奶粉中飽和烴與芳香烴礦物油的高靈敏檢測方法建立

劉玲玲，李冰寧，楊夢奇，李 婷，武彥文

（北京市科學技術研究院分析測試研究所（北京市理化分析測試中心），北京 100094）

近年來，公眾對礦物油污染逐漸重視，特別是2019 年非政府組織Foodwatch 發布報告，指出嬰幼兒配方奶粉含有芳烴礦物油（mineral oil aromatic hydrocarbons，MOAH）[1]之后，人們對礦物油的關注度提高，相關部門的監管規定和方法要求也逐年升級。2019 年，歐洲食品安全局（EFSA）開展了針對奶粉中礦物油的風險評估[2]；2020 年，歐洲聯合研究中心（JRC）開始著手建立奶粉中MOAH 的檢測規范[3]；2022 年，德國食品聯合會（BLL）推出包含奶粉在內的9 大類食品中礦物油的基準值[4]；同年，歐盟植物、動物、食品和飼料常務委員會（SCoPAFF）發布了“關于食品（包括嬰幼兒食品）中MOAH 的聯合聲明草案”，規定奶粉中礦物油的限量為1 mg/kg[5]。

礦物油源于石油和合成油，石化企業生產的柴油、潤滑油、溶劑油、白油等均為礦物油產品[6]。因此，礦物油可以通過食品生產鏈的各個環節（如原料種/養植、運輸、加工、包裝與環境污染等）遷移至食品造成污染[7-12]。2012 年，EFSA 給出食品中礦物油污染物的定義，即沸程范圍n-C10～n-C50的所有碳氫化合物，可粗略分為飽和烴礦物油（mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH）和MOAH 兩類[6]。MOSH和MOAH 的毒性差異很大，MOSH 容易蓄積在肝臟、脾臟、淋巴結等器官和組織中形成微型肉芽腫；MOAH 則有潛在的致癌、致畸和發育毒性[13-15]。

目前國內外并沒有出臺奶粉中礦物油的檢測標準。礦物油是由數以萬計烴類化合物組成的混合物，其化學類型復雜，一般測其總量。氣相色譜（gas chromatography，GC）的氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）具有等碳響應，無需一一對應標準對照物，只用任意內標即可準確定量，是目前測定礦物油的理想方法[16-17]。然而，由于樣品基質復雜，礦物油含量低，常規GC-FID 的選擇性和靈敏度無法滿足分析要求。而高效液相色譜-氣相色譜聯用（on-line high-performance liquid chromatography coupled with gas chromatography，HPLC-GC）儀器通過HPLC 分離解決了礦物油的凈化問題，通過HPLC與GC 之間的接口技術從數量級上提升了方法的靈敏度，從而較好地實現了礦物油的準確測定。缺點是其高度定制化限定了HPLC 硅膠柱的規格，HPLC硅膠柱只能吸附20 mg 油脂[16]，這意味著該儀器的凈化容量有限，因此，干擾物質的有效去除是奶粉中礦物油測定技術的難點。

本文根據奶粉的基質特點，參考歐盟要求[5]，綜合現有的油脂標準[18]和文獻[19-22]方法，系統研究了稱樣量、皂化反應條件、正己烷提取方法、硅膠柱和環氧化凈化方法，最后通過HPLC-GC 分析，以期建立奶粉中MOSH 和MOAH 的高靈敏度檢測方法，從而作為食品企業、監管和檢測機構的常規檢測方法，也可用于未來制定奶粉等相關標準的參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

嬰幼兒配方奶粉 市售；奶粉樣品（RVEP 200612）由德國標物局（DRRR）于2020 年組織國際能力驗證；正己烷（色譜純）、二氯甲烷（色譜純）、無水乙醇（色譜純）、硅膠（63～200 μm，以400 ℃烘烤16 h、置于干燥器中冷卻至室溫）德國默克公司；氫氧化鉀 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫代硫酸鈉和無水硫酸鈉 分析純，國藥集團化學試劑公司；3-氯過氧苯甲酸（m-CPBA）分析純，賽默飛世爾科技公司；MOSH/MOAH 混合標準溶液 含9 種單體化合物，分別為300 mg/L 的正十一烷（n-undecane，n-C11）、環己基環己烷（bicyclohexyl，Cycy）、戊基苯（amylbenzene，5B）、1-甲基萘（1-methylnaphthalene，1-MN）、2-甲基萘（2-methylnaphthalene，2-MN）、1,3,5-三叔丁基苯（1,3,5-tritert-butylbenzene，TBB）、150 mg/L 的正十三烷（n-tridecane，n-C13）和600 mg/L 的膽甾烷（5-alphacholestane，Cho）、苝（perylene，Per）北京壇墨質檢科技有限公司；正構烷烴混合標準溶液 配制含100 mg/L 的n-C10、n-C11、n-C13、n-C16、n-C20、n-C24、n-C25、n-C35、n-C40和n-C50的標準溶液，其中標準品均購自美國Restek 公司。

HPLC-GC 聯用儀器 由日本島津公司的LC 20AD 液相色譜儀（配備紫外檢測器）和2010 plus 氣相色譜儀[配備氫火焰離子化檢測器（FID）]以及德國Axel Semrau 公司的LC-GC 接口組成；SHZ-B 水浴恒溫振蕩器 上海博迅醫療生物儀器公司；Biofuge primo R 低溫高速 賽默飛世爾科技公司；R-100 旋轉蒸發儀、B-290 噴霧干燥儀 瑞士步琦公司；TUS-200P 金屬浴恒溫振蕩器 上海一恒科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 皂化反應 準確稱量奶粉試樣5.0 g（精確至1 mg）于100 mL 玻璃離心瓶中，加入MOSH/MOAH混合標準溶液10 μL，加入溫熱（35～50 ℃）去離子水10 mL，振蕩至沒有明顯結塊；然后加入濃度為0.6 g/mL氫氧化鉀水溶液10 mL 和無水乙醇20 mL，搖勻后于60 ℃皂化反應30 min；冷卻至室溫后向皂化液加入正己烷15 mL，振蕩5 min 后加入去離子水10 mL，劇烈振蕩、離心后取上清液；再次加入正己烷10 mL 重復提取，振蕩分層后取上清液，合并，減壓濃縮至約2～3 mL。

1.2.2 脂肪相對殘留率測定 為了測定皂化后提取液中的脂肪相對殘留率，將上述萃取物（1.2.1）蒸發至干燥，直到恒定重量，見公式（1）。

式中：X 為脂肪相對殘留率，%；m1為恒重后脂肪收集瓶和脂肪質量，g；m2為恒重后脂肪收集瓶的質量，g；m3為空白實驗中，恒重后脂肪收集瓶和脂肪質量，g；m4為空白實驗中，恒重后脂肪收集瓶的質量，g；m 為樣品質量，g；x 為樣品標簽上脂肪含量，%。

1.2.3 硅膠凈化 將3 g 活化硅膠裝入內徑為11～13 mm 的底部有燒結篩板或墊入濾紙或玻璃棉的玻璃層析柱，在上層覆蓋約1 g 無水硫酸鈉；取濃縮液（1.2.1），加入乙醇-水（1:1，v/v）5 mL，振蕩、靜置分層、取上清液；全部轉移至硅膠柱，用15 mL 二氯甲烷-正己烷（3:7，v/v）混合溶劑洗脫，收集流出液，減壓濃縮至約1 mL。

1.2.4 環氧化反應 向濃縮液（1.2.2）中加入0.5 mL的m-CPBA 乙醇溶液（200 mg/mL，2 g m-CPBA 用乙醇定容至10 mL），以40 ℃振蕩反應20 min；然后加入乙醇0.5 mL 和濃度為100 mg/mL 硫代硫酸鈉溶液2 mL 以終止反應，取正己烷層用于HPLCGC 分析。

1.2.5 HPLC-GC 分析 HPLC 色譜柱為Restek Allure Si（250 mm×2.1 mm，內徑5 μm），流動相為（A）正己烷，（B）二氯甲烷；采用梯度洗脫程序：0～0.1 min，100% A（流速為0.3 mL/min）；0.1～6.2 min，70% A（流速為0.3 mL/min）；6.2～15.2 min，100% B（反沖，流速為0.5 mL/min）；15.2～25.2 min，100% A（流速為0.5 mL/min）；25.2～30 min，100% A（流速為0.3 mL/min）。進樣體積為100 μL；以紫外檢測器（230 nm）監測HPLC 的流出情況，此條件下的MOSH 部分于2.0～3.5 min、MOAH 于4.5～6.0 min流出；兩部分分別通過閥切換全部導入GC 分析。

GC 儀器配置兩套完全相同的通道，每個通道均采用Restek MXT 無涂層毛細管預柱（10 m×0.53 mm）和Restek MXT-1 分析柱（15 m×0.25 mm，內徑0.25 μm），預柱與分析柱之間以三通管連接溶劑排空閥[17]。柱溫箱的升溫程序：初始溫度為60 ℃，保持6 min，以15 ℃/min 的速度升溫至120 ℃，然后再以25 ℃/min 的速度升溫至370 ℃，保持6 min；載氣為氫氣（純度≥99.995%），MOSH 和MOAH 通道的初始壓力分別為80 和79 kPa；FID 溫度為380 ℃；FID 的輔助氣為氮氣（流速30mL/min）、燃燒氣為氫氣（流速40 mL/min）、助燃氣為空氣（流速400 mL/min）。

1.2.6 加標樣品制備 對于奶粉樣品，特別是嬰幼兒配方奶粉，其礦物油來源除了包裝材料遷移至奶粉顆粒表面之外，還有可能來源于奶粉的配料，而奶粉配料中的礦物油往往被奶粉的蛋白質顆粒包裹，簡單的加標回收率并不能反映礦物油分析方法的準確性。本文將奶粉用35～50 ℃的溫水溶解，加入不同濃度的礦物油溶液，均質后采用噴霧干燥法制備加標樣品。噴霧干燥器進風溫度為130 ℃，出風溫度為80 ℃[23]。

1.3 數據處理

定量方法為內標法，分別以MOSH/MOAH 混合標準溶液中的Cycy 和TBB 為內標物對MOSH和MOAH 定量。MOSH 和MOAH 的譜圖均為跨越一定碳數范圍的鼓包峰，其含量通過積分計算鼓包峰與基線之間的空白面積與內標峰的面積比獲得；鼓包峰上方的尖峰不是礦物油，需要減去[18]。本文采用 Lab solution 軟件進行數據處理，最終結果運用Excel 表格進行計算。本文所用色譜圖均直接應用Lab solution 軟件復制原圖。

2 結果與分析

2.1 樣品制備

2.1.1 稱樣量 本文參考歐盟的分析要求與限量規定建立方法。2019 年，JRC 給出食品中礦物油的分析方法指導，對于脂肪含量>4%的LOQ 不能超過1 mg/kg[19]。2022 年，歐盟SCoPAFF 要求脂肪含量大于4%食品的礦物油限量為1 mg/kg[5]。因此，奶粉中的MOSH 和MOAH 的分析方法LOQ 不能超過1 mg/kg。

礦物油分析方法的LOQ 與樣品稱樣量密切相關。根據文獻經驗，至少50～100 ng 礦物油注入FID才能滿足分析不確定度要求[16]。由此計算，稱量5.0 g 奶粉樣品，經過提取、凈化、濃縮至1 mL 試液，其中100 μL 注入HPLC-GC 分析，即相當于0.5 g樣品中的目標物進入儀器，則該分析方法LOQ 為0.2 mg/kg。考察到礦物油的鼓包峰是通過積分計算鼓包峰與基線之間的空白面積得到，樣品前處理，如提取、凈化、濃縮等操作步驟均會引起基線波動，因此將方法的LOQ 定為0.5 mg/kg 相對穩妥。

2.1.2 皂化反應 通常，奶粉中含有20%～30%的油脂。油脂是礦物油的共提取物，如果不去除，會影響分析靈敏度，是由于HPLC 柱的規格限制油脂不能超過20 mg。以油脂為例，其直接進樣的LOQ 只能達到10 mg/kg[18]。為了降低定量限，必須事先除去油脂，從而允許高濃度礦物油試液進入儀器測定。

皂化反應能夠增大礦物油與甘油三酯的極性差異，從而達到分離、去除油脂的目的。皂化反應需要考慮甘油三酯（底物）與氫氧化鉀溶液的濃度、溶劑體系、反應溫度和反應時間等條件。“2.1.1”部分已經確定奶粉的稱樣量為5.0 g，為了反應徹底，首先需要將奶粉均勻分散。借鑒本實驗室先前方法[17]，加入約10 mL 熱水（35～50 ℃），充分攪拌后再加入氫氧化鉀水溶液皂化。礦物油涉及低沸點物質，為了避免揮發損失，JRC 建議皂化條件為60 ℃下反應30 min[3]。因此，本文僅需要考察皂化反應的強堿濃度及其所處的溶劑體系。

隨機選取一種購買的嬰幼兒配方奶粉（產品標簽標明脂肪含量為26.5%），通過測定皂化反應后脂肪的相對殘留率，綜合考察了氫氧化鉀溶液濃度與乙醇添加量對皂化反應的影響（表1）。結果表明：當反應體系中氫氧化鉀量達到 6 g（即溶液中氫氧化鉀達到3 mol/L）以上時，甘油三酯完全分解[21]。甘油三酯與強堿的摩爾比為1:3 時皂化反應完全，根據5.0 g 奶粉可以粗略估算出油脂含量，即甘油三酯的質量為1～1.5 g，繼而可以確定氫氧化鉀的濃度。為了反應完全，實際操作中堿的添加量通常都是過量的。

表1 氫氧化鉀和乙醇的不同添加量對皂化反應的影響Table 1 Effect of the different addition amount of potassium hydroxide and ethanol on saponification results

乙醇添加量對皂化反應效率影響很大，實驗結果（表1）表明，當加入15 mL 乙醇，即反應體系中乙醇和水的體積相當（≈15 mL）時，皂化反應不完全；當乙醇的體積為20 mL 時，皂化效率明顯提高，但殘留脂肪率為0.6%～13.1%，重復性較差，皂化反應穩定性較差。此時，增加氫氧化鉀的量，即從3 g 增加到6 g 時，殘留脂肪率為0.6%～0.8%，皂化反應重復性和穩定性好。甘油三酯與濃堿水溶液不能互溶，需要加入一定量的乙醇作為溶劑并不斷振蕩，以加快皂化反應。因此，確定皂化條件為5.0 g 奶粉以10 mL 溫水溶解，然后加入濃度為0.6 g/mL 的氫氧化鉀水溶液10 mL 和乙醇20 mL，搖勻后于60 ℃下皂化反應30 min。皂化反應是否完全，可以通過觀察正己烷相上方的脂肪層，如果存在脂肪層，則繼續反應至其消失。

2.1.3 提取次數 一次提取往往不能保證回收率，本文將奶粉樣品加入MOSH/MOAH 混合標準溶液經皂化反應（1.2.1），考察正己烷提取次數對MOSH/MOAH 混合標準溶液回收率的影響，其中第1 次用15 mL 正己烷提取，第2 次則另外添加10 mL 正己烷。由表2 可知，合并兩次提取液測得的MOSH 和MOAH 的含量反而降低；對比兩次提取液中MOSH/MOAH 混合標準溶液中的單體內標物質的比例（3 種MOSH 內標物質與n-C13的濃度比值，4 種MOAH 內標物質與TBB 的濃度比值），發現MOSH部分一次即可提取完全，而MOAH 部分則需要經過兩次提取，其回收率才能達到0.97 以上，考慮到定量內標（Cycy 和MN）的回收率對分析結果的影響很大，本文的正己烷提取步驟確定為兩次。

表2 正己烷提取次數的考察Table 2 Influence of extraction times of hexane on the determination of mineral oil hydrocarbons

同時，表2 的提取次數考察結果也說明，具有兩個苯環的1-MN 和2-MN 在皂化反應和正己烷提取步驟中存在一定損失。為了盡可能降低定量結果的差異，采用TBB 作為定量內標。

2.1.4 硅膠凈化 實際操作中發現奶粉的皂化-提取液經過濃縮后，其中極性物質（如堿液、溶劑雜質等）也相應得到富集，影響后續的環氧化反應，因此需要對濃縮液進行凈化。根據濃縮液的體積（一般為2～3 mL），乙醇-水（1:1，v/v）的添加量為5 mL。此外，很多實驗室建議再增加一步硅膠凈化步驟，如德國脂肪學會（DGF）最新修訂的油脂標準[22]。因此，本方法也將洗滌后的試液以硅膠凈化。由于油脂已經通過皂化去除，因而凈化柱中的硅膠量參照歐盟標準[15]成比例降低，3 g 硅膠即可以達到凈化目的。

2.1.5 環氧化反應 為了保證營養均衡，奶粉，特別是嬰幼兒配方奶粉中常常添加葵花籽油、玉米油、棕櫚油等植物油脂[24]。然而，這些物油脂中的角鯊烯、胡蘿卜素和甾烯等會干擾MOAH，其原因是這些烯烴的極性與MOAH 相近，與MOAH 產生共流出，干擾譜峰而影響測定[25]。

Biedermann 等[25]提出去除烯烴的方法，即采用間氯過氧苯甲酸（m-CPBA）將烯烴進行環氧化反應生成環氧物，增加烯烴的極性，延長其在液相色譜的洗脫時間，使其在MOAH 之后流出，從而達到分離、去除烯烴的目的。Nestola 等[26]對該方法進行了改進，將反應體系的溶劑從二氯甲烷換為乙醇，延緩了反應速率，使反應溫度從冰浴升至室溫，并且避免了溶劑轉換，簡化了反應步驟，此優化方法得到了Biedermann 等[26]的肯定。本文采用改進后的環氧化方法，去除奶粉中MOAH 的干擾物凈化。

2.2 方法學考察

2.2.1 定量限 奶粉中礦物油的測定步驟包括皂化、提取、濃縮、洗滌、凈化、環氧化等樣品前處理步驟，然后注入HPLC-GC 同時測定MOSH 和MOAH的含量。通常需要考察新建檢測方法的線性范圍，然而，礦物油檢測往往無需考慮這一點，原因是HPLC-GC 配備的檢測器FID 范圍非常寬，而HPLCGC 接口的限制，使得前面HPLC 分離流出的MOSH和MOAH 含量有限，遠遠達不到FID 的檢測上限。因此，標準方法[18,27-28]均沒有涉及線性范圍，即只需考慮方法的下限（LOQ）即可。

無論是MOSH 還是MOAH 均為包含數以萬計不同結構類型的混合物，GC 無法將它們分為單個化合物，因此，礦物油的譜圖呈鼓包峰形狀（圖1）。然而，鼓包峰的靈敏度低[16]。為了滿足分析不確定度要求，鼓包峰必須與基線拉開距離，形成足夠高度，從而保證準確積分。目前LOQ 計算方法通常以進入GC 的礦物油質量須達到50～100 ng 計算[16]。本方法將5.0 g 奶粉樣品中礦物油制備成近1 mL 試液，取其中的100 μL 分析，相當于HPLC-GC 測定0.5 g奶粉樣品。因此，以100 ng 計算得到的定量限即為0.2 mg/kg。為了考察基線波動對鼓包峰的影響，本文分別測定了空白試驗對應的MOSH 和MOAH含量，其數值分別低于0.12 和0.05 mg/kg，空白值應該小于LOQ 值得1/3[22]。

圖1 DRRR 組織國際能力驗證的奶粉樣品（RVEP 2000612）中MOSH 和MOAH 的HPLC-GC 譜圖Fig.1 HPLC-GC Chromatograms of MOSH and MOAH in the milk powder sample (RVEP 200612) from DRRR Proficiency Testing

本文綜合考慮了礦物油多個前處理步驟造成的基線波動，不同碳數范圍帶來的鼓包峰高度差異，以及不同實驗室的操作差異，確定方法的LOQ 值為0.5 mg/kg。

2.2.2 回收率和重復性 本文選取了兩個市售奶粉，按照1.2.6 方法制備加標樣品進行加標回收率實驗。其中MOSH 部分添加了0.50～14.99 mg/kg 范圍的多個水平，MOAH 部分則添加了0.58～2.22 mg/kg范圍的4 個水平。結果表明，MOSH 的加標回收率達到81.1%～112.0%（RSD=0.3%～3.0%），MOAH的回收率為83.3%～93.1%（RSD=1.7%～3.8%），即方法學的各項指標均符合JRC 要求[19]（表3）。

表3 加標回收率考察結果（n=6）Table 3 Recoveries of spiked samples (n=6)

2.3 方法驗證

為了進一步驗證方法的準確性，本文測定了DRRR 組織國際能力驗證的奶粉樣品（RVEP 2000 612），結果見圖1 和表4。此次驗證樣品的MOSH和MOAH 在C35～C50范圍的含量極低（圖1），因此主要考察C16～C25和C25～C35的MOSH 和MOAH 的含量及其z'比分數。其中z'比分數是用來衡量實驗室測定值與參考值的偏離程度，如果z'比分數的絕對值低于2，則認為結果滿意，通過驗證[29-30]。

表4 DRRR 組織國際能力驗證的奶粉樣品（RVEP 200612）的MOSH 和MOAH（不同碳段）分析結果Table 4 Determination results of MOSH and MOAH (C-fraction) in the milk powder sample (RVEP 200612) from DRRR proficiency testing

本文分別采用文獻的混合溶劑法[20]和本文所建方法進行了平行測試，均通過能力驗證，證明這兩種方法都能用于奶粉中低含量礦物油的測定。不過，相比混合溶劑法，盡管本方法的稱樣量增加至5 g（混合溶劑法的取樣量只有2 g），但使用的溶劑量卻較少（溶劑提取法約100 mL，本文所建方法約60 mL），說明本方法的靈敏度更高。

3 結論

本文建立了奶粉中MOSH 和MOAH 的高靈敏度分析方法，該方法的取樣量為5.0 g，以溫水分散后，依次通過皂化反應除去油脂，以正己烷萃取皂化液中的礦物油，進行洗滌和凈化后，接著采用環氧化反應除去樣品基質中的天然烯烴，最后注入HPLCGC 測定。該方法的靈敏度高，LOQ 達到0.5 mg/kg，回收率為81.1%～112.0%，應用該方法進行能力驗證，其測定結果的z'比分數的絕對值小于2，滿足歐盟最新的分析要求和限量規定。因此，本文建立的方法可以用于日常檢測，也可以作為制定相關標準的參考方法。