氨基酸含量結(jié)合多元統(tǒng)計分析對蜂蜜品種的判別

問亞琴，張金振，羅 帥

（1.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京 100176；2.資源昆蟲高效養(yǎng)殖與利用全國重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜，結(jié)合自身分泌物并在蜂巢經(jīng)過釀造而成的天然甜味物質(zhì)。蜂蜜含有多種活性物質(zhì)，如氨基酸、酶、多酚類物質(zhì)和礦物質(zhì)[1-2]。按照蜜蜂所采集的蜜源植物種類進行劃分，蜂蜜可以分為單花蜜（主要蜜源是單一植物）、雜花蜜或者百花蜜（采自多種植物）[3]。由于單花蜜香味純正，因此價格會高于百花蜜，例如我國消費者喜歡味道淡的蜂蜜，因此淺色蜜如洋槐蜜和椴樹蜜價格比較高。在利益的驅(qū)動下，市場上存在蜂蜜品種摻假，蜂蜜品種標(biāo)識混淆等問題。由于蜂蜜獨特的化學(xué)特性，不同品種蜂蜜的主要成分含量差別很小，傳統(tǒng)的方法難以鑒別蜂蜜品種[4-5]。因此蜂蜜品種鑒別是蜂產(chǎn)業(yè)急需解決的重要問題之一，也是近年來研究的熱點。多種檢測技術(shù)已被應(yīng)用于蜂蜜品種的鑒別，例如色譜技術(shù)（高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)）、光譜技術(shù)（包括近紅外光譜、中紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜）[6]，以及核磁共振技術(shù)等[7-8]。這些方法有各自的特點及缺陷，目前尚未有一種檢測技術(shù)能夠有效地鑒別不同品種的蜂蜜。

蜂蜜中氨基酸總量約占1%（W/W），含有超過26 種氨基酸[9]。蜂蜜中氨基酸的來源主要有兩個途徑：蜜蜂或者蜜源植物，花粉是植物來源氨基酸的唯一途徑[10]。不同植物花粉粒不同，因此花粉氨基酸可以作為蜂蜜植物源鑒別指標(biāo)，氨基酸也可作為蜂蜜摻假鑒別指標(biāo)[11-12]。目前關(guān)于蜂蜜中氨基酸和蜂蜜品種鑒別的研究已經(jīng)很多。Hermosín 等[9]根據(jù)31 種西班牙蜂蜜中脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、組氨酸和纈氨酸含量，利用PCA 法可以很好的區(qū)分薰衣草蜂蜜和其它蜂蜜。Iglesias 等[13]利用PCA 和連續(xù)判別分析結(jié)果表明，氨基酸濃度尤其是谷氨酸和色氨酸可以區(qū)分蜂蜜和甘露蜜。Rebane 等[14]分析了愛沙尼亞61 種蜂蜜中游離氨基酸含量，脯氨酸和苯丙氨酸是主要的氨基酸。基于氨基酸組成PCA 分析可以區(qū)分石南蜂蜜和其它蜂蜜。Kecke?等[15]分析了塞爾維亞192 個蜂蜜樣品中17 種氨基酸的含量，結(jié)果表明線性判別分析可以對不同植物源蜂蜜進行區(qū)分。Chen 等[16]對我國4 種不同植物源（椴樹蜜、洋槐蜜、荊條蜜和油菜蜜）87 個蜂蜜樣品18 種游離氨基酸進行分析，利用化學(xué)計量學(xué)手段可以進行區(qū)分。鐘舒潔等[11]分析了鵝掌柴蜂蜜和摻假蜂蜜氨基酸組成，通過貝葉斯判別的方法，建立鵝掌柴蜂蜜中摻假量與氨基酸總量的模型。這些前期的研究表明不同蜂蜜品種氨基酸含量不同，也暗示了利用氨基酸結(jié)合化學(xué)計量學(xué)進行蜂蜜植物源鑒別的可行性[17-19]。

氨基酸分析儀檢測不同品種蜂蜜氨基酸組成，具有操作簡單、適用性強等特點[20]。本研究以來源于我國7 個產(chǎn)區(qū)的3 種不同植物源110 個蜂蜜為實驗樣本，通過酸水解氨基酸自動分析儀對其中的17 種水解氨基酸進行了定性定量分析，主要目的是分析我國不同植物源單花蜜油菜蜜、椴樹蜜、洋槐蜜中水解氨基酸含量范圍，并基于此利用化學(xué)計量學(xué)方法進行建模分析，篩選潛在的氨基酸作為品種鑒別標(biāo)志物。另外，氨基酸也是人類基本營養(yǎng)素之一，氨基酸不僅可以作為植物源鑒別指標(biāo)，同時可以作為蜂蜜營養(yǎng)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單花蜜 共3 種，均采自我國7 個不同省市，覆蓋各單花蜜主產(chǎn)區(qū)。其中洋槐蜜37 個采自陜西省、甘肅省和吉林省。椴樹蜜47 個采自吉林省和黑龍江省。油菜蜜26 個采自江蘇省、湖北省和四川省，蜂蜜樣品均采自2015 年。為了保證樣品的真實性，蜂蜜樣品直接從蜂農(nóng)處采集，通過花粉形態(tài)分析進行蜂蜜植物源確認。蜂蜜樣品保存在4 ℃冰箱；混合氨基酸標(biāo)準溶液2.5 mmol/mL Sigma；鹽酸、檸檬酸鈉的緩沖溶液、茚三酮溶液（39 g 茚三酮溶于979 mL 乙二醇單甲基醚等所有分離用有機溶劑均為國產(chǎn)優(yōu)級純。

日立L-8900 氨基酸自動分析儀 天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；UGC-24C 水浴氮吹儀 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂蜜中水解氨基酸的前處理 準確稱取10.0 g蜂蜜加20 mL 超純水，混勻。取上清，加入4 mL 100%三氯乙酸，混勻，-20℃放置15 min,4℃放置1 h 沉淀蛋白。10000 r/min，4℃,離心15 min,去除上清，準確吸取10 mL 6 mol/L 鹽酸溶解沉淀，收集于20 mL耐壓螺蓋玻璃管，充滿氮氣，立刻蓋緊蓋子，110 ℃水解24 h；冷卻至室溫后，用普通濾紙過濾蛋白水解液，用超純水定容至50 mL。取1 mL 濾液60 ℃氮吹干，然后準確吸取1.0 mL 0.2 mol/L 鹽酸溶液溶解，過0.22 μm 水系濾膜后上機分析。

1.2.2 氨基酸的測定 按照氨基酸分析儀標(biāo)準分離程序，離子交換柱初始溫度37 ℃；反應(yīng)管溫度130 ℃；流動相：檸檬酸緩沖液，流速：0.45 mL/min；茚三酮溶液流速：0.25 mL/min；進樣體積：20 μL；檢測器：雙通道紫外檢測器，570 和440 nm。

1.2.3 氨基酸的定性定量方法 用0.02 mol/L 鹽酸配制成各氨基酸濃度均為5、20、50、100、200 nmol/mL的系列混合氨基酸標(biāo)準工作溶液。該標(biāo)準工作溶液在4 ℃冰箱內(nèi)可保存3 個月。用氨基酸分析儀測定系列混合氨基酸標(biāo)準工作溶液，得到17 種氨基酸的積分峰面積，用峰面積為縱坐標(biāo)，氨基酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)分別建立17 種氨基酸的標(biāo)準工作曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

線性判別分析（LDA）是一種通用的數(shù)據(jù)分類和降維方法。線性判別分析（LDA）采用SPASS 20.0 軟件分析，分類判別方法選擇Wilks’ Lambda，描述統(tǒng)計量選擇Box’M（博克斯）復(fù)選項。PCA 和PLSDA分析在代謝組學(xué)網(wǎng)站進行（http://www.metaboanalyst.ca/），PCA 和PLSDA 分析是在數(shù)據(jù)進行標(biāo)準化處理后進行的。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜中17 種水解氨基酸含量分析

實驗中測定的氨基酸為蛋白水解氨基酸，蜂蜜中的蛋白水解氨基酸一部分來源于蜜源植物的花粉，另外一部分來源于蜜蜂的分泌蛋白（包括酶類物質(zhì)）。洋槐蜜、椴樹蜜和油菜蜜中共檢測出16 種氨基酸，其中半胱氨酸（Cys）均沒有檢測到，由于半胱氨酸在酸水解過程中會發(fā)生降解，這與其他水解氨基酸測定結(jié)果一致[21-22]。檢測到的氨基酸中包括了8 種必需氨基酸中的賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸。

天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸和亮氨酸是洋槐蜜和椴樹蜜中含量較高的氨基酸，在油菜蜜中賴氨酸含量也相對較高。這與花粉中氨基酸組成相似，Yang等[23]的研究結(jié)果表明谷氨酸和天冬氨酸是花粉蛋白的主要成分。這說明蜂蜜中水解氨基酸主要來源于花粉。油菜蜜16 種氨基酸總量為607.78 μg/g，高于洋槐蜜和椴樹蜜，這可能與油菜蜜花粉含量相對較高有關(guān)[24]。酪氨酸和天冬氨酸油菜蜜中含量高于洋槐蜜和椴樹蜜，16 種氨基酸含量在三個蜂蜜品種間存在差異（表1）。

表1 不同品種蜂蜜氨基酸含量范圍（mg/kg）Table 1 Amino acids content of different monofloral honey (mg/kg)

2.2 蜂蜜品種判別分析

2.2.1 PCA 分析 PCA 是統(tǒng)計分析中常用的無監(jiān)督判別分析方式。首先應(yīng)用主成分分析進行聚類分析，觀察應(yīng)用氨基酸進行3 種蜂蜜辨別的可行性。由于蛋氨酸在水解過程中會有降解，所以在后面的多元統(tǒng)計分析過程中，均去除掉蛋氨酸。圖1 顯示了PCA的主成分分析結(jié)果圖，從圖中可以看出，3 種蜂蜜有比較明顯的聚集趨勢，尤其是油菜蜜與其他兩種蜂蜜有較明顯的區(qū)分，洋槐蜜和椴樹蜜部分有交叉。主成分1 和主成分2 累計貢獻率為46.4%，低于其他研究者基于游離氨基酸進行蜂蜜品種鑒別的判別率[25]，這可能是因為水解氨基酸中有一部分來源于蜜蜂分泌蛋白的水解；另一部分來源于花粉水解，洋槐蜜和椴樹蜜花粉率含量較低有關(guān)[26]，這些因素都會影響3 種蜂蜜中水解氨基酸組成與含量，也會影響PCA分類結(jié)果。

圖1 三個蜂蜜品種PCA 得分散點圖Fig.1 Principal component analysis (PCA) scores plot of three unifloral honeys.

2.2.2 PLS-DA 判別分析 PLS-DA 是建立在偏最小二乘法線性回歸基礎(chǔ)上的一種有監(jiān)督的模式識別方法，為了獲取更加理想的組間分離及增強對分類貢獻大的變量的識別，進一步進行了有監(jiān)督的PLS-DA分析，從圖2A 可以看出椴樹蜜和洋槐蜜有部分重疊，而油菜蜜可以很好地和椴樹蜜和洋槐蜜分開。通過PLSDA 分析后，結(jié)合變量重要性投影值（variable importance projection，VIP）及P<0.05 可以篩選出潛在的花蜜標(biāo)志物。圖2B 和圖2C 顯示了成分1 和成分2 的VIP 得分圖，從圖中可以看出成分1 中纈氨酸（Val）,賴氨酸（Lys）,酪氨酸（Tyr）,甘氨酸（Gly）貢獻率較大，成分2 中亮氨酸（Leu）貢獻率較大。結(jié)合表1蜂蜜中氨基酸含量結(jié)果，可以得出油菜蜜中纈氨酸（Val）含量較低，賴氨酸（Lys）,酪氨酸（Tyr）和甘氨酸（Gly）含量相對較高使得可以和椴樹蜜和洋槐蜜區(qū)分開。

圖2 三個蜂蜜品種PLS-DA 判別分析結(jié)果Fig.2 Botanical differentiation of the three unifloral honeys based on PLS-DA

2.2.3 LDA 線性判別分析 線性判別分析（LDA）是一種有監(jiān)督的模式識別方法。按照類內(nèi)方差盡量小、類間方差盡量大的準則求得判別函數(shù)，然后利用建立的判別函數(shù)對待判樣本進行分類。LDA 判別分析在蜂蜜品種鑒別中得到廣泛應(yīng)用[27]。在進行LDA 的分析過程中，先隨機選定一部分樣本（原始組）進行建模區(qū)分洋槐蜜、椴樹蜜和油菜蜜，再對剩余的樣本（交叉驗證組）進行品種判別驗證。以16 種氨基酸為因變量，3 個蜂蜜品種為自變量構(gòu)建模型，得到2 個典型判別函數(shù)。由威爾克Lambda 檢驗兩個判別函數(shù)，結(jié)果表明，判別函數(shù)1（Wilks’ Lambda=0.020，χ2（卡方）=392.042，df（自由度）=30，P=0.000<0.01））；判別函數(shù)2（Wilks’ Lambda=0.338，χ2=108.364,df=14，P=0.000<0.01），函數(shù)1 和函數(shù)2 的顯著性水平均小于0.01，表明判別函數(shù)1 和2 具有顯著差異（P<0.01）。博克斯檢驗是對各組協(xié)方差是否相等進行檢驗，檢驗結(jié)果為博克斯M=1128.335，F(xiàn)=3.675,P=0.000<0.01，認為各組整體方差不相等，可以使用變量建立判別函數(shù)。

前2 個典型判別函數(shù)累計貢獻率占所有變量百分比為100%，典型判別函數(shù)1 特征值為16.061，貢獻率為89.1%；典型判別函數(shù)2 特征值為1.955，貢獻率為10.9%。從三個品種混合判別分析圖可以看出，三個不同品種的蜂蜜大體落在三個區(qū)域內(nèi)，椴樹蜜和洋槐蜜與油菜蜜可以進行很好的區(qū)分（圖3）。原始分類正確率為96.4%，交叉驗證分類正確率為92.7%（表2），其中椴樹蜜正確分類為93.6%，油菜蜜為92.3%，洋槐蜜為91.9%。分類結(jié)果和其他研究一致，蜂蜜中氨基酸可以蜂蜜植物源鑒別指標(biāo)[28-29]。

表2 三個蜂蜜品種LDA 判別分類結(jié)果Table 2 Discriminant result of three unifloral honeys based on LDA

圖3 三個蜂蜜品種LDA 判別分類圖Fig.3 Botanical differentiation of three unifloral honeys based LDA

3 結(jié)論

本文采用氨基酸分析儀測定了油菜蜜、椴樹蜜和洋槐蜜的氨基酸組成，3 種蜂蜜水解氨基酸含量存在差異，通過PCA、PLSDA 和LDA 等多種化學(xué)計量學(xué)方法進行蜂蜜品種鑒別研究，LDA 判別模型可以很好區(qū)分油菜蜜、洋槐蜜和椴樹蜜，為蜂蜜品種鑒別提供依據(jù)。蜜源植物來源廣泛,為蜂蜜品種鑒別帶來一定的困難,未來可以多種成分綜合進行品種鑒別，能取得更好的結(jié)果。