究蕎麥麩皮黃酮（buckwheat bran flavonoids，BBF）的添加量對共混膜性能的影響，以期制得性能較好的BBF-CS 共混膜，提高蕎麥麩皮的經濟價值及綜合利用率，對促進蕎麥麩皮的發(fā)展具有重要意義，同時可為BBF-CS共混膜在食品包裝和保鮮中的應用提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥麩皮 陜西定邊縣（市場購買）；蘆丁標準品 上海源葉生物科技有限公司；殼聚糖、無水乙醇、乙酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、鐵氰化鉀、三氯化鐵、亞硝酸鈉、丙三醇 分析純，山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司。

SE-750 型高速粉碎機 圣象電器有限公司；BSA223S 型分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TDL-5-A 型離心機 上海安亭科學儀器廠；V-5100 型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；RE-2000A 型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50 型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康儀器有限公司；BXH-280H 精密可程式烘箱 上海新黃醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BBF 提取 BBF 提取方法參考王昱儒等[13]方法稍作修改，將蕎麥麩皮粉碎，過60 目篩，保存?zhèn)溆谩７Q取蕎麥麩皮粉與50%的乙醇溶液1:50 混勻，置于70 ℃超聲波中超聲80 min，離心（20 min，5000 r/min）后將上清液旋轉蒸發(fā)，除去乙醇和水，置于-80 ℃冰箱，冷凍干燥得到BBF，置于干燥器內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BBF 穩(wěn)定性研究

1.2.2.1 pH 對BBF 的影響 稱取一定質量純化后的BBF 粉末用蒸餾水復溶，每支試管中放入等體積黃酮溶液，用氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調節(jié)pH 分別為1、3、5、7、9、11，做三組平行試驗，將各試管中的黃酮溶液避光保存3 h，測定各試管中的黃酮含量，測定pH 對BBF 穩(wěn)定性的影響。

1.2.2.2 溫度對BBF 的影響 稱取一定質量純化后的BBF 粉末用蒸餾水復溶，每支試管中放入等體積黃酮溶液，將各試管分別置于4、25、50、70、90 ℃的溫度條件下，做三組平行試驗，將各試管中的黃酮溶液避光保存3 h，測定各試管中的黃酮含量，測定溫度對BBF 穩(wěn)定性的影響。

1.2.2.3 光照對BBF 的影響 稱取一定質量純化后的BBF 粉末用蒸餾水復溶，每支試管中放入等體積黃酮溶液，將各試管分別置于室外太陽光、室內自然光和室內避光條件下（10 月，寧夏大學農學院三樓）保存3 h，做三組平行試驗，測定各試管中的黃酮含量，測定光照對BBF 穩(wěn)定性的影響。

1.2.2.4 金屬離子對BBF 的影響 稱取一定質量純化后的BBF 粉末用蒸餾水復溶，每支試管中放入等體積黃酮溶液，各添加0.1%的Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+，做三組平行試驗，將各試管中的黃酮溶液避光保存3 h，測定各試管中的黃酮含量，測定pH對BBF 穩(wěn)定性的影響。

1.2.3 BBF 體外抗氧化活性分析

1.2.3.1 DPPH 自由基清除能力 參考盛丹丹[14]方法稍作修改，分別制備0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的黃酮樣液。在517 nm 下測定各反應吸光值，計算公式如下：

式中：A1表示DPPH 與黃酮反應的吸光值；A0表示無水乙醇與DPPH 反應的吸光值；A2表示無水乙醇與黃酮反應的吸光值。

1.2.3.2 鐵還原力清除能力 參考陸慶[15]方法，分別制備2.0、4.0、6.0、8.0、10 mg/mL 的黃酮樣液。在700 nm 下測定各反應吸光值，吸光值的高低反映了還原力的強弱。

1.2.3.3 ABTS+自由基清除能力 參考Wang 等[16]方法稍作調整，分別制備0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的黃酮樣液。在734 nm 下測定各反應吸光值，計算公式如下：

式中：A1表示ABTS+·溶液與黃酮反應的吸光值；A0表示ABTS+·溶液與蒸餾水反應的吸光值。

1.2.3.4 超氧陰離子自由基清除能力 參考李穎等[17]方法，分別制備0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的黃酮樣液。在299 nm 下測定各反應吸光值，計算公式如下：

式中：A1表示Tris-HCL 緩沖溶液+黃酮+鄰苯三酚+鹽酸反應的吸光值；A0表示蒸餾水作為空白對照反應的吸光值；A2表示蒸餾水代替鄰苯三酚反應的吸光值。

1.2.4 BBF-CS 共混膜制備 參考姜雪等[18]方法制作共混膜。2%乙酸35 mL+1 g 殼聚糖+0.3 g 甘油，50 ℃水浴30 min 攪拌，5%樣液（0、5、10、15、20 mL），50 ℃水浴30 min 攪拌，室溫超聲20 min除氣泡，20 mL 共混膜液倒入10 cm 平板，50 ℃烘干。

1.2.5 共混膜指標測定

1.2.5.1 共混膜厚度測量 共混膜厚度使用塑料薄膜測厚儀進行測量。在膜上隨機選取幾個位置重復測量，計算平均值。

1.2.5.2 共混膜透明度的測定 選取光滑、平整、潔凈且無瑕疵的膜，將共混膜（1 cm×4 cm 樣條）置于紫外分光光度計中，在600 nm 處測定試樣膜的吸光度。未放置膜的單元作為參照樣。試樣膜的透明度以不透明度表示，計算公式如下：

式中：O 表示不透明度；Abs600表示試樣在600 nm 下的吸光度；d 表示試樣的厚度，mm。

1.2.5.3 共混膜顏色的測定 用色差儀測量膜的顏色，L*表示明亮度，它的值越大表明膜越亮白。a*表示紅綠色，當a*的值大于0 時表示所占比重較大的顏色為紅色，當a*的值小于0 時表示所占比重較大的為綠色；b*表示黃藍色，當b*的值大于0 時表示所占比重較大的顏色為黃色，當b*的值小于0 時表示所占比重較大的顏色為藍色。裁取大概8 cm×8 cm的待測膜，用色差計進行測定與記錄數(shù)據(jù)。以標準白板為色差參比，總色差值△E按照以下公式計算。

式中：?L*=L*-L0，?a=a*-a0，?b=b*-b0；L*，a*，b*表示實際測得的待測樣品的數(shù)值；L0，a0，b0表示標準白板的數(shù)值。

1.2.5.4 共混膜含水率和水溶解性的測定 將完好無損的復合保鮮膜剪成2 cm×2 cm 大小。稱重，并于105 ℃下干燥4 h，稱重，放入裝有40 mL 蒸餾水的錐形瓶中，室溫下浸泡24 h，取出后于105 ℃下干燥4 h，稱重，按下式計算膜的含水率與水溶性。

式中，MC 表示含水率，%；WS 表示溶解性，%；W0表示共混膜的質量，g；Wd表示共混膜干燥后的質量，g；Wt表示浸泡后再干燥共混膜的質量，g。

1.2.5.5 力學性能測定 共混膜力學性能測定參考李昊珍[19]方法。共混膜的力學性能通過測定抗拉強度和斷裂伸長率來表示。將共混膜均勻裁減，使用電子萬能試驗機進行測定，初始距離為20 mm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Origin 2021b 軟件進行繪圖，SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。所有試驗均重復三次，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 BBF 穩(wěn)定性研究

pH 對BBF 穩(wěn)定性影響如圖1a 可知，pH<7 時，BBF 含量隨pH 的上升而顯著升高（P<0.05），pH 大于7 時，BBF 含量隨pH 的上升而降低。當pH=1或pH=11 時，BBF 含量較低，說明BBF 不適宜在過酸或過堿的環(huán)境中儲存。pH 在5～7 時，黃酮含量最高。李慧等[20]發(fā)現(xiàn)從桑葚黃酮更適宜在弱酸性條件下貯藏，與此研究結果一致。這主要是因為BBF 分子的酚羥基結構，在堿性條件下酚羥基醚化[21]，使得含量降低。因此，BBF 更適宜弱酸或中性環(huán)境，避免強酸強堿環(huán)境。

圖1 pH、溫度、光照條件以及金屬離子對蕎麥麩皮黃酮穩(wěn)定性影響Fig.1 Effects of pH,temperature,light conditions and metal ions on the stability of buckwheat bran flavonoids

溫度對BBF 穩(wěn)定性影響如圖1b 可知，隨著溫度的上升BBF 含量逐漸降低。4 ℃時黃酮含量最高，常溫條件下黃酮含量無明顯變化，大于50 ℃時，隨著溫度的持續(xù)升高黃酮含量下降顯著（P<0.05）。由于溫度的升高會加快分子間的運動，使得BBF 氧化分解速率加快。因此BBF 應在4 ℃或常溫下貯藏加工，溫度不宜超過50 ℃。

光照條件對BBF 穩(wěn)定性影響如圖1c 可知，不同光照條件會影響B(tài)BF 的穩(wěn)定性。室外自然光保存時黃酮含量最低，而避光保存可以使BBF 保持穩(wěn)定。這與黃瓊等[22]對洛神花黃酮的穩(wěn)定性試驗結果一致，避光保存穩(wěn)定性最好。這主要是因為黃酮對紫外線敏感，具有一定光敏性，自然光照射會加速黃酮分解[23]，破壞黃酮結構。因此BBF 在貯藏加工過程中應盡可能避光保存。

金屬離子對BBF 穩(wěn)定性影響如圖1d 可知，以對照組為參比，部分金屬離子影響了BBF 的穩(wěn)定性。在加入Na+、K+、Zn2+時，BBF 含量相對保持穩(wěn)定，而Ca2+、Fe3+、Cu2+加入后，黃酮含量顯著下降。這主要是因為這些金屬離子會與黃酮類化合物的鄰二酚羥基發(fā)生絡合反應[24]，破壞黃酮結構，且金屬離子本身具有一定顏色，用吸光度法測定時也會造成影響。因此BBF 在加工過程中應該避免Ca2+、Fe3+、Cu2+的接觸。

2.2 體外抗氧化活性分析

DPPH 自由基存在單電子，在乙醇溶液中呈現(xiàn)紫色，可與黃酮類化合物中的氧原子配對，使DPPH 自由基清除到穩(wěn)定狀態(tài)，其顏色變?yōu)辄S色，在517 nm處存在特征吸收[25]。由圖2a 可知，在一定濃度范圍內，清除率與其濃度呈正相關。當濃度為1.0 mg/mL時，BBF（92.1%）和VC（98.7%）對DPPH 自由基清除率都達到最高。這與盛丹丹[14]從黃金茶提取黃酮對DPPH 的抗氧化效果一致，黃金茶黃酮和VC對DPPH 自由基清除率都達到了90%以上，抗氧化效果顯著。由此可見BBF 是有效的抗氧化劑。

圖2 BBF 與VC 清除自由基能力Fig.2 Free radical scavenging ability of buckwheat bran flavonoids and VC

鐵氰化鉀反應后結合生成普魯士藍，在700 nm下存在特征吸收。由圖2b 可知，BBF 和VC在一定濃度范圍內，其吸光度呈上升趨勢。當濃度為10.0 mg/mL時，BBF 和VC還原力都達到最高，其吸光值分別為3.54、3.95。這與陸慶[15]從桃花提取黃酮對鐵還原力的能力相同，隨著濃度的升高，桃花黃酮和VC吸光值也升高，還原力提高，抗氧化活性增強。由此可見BBF 具備鐵離子還原能力。

ABTS 氧化生成ABTS+自由基，呈藍綠色，在734 nm 處具有特征吸收，與黃酮反應后，抑制了ABTS+自由基的生成，吸光度在其最大波長下降低[26]。由圖2c 可知，BBF 和VC在一定濃度范圍內，其ABTS+自由基清除率逐漸升高。當濃度為1.0 mg/mL 時，BBF（87.7%）和VC（98.84%）對ABTS+自由基清除率都達到最高。這與Wang 等[16]從黃花菜葉提取黃酮對ABTS+自由基的抗氧化效果一致，當類黃酮濃度達到0.35 mg/mL 時，類黃酮對ABTS+自由基清除率達到95.60%，接近了抗壞血酸的清除率。由此可見BBF 可以有效地清除ABTS+自由基，是良好的抗氧化劑。

鄰苯三酚在堿性條件下與黃酮反應會抑制其自動氧化而生成超氧陰離子，從而達到抗氧化效果。由圖2d 可知，BBF 和VC在一定濃度范圍內，對超氧陰離子自由基清除率緩慢升高。當濃度為1.0 mg/mL時，蕎麥麩皮（53.81%）和VC（89.41%）對超氧陰離子自由基清除率都達到最高。這與李穎等[17]分析黃晶果皮黃酮對超氧陰離子的抗氧化效果一致，黃晶果皮黃酮對超氧陰離子自由基的清除率與濃度呈正相關，有抑制作用。由此可見BBF 可以有效的清除超氧陰離子自由基。

2.3 BBF-CS 共混膜性能測定

2.3.1 BBF-CS 共混膜厚度及不透明度 薄膜的厚度是評價食品包裝性能的一個重要指標，過厚或過薄都不適宜用作包裝材料。由表1 可知，隨著BBF 添加量的增加，薄膜厚度逐漸增加，呈正比例趨勢。當BBF 添加量達到20 mL 后，薄膜厚度從0.0684 mm增加到0.0953 mm。由于薄膜在制作過程中，倒平板的膜液質量和烘干時間都相同，但共混膜厚度不同，因此BBF 的添加量會影響薄膜分子之間的排列結構。這主要是因為CS 中存在大量的羥基物質，BBF可增加交聯(lián)與CS 結合，從而導致CS 與BBF 之間的距離變短，薄膜表面形成堆積[27]，使得薄膜厚度增加。此外，BBF 的存在破壞了CS 聚合鏈的有序排列，分子以更松散的方式排列，使BBF-CS 共混膜表面形成致密突出的結構[28]，且共混膜的固形物含量也隨之增加，使得薄膜厚度增加[29]。

表1 BBF 添加量對共混膜厚度及不透明度影響Table 1 Effects of BBF addition on the thickness and opacity of composite film

對于易受光照影響的食品，包裝材料的不透明度也是保障食品營養(yǎng)品質的重要特性，薄膜包裝食品暴露在紫外可見光下時，很容易被氧化，導致食品營養(yǎng)損失、變色和產生異味。在可見光和紫外線的作用下，氧氣能迅速從基態(tài)轉變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，導致包裝食品氧化變質[30]。BBF-CS 共混膜的不透明度如表1可知，BBF 的加入增加了薄膜的不透明度。當BBF添加量達到20 mL 后，薄膜不透明度由0.765 增加到0.940。CS 共混膜的不透明度低是由于缺乏紫外可見吸收基團，而BBF 分子中的芳香基團對紫外光、可見光以及一些低能輻射表現(xiàn)出優(yōu)異的紫外阻隔性能。此外，BBF 與CS 之間的交聯(lián)會增加薄膜的致密性，從而對紫外線和可見光產生抵抗力，防止薄膜包裝食品的氧化變質。

2.3.2 BBF-CS 共混膜色度 薄膜的顏色通常會影響薄膜包裝食品對消費者的接受程度，CS 膜與BBFCS 共混膜的L*、a*、b*、?E如表2 所示。添加BBF后，薄膜的L*和 ?E值顯著降低（P<0.05），表明BBF 的添加使得薄膜亮度降低，逐漸變暗；a*代表的是薄膜的紅度，無顯著變化；b*代表薄膜的黃度，薄膜黃度逐漸增加，這是因為BBF 存在有色化合物，呈現(xiàn)為淡黃色，添加后會使薄膜黃度增加。這與平雪麗對山奈提取物改性殼聚糖膜的顏色變化結果一致。

表2 BBF 添加量對L*、a*、b*及 ?E值影響Table 2 Effects of BBF addition on L*,a*,b* and ?E values

2.3.3 BBF-CS 共混膜含水率、水溶解性 水分含量反映了潮濕環(huán)境中薄膜的吸濕特性。CS 膜與BBFCS 共混膜的含水量如圖3 所示。CS 膜的含水量最高，這是由于水分子與殼聚糖官能團之間的強氫鍵相互作用導致的。隨著BBF 的加入，共混膜的含水量由28.37%降至20.35%。這是因為BBF 分子中的羥基和羧基可以與CS 中的親水基團相互作用，使得薄膜更致密，從而阻礙了殼聚糖與水分形成分子間氫鍵，限制了薄膜的吸水能力，使得水分含量降低。當蘋果皮多酚與殼聚糖復配時，也可觀察到類似的結果[31]。

圖3 BBF 添加量對水分含量及溶解度影響Fig.3 Effect of BBF addition on water content and solubility

溶解度用于反映天然包裝薄膜的耐水性，其主要與薄膜的親水性和疏水性有關，溶解度越低，表明薄膜的水溶性越好。CS 膜與BBF-CS 共混膜的溶解度如圖3 所示。CS 膜的溶解度最高，這主要是因為CS 膜自身含有氨基等親水性基團。薄膜的溶解度隨BBF 的添加逐漸降低（P<0.05），這主要是因為BBF 中存在大量的疏水性基團苯環(huán)，與CS 分子中的親水性基團相互作用，發(fā)揮作用的親水基團減少，且增加了共混膜的疏水性，提高了生物聚合物的界面結合特性，從而使得薄膜溶解度降低[32]。

2.3.4 BBF-CS 共混膜力學性能 力學性能是描述薄膜在食品包裝、運輸及貯藏過程中承受應力的能力，包括抗拉強度和斷裂伸長率，其反映了共混膜的強度和柔韌性。通常，薄膜的力學性能取決于加入的活性化合物的類型和含量，聚合物基質的種類以及不同組分之間的特定相互作用。CS 膜與BBF-CS 共混膜的抗拉強度和斷裂伸長率如圖4 所示。隨著BBF 的添加，薄膜的抗拉強度呈下降趨勢（P<0.05），這主要是因為BBF 對CS 薄膜內部結構的破壞力強于兩者的氫鍵結合力，使其變形抗力減弱，最終加入BBF 的共混膜的拉伸強度低于CS 膜。并且，酯類可以打亂聚合物結構中的結晶順序，降低CS 的結晶度，從而削弱分子間相互作用并降低拉伸強度[33]。此外，薄膜表面也會出現(xiàn)少量的不溶性顆粒，從而影響了薄膜的致密性，使得抗拉強度下降。薄膜的斷裂伸長率也受BBF 含量的影響。隨著BBF 含量的增加，BBF-CS 共混膜的斷裂伸長率呈下降趨勢，從71.63%降至44.75%，降低了薄膜的柔韌性，提高了剛性。這表明CS 膜在BBF 的加入后運動受到很大的限制，BBF 會在共混膜中發(fā)生聚集導致分子間氫鍵弱化，阻礙BBF-CS 鏈的相互作用，影響薄膜致密穩(wěn)定結構的形成，造成膜的機械性能下降[34]。

圖4 BBF 添加量對抗拉強度及斷裂伸長率影響Fig.4 Effect of BBF addition on tensile strength and elongation at break

3 結論

本研究以蕎麥麩皮為原料，采用超聲輔助提取法提取BBF，通過穩(wěn)定性研究表明，BBF 應貯藏于弱酸（pH5～7）環(huán)境中避光常溫保存，且不易與Ca2+、Fe3+、Cu2+的接觸。BBF 對DPPH 自由基（92.1%）、鐵還原力（3.54）、ABTS+自由基（87.7%）和超氧陰離子自由基（53.81%）的清除能力良好，在體外具有很強的抗氧化活性，是一種天然的抗氧化劑。通過測定BBF-CS 共混膜的性能，表明BBF 的加入會顯著增加薄膜的厚度、不透明度和黃度值，而含水率、溶解度、抗拉強度及斷裂伸長率顯著降低（P<0.05）。因此BBF 的加入可提高共混膜的性能，但共混膜的柔韌性等方面還需進一步優(yōu)化。該實驗結果表明BBF與CS 復合成膜，提高CS 膜的抗氧化性及其機械性能，為CS 膜在食品包裝方面的應用提供了數(shù)據(jù)支撐。