鮮核桃致病菌分離鑒定及二氧化氯對其抑制效應研究

孟文彥，萬楊卓群，張東莉，劉方玥，馬惠玲

（西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100）

核桃又名萬歲果，羌桃，是胡桃科胡桃屬的植物（Juglansspp.）。核桃脂肪組分中約90%為不飽和脂肪酸，對增強大腦的思維能力和記憶力、降低心腦血管疾病發病率具有重要作用[1]，并且核桃中富含蛋白質、視黃素、生育酚、維生素B6 等豐富的營養成分，十分有利于人體健康[2]。‘清香’核桃個體大、果殼薄、取仁容易、耐貯藏，是我國中晚熟核桃品種中的佼佼者，深受廣大消費者的喜愛[3]。隨著核桃產品的多元化，每年8～10 月以青皮核桃、脫皮鮮核桃等形式銷售的產品在西北和西南地區市場中隨處可見[4]。然而，鮮核桃貯存期易發生霉變，貨架壽命短，25 ℃以上只有2～3 d[5-6]，難以適應較長貨架期或遠距離的銷售，降低其市場競爭力。因此，研發高效的鮮核桃流通或貨架期保鮮技術具有十分重要的生產實踐意義。

二氧化氯（Chlorine dioxide，ClO2）因其強的殺菌能力且不影響食品風味等優點，廣泛應用于果蔬保鮮、畜禽制品、水產品、乳制品、啤酒和飲料等食品行業殺菌保鮮方面[7]，被世界衛生組織（WHO）定為A1 級高效安全消毒劑[8]。ClO2可阻斷蛋氨酸向乙烯的轉化，且能氧化分解已合成的乙烯，延緩果蔬衰老和腐敗，起到良好的保鮮作用；低濃度的ClO2殺菌機理與抑制病毒、細菌、霉菌中蛋白質的合成有關，高濃度ClO2則通過軟化和破壞病原菌細胞壁或病毒包膜而殺菌[9]。目前，ClO2在核桃貯藏保鮮中的作用逐漸得到關注，ClO2處理后的青皮核桃在貯藏期腐爛率和褐變指數均顯著下降，延緩了核桃果實的褐變[10]。低濃度ClO2浸果后結合真空包裝抑制了鮮核桃仁腐爛，降低呼吸強度，有效保持貯藏期核桃仁的品質[11]。ClO2熏蒸結合氣調包裝也延長了脫皮鮮核桃的低溫保鮮期[4]。然而，前人研究也發現高濃度（80 mg/L）的ClO2處理在抑制和殺滅核桃仁表面的微生物的同時，可能激發鮮核桃自身的生理性劣變[12]，因此果實對不同濃度的ClO2承受能力差異較大，這也是困擾保鮮行業的一個難題[13]。并且ClO2對鮮核桃室溫下（25 ℃左右）保鮮效果鮮有報道，對鮮核桃病原菌的鑒定及ClO2對其單獨的抑制效應也少有研究。

核桃青皮提取液（GE）是近年來興起的一種抑菌劑，前人對GE 的研究進行了大量報道[14]，包括對其活性物質及含量的測定[15]，在果蔬保鮮方面的應用。但少有應用于鮮核桃保鮮的文獻，本研究依據科赫法則[16]分離了鮮核桃表面致病菌，通過形態學和分子生物學方法對各菌株進行分類與鑒定。采用離體和活體抑菌試驗篩選和驗證了ClO2對各菌的抑制效應，并比較它與GE 疊加處理的效應。研究旨在揭示ClO2在鮮核桃霉變控制中的作用特點和適宜劑量，為開發新型無公害鮮核桃防腐保鮮劑提供理論與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘清香’核桃（Juglans regiacv.Qingxiang）2021年8 月28 日（約雌花盛開后125～130 d）采摘于陜西省周至縣專一‘清香’核桃園；二氧化氯（ClO2）緩釋劑有效成分含量5%，粉劑（500 g/包裝），訂制于山東臨朐華威生物科技有限公司；P3 保鮮袋 改良透氣性的PE 袋（單層厚20 μm，25 cm×20 cm），西安海宏包裝有限公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、碳酸鈉、蒽酮、葡萄糖和次氯酸鈉 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇 分析純，科隆化學品有限公司；Luria-Bertani（LB）培養基 北京陸橋技術有限責任公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）奧博星生物技術有限公司；Triton X-100 分析純，登峰化學試劑廠；硫酸 分析純，西隴科學有限公司；酵母基因組DNA 提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；凝膠回收試劑盒 奧科生物科技有限公司。

DH4000 電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；QYC-2102C 恒溫振蕩培養箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司；SX-700 高壓滅菌鍋 TOMY KOGYO CO.,LTD；SW350T 光學顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司；CR-400 色差儀 柯尼卡美能達（中國）投資有限公司[Konica Minolta（China）Investment Ltd]；ABI3730-XL 測序儀 北京北嘉美儀生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ‘清香’核桃處理 青皮核桃表皮無明顯的病蟲斑和機械損傷，部分有輕度裂紋，但未開裂。采回的青皮核桃在室溫下放置12 h 以散去田間熱，置于5±0.5 ℃冷庫保存備用。每批試驗用果時，對青皮核桃手工剝去青皮、自來水洗刷至表面潔凈，并用去離子水沖洗3 次，室溫吹晾1～2 h 至表面濕氣揮發，得到新鮮脫青皮的（濕）鮮堅果，即鮮核桃，用作本研究材料。

1.2.2 青皮提取液（GE）的獲取 采用索氏提取器法提取。將10 g 鮮青皮切成邊長為0.2～0.3 cm 小塊，包入濾紙，投入索氏提取器，加100 mL 75%乙醇，85 ℃提取4 h 后，用三層紗布過濾得到濾液，之后使用旋轉薄膜蒸發儀蒸干圓底燒瓶乙醇（至1 mL 以下漿狀物），用去離子水洗入100 mL 容量瓶中，定容得到100 mg/mL 的GE，當天制備當天用。

1.2.3 致病菌分離鑒定

1.2.3.1 真菌的分離 將鮮核桃堆積于30 ℃下，彩條無紡布覆蓋，保濕至相對濕度（RH）≥90%。存放10 d 以上，待核桃發生嚴重霉變，挑選其中帶有典型不同顏色霉菌病癥的核桃，用接種針分別挑取各種霉菌菌塊，劃線法涂抹在PDA 培養基（?=90 mm）進行初步分離。28 ℃培養3 d 后，挑取同一培養皿內不同形狀與色澤的菌落分別接入新的培養基繼續培養，重復3～4 次，直到每個培養皿只長出單一菌落，并連續兩次不再分離后作為純化菌株保存，留待測定。

1.2.3.2 細菌的分離 將鮮核桃堆積于25 ℃下，同1.2.3.1 中的操作進行保濕覆蓋。待核桃表面呈現典型細菌滋生癥狀，即表面黏濕，局部顏色發黃時（約6～7 d），并呈現肉眼可見霉變癥狀時選取果殼上帶霉菌的堅果3 個，分別放入100 mL 無菌水中浸泡，搖動5 min，使核桃表面的微生物脫離，制備菌懸液。吸取100 μL 菌懸液均勻涂抹到細菌培養基（LB）上，37 ℃培養2 d 后，按照上述真菌操作方法分離純化培養直至得到單一菌株。

1.2.3.3 霉菌的回接 挑選12 個表面清潔、完整健康、大小整齊的新鮮核桃，并用蒸餾水沖洗3 次，備用。從上述純化的兩種霉菌菌落各挑取一個接種環左右面積的菌塊涂抹至鮮核桃表面，每個核桃沿縱向左側中部接種，之后將未接種一側朝下，用滅菌衛生棉墊置廣口組培瓶內，以使堅果位置固定，防止霉菌孢子的任意沾涂。每瓶擺放一個核桃，每種菌接種4 個核桃，4 個不接種作對照，蓋蓋，置于28 ℃培養箱中進行培養，每天觀察，7 d 時堅果感菌癥狀明顯，取出觀察、拍照。

1.2.3.4 細菌的回接 用上述霉菌相同的方法獲取12 個清潔完好的鮮核桃，每4 個堅果接種同一細菌菌株，4 個不接種作對照。同上置于培養瓶內，37 ℃培養3 d，每個核桃投入盛有100 mL 無菌水的燒杯中浸泡并輕微搖晃5 min，使核桃表面細菌脫離，制備菌懸液。按照GB4789.2-2022 方法測定每個核桃表面微生物數量[17]。

1.2.4 病原菌的分子鑒定 以上分離純化得到的4 種致病菌，每種挑選生長旺盛的平板3 個，送楊凌天潤奧柯生物科技有限公司進行菌種鑒定。霉菌鑒定方法為：采用酵母基因組DNA 提取試劑盒提取真菌基因組DNA，再以內轉錄間隔區ITS1/ITS4 引物（表1）擴增（PCR）18S rRNA 基因。PCR 體系組成：DNA 模板（50 ng/μL）1.0 μL，高保真DNA 聚合酶（2*Taq Master Mix）25.0 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，超純水22.0 μL。反應流程為：98 ℃預變性30 s→98 ℃變性10 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，循環30 次→72 ℃延伸5 min。PCR 產物使用奧科生物凝膠回收試劑盒回收；細菌則采用酚-氯仿法[18]提取基因組DNA，再以27F 和1492R通用引物擴增16S rRNA 基因。其PCR 體系組成為：基因組DNA（20 ng/μL）1.0 μL，高保真DNA 聚合酶（2X M5 HiPer plus Taq HiFi）15.0 μL，27F（10 μmol/L）、1492R（10 μmol/L）各1 μL，超純水12.0 μL。同真菌操作流程獲得和回收PCR 產物。

表1 引物名稱及序列表Table 1 Primer name and sequence table

各菌株PCR 產物分別經ABI3730-XL 測序儀采取Sanger 技術測序，進行NCBI Blast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比對，相似率最高的種或屬即為待測菌的鑒定結果。

1.2.5.1 ClO2緩釋熏蒸劑對4 種致病菌作用的量效關系及半抑制濃度（IC50）測定 分別準備好霉菌的PDA 固體培養基和細菌的LB 固體培養基，根據培養基的體積，按照2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40 mg/L 的ClO2固體緩釋熏蒸劑梯度劑量，將ClO2置入培養皿中央去除培養基的直徑10 mm孔槽中，在孔槽之外均勻加入100 μL 菌懸液，涂布均勻后，霉菌在28 ℃下培養3 d，細菌在37 ℃下培養2 d，每種菌每個劑量ClO2重復進行3 次。以無藥劑處理為對照，觀測各皿中抑菌圈大小，換算為抑菌率（%）[19]。使用Igor Pro 軟設置件分析數據，選取量效關系曲線模式，在指定抑菌率為0%～100%之間進行曲線擬合，并計算ClO2對4 種致病菌的半抑制濃度（IC50）的平均值及標準差[20]。

1.2.5.2 孢子萌發率和菌絲平均生長速率測定 用移液槍從28 ℃自然生長的霉菌PDA 平板上刮取適量孢子于無菌水中，多次吸打將孢子打散，充分搖勻，配制孢子懸浮液（107CFU/mL）。試驗組于2 mL 離心管中加入含兩種霉菌IC50濃度ClO2的900 μL PDA 液體培養基，然后加入100 μL 孢子懸浮液，于28 ℃，200 r/min 的恒溫振蕩培養箱中培養，分別于1、2、3、4、5 和6 d 時吸取培養液，顯微鏡下測定孢子萌發率[21]。每個處理至少觀察100 個孢子，重復3 次。

1.2.5 離體抑菌實驗

接種直徑10 mm 的菌絲塊于培養基中央，置于28 ℃培養箱中黑暗培養9 d。十字交叉法測定菌絲生長量，并計算菌絲生長速率[22]。

1.2.6 鮮核桃貨架期保鮮試驗

1.2.6.1 鮮核桃處理與包裝 根據上述試驗選取的ClO2劑量，按照每袋鮮核桃包裝量（20 個，約0.37 kg），準備ClO2熏蒸藥袋（0.48 g ClO2粉劑封入7 cm×5 cm無紡布袋）。以預試驗中選取P3 保鮮袋（材料部分所述）為保濕包裝，進行ClO2處理下鮮核桃貨架期的霉變控制試驗。設3 個處理：核桃青皮提取液（GE）處理（陽性對照），100 mg/mL GE 噴灑至核桃各個面濕潤，晾干后密封；40 mg/kg ClO2熏蒸，20 個鮮核桃與ClO2藥袋一起裝入P3 袋，密封；復合處理，GE 噴灑并ClO2熏蒸。對照：潔凈鮮核桃直接裝入P3 袋密封。各處理均準備36 小袋，12 袋隨機擺放于25 ℃貨架，24 袋置于5 ℃貨架。

1.2.6.2 抑霉效應 保存于25 ℃貨架的核桃于0、6、12 d，5 ℃貨架的于0、6、12、24、48 d 從各組隨機抽取3 袋樣品，觀測鮮核桃表面霉變情況。每袋隨機抽取3 個堅果，分別投入盛有100 mL 無菌水的燒杯，浸泡輕微搖晃5 min，使核桃表面微生物脫離，以制備菌懸液，按照GB4789.2-2022 測定微生物數量[17]。

1.2.6.3 品質評價 對25 和5 ℃貨架各次所取的樣品同步觀測鮮核桃感觀品質（仁色、香、脆、味、種衣剝離度），貨架前和取樣點分別對鮮核桃測定以下感觀指標，每重復取4 個核桃，每處理共12 個。色澤：采用色差儀測定兩瓣核桃仁間隔平整處的色澤亮度（L*）；種皮剝離度：由評分小組10 人（均為大三學生，5 男5 女）手工剝取核桃仁的種衣，根據剝取的難易程度進行10～1 分間打分，評分標準如下（表2）；消費者可接受度：參考Wang 等[6]的標準由同上10 人根據種皮感觀色澤、核桃仁脆度和風味進行觀測和品嘗后在10～1 分之間綜合打分，評分標準如下（表3）。

表2 種皮剝離度評分標準Table 2 Seed coat stripping degree scoring criteria

表3 消費者可接受度評分標準Table 3 Consumer acceptability rating criteria

1.3 數據處理

對離體和活體抑菌試驗的數據、核桃保鮮結果觀測值等采用統計分析軟件SPSS22.0 進行正態分布與方差齊性檢驗，之后作單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異法（LSD）進行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 鮮核桃致病菌分離與鑒定

2.1.1 致病真菌分離與感觀驗證 根據科赫法則，病原菌的類型及其致病性須培養分離和回接驗證方可初步確定[16]。經對霉變核桃的真菌分離培養，得到黑色和綠色兩種菌株，其純化菌落特征如圖1，初生菌絲均呈白色，老化至產生孢子期分別變為黑褐色和綠色。兩種霉菌接種核桃均在接種部位產生了明顯的黑霉或青霉癥狀；而右側未接種部位果殼狀態良好，雖然部分堅果的霉變已由左側擴散至右側，左右生霉量差異仍然明顯，且霉變形態與貨架期自然發生的一致，證明了兩種霉菌對鮮核桃具有致病性。

圖1 鮮核桃分離的兩種霉菌及其回接后的致霉效果Fig.1 Two sort of mold isolated from fresh walnut and their mildewing effect after reinfection

2.1.2 致病細菌分離與感觀驗證 對呈現細菌污染狀的核桃進行細菌分離純化同樣得到兩種菌株，其純化菌落分別呈現白色和黃色（圖2A、2B）。白菌表面光滑、濕潤，黃菌略帶粉質、并呈由邊緣向中心逐漸加深的桔黃色。

圖2 鮮核桃分離的白色（A）和黃色（B）細菌Fig.2 Separated white (A) and yellow (B) bacteria from fresh walnut

兩種細菌分別回接核桃后測定發現，接種白菌引起核桃表面滋生白菌數量較對照增加了1 倍以上，差異極顯著（P<0.01），黃菌數量差異不顯著；接種黃菌引起核桃表面滋生黃菌數量較對照增加2.3 倍以上，差異亦達到極顯著水平（P<0.01）。白菌數與對照差異不顯著（表4）?？梢?，對照和接種組核桃的細菌污染均以黃菌和白菌為主，且接種細菌的核桃表面黏濕，顏色發黃，接種黃菌時細菌數量陡增，驗證了黃菌是核桃發粘的主要致病細菌，白菌為次要致病細菌。

表4 細菌回接后鮮核桃表面微生物數量測定（×10 6 CFU/核桃）Table 4 Microbial quantity on the surface of fresh walnut after reinfection with bacteria (×10 6 CFU/walnut)

2.1.3 病原菌鑒定 將所觀察到的病原菌形態與《真菌鑒定手冊》[23]和《常見細菌系統鑒定手冊》[24]等資料進行比對，發現黑霉與曲霉（Aspergillus）屬，綠霉與青霉屬（Penicillium）真菌外觀形態大體相符。

進一步對4 種致病菌進行分子鑒定，如表5 所示，對兩種霉菌的18S rRNA，內部轉錄間隔區1（ITS-1）、5.8S rRNA 和內轉錄間隔區2（ITS-2）基因完整序列，28S rRNA 部分序列比對，得出青霉菌株屬于青霉屬（Penicilliumsp），可信度為100%；黑霉菌株屬于塔賓曲霉（Aspergillus tabinus），可信度也為100%。對白菌16SrRNA 部分序列（1020 bp）比對確定其為按樹假單胞菌（Pseudomonas eucalypticola），可信度為99.85%，對黃菌16SrRNA 的部分序列（1395 bp）比對確定其為黃色微球菌（Micrococcus flavus），可信度為99.85%。即對‘青霉’只鑒定到青霉屬，表觀形態大致相符，黑霉鑒定到了種，兩種細菌則全部鑒定到種。

前人研究提出生鮮水果病變主要是由霉菌引起的[11]。在鮮核桃保鮮領域，已鑒定出了部分品種的個別鮮核桃致病霉菌，其中青霉（Penicillium）是在不同核桃品種具有普遍致病效應的一種霉菌[25]，這與本文中所得結論一致。除此之外，本研究從病變的‘清香’核桃上還分離出另一種致病霉菌—塔賓曲霉（Aspergillus tabinus）、及兩種細菌（黃色微球菌和桉樹假單胞菌），更加詳細確定引起鮮核桃霉變和發粘的病原菌種類，為今后鮮核桃新型保鮮劑的開發提供了新的依據。

2.2 二氧化氯最適抑菌濃度的確定

2.2.1 二氧化氯緩釋熏蒸劑對4 種病原菌作用的量效關系 當ClO2緩釋熏蒸劑量由0 增加至40 mg/L時，4 種病原菌的抑制率均不斷增加，表現出ClO2對4 種致病菌具有廣譜的抑制效應，并且呈現顯著的量效關系（圖3）。在ClO2濃度為16 mg/L 時，對青霉的抑制率已達到100%，顯著高于其它三種菌（P<0.05），但對黃色微球菌的抑制作用不強，僅不到40%。從ClO2濃度0～40 mg/L 全程來看，ClO2對青霉的抑制效應最強，對黃色微球菌的抑制效應最低，對塔賓曲霉和桉樹假單胞菌的抑制效應較為相近，30 mg/L 的ClO2對塔賓曲霉的抑制率達到100%，40 mg/L 的ClO2對兩種細菌的抑制率也達到100%，40 mg/L 的ClO2是作為共同抑制4 種病原菌的最低理論濃度。

圖3 不同濃度二氧化氯緩釋熏蒸劑對4 種病原菌的抑制作用Fig.3 Inhibition rates of different concentrations of chlorine dioxide fumigants on four pathogens

以20、40 mg/L ClO2緩釋熏蒸劑作用為例，圖示其對兩種真菌的抑制效果（圖4）可見，這兩種劑量ClO2對青霉，40 mg/ LClO2對塔賓曲霉的抑制率均達到100%（圖4B、C、F 所示），結果表明，ClO2對不同菌株的抑制能力有所差異，對青霉的抑制作用強于塔賓曲霉。

圖4 ClO2 對青霉（上排）和塔賓曲霉（下排）抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of ClO2 on Penicillium sp (top row) and Aspergillus tubingensis (lower raw)

前人報道適量的ClO2可降低低溫自發氣調貯藏鮮核桃的腐爛指數[4]，本文進一步得出，這種防腐效應實際上是ClO2對青霉、曲霉和細菌共同抑制取得的。

2.2.2 二氧化氯緩釋熏蒸劑對4 種病原菌作用的半抑制濃度（IC50）使用Igor Pro 軟件分析數據，制作抑菌率與劑量對數的模擬曲線圖，如圖5 所示，在抑菌率0～100%之間，ClO2對4 種病菌的抑制率—劑量對數曲線均為典型的S 型。從曲線求得ClO2對4 種病菌的IC50分別為：青霉（A）7.357±0.451 mg/L、塔賓曲霉（B）12.943±0.693 mg/L、黃色微球菌（C）19.606±1.131 mg/L、桉樹假單胞菌（D）13.022±1.131 mg/L。其中，青霉的IC50最低，黃色微球菌的最高，塔賓曲霉和桉樹假單胞菌的IC50相近，說明ClO2緩釋熏蒸劑對青霉的抑制作用最強，對黃色微球菌的抑制作用最弱，對塔賓曲霉和桉樹假單胞菌的抑制效應較為相近，這非常適合ClO2緩釋熏蒸劑應用于鮮核桃貨架期保鮮，因為由肉眼可見，鮮核桃霉變癥狀中青霉霉變癥狀更為嚴重。

圖5 二氧化氯對4 種致病菌的濃度效應曲線及IC50Fig.5 Dose-effect curve and IC50 of chlorine dioxide on four pathogens

2.3 各制劑對孢子萌發和菌絲生長的影響

以ClO2緩釋熏蒸劑對兩種霉菌各自的IC50作為供試濃度，分析ClO2對兩種霉菌孢子萌發的抑制作用。由圖6 可知，在6 d 之前ClO2對青霉和塔賓曲霉的孢子萌發均有顯著的抑制作用，但是隨著時間的推移該效應逐漸減弱。比較兩種霉菌的孢子萌發率可知（圖6A 和圖6B），在2、3 d 時處理組的青霉孢子萌發率分別約為40%、60%，塔賓曲霉的孢子萌發率分別約為60%，80%?？梢奀lO2對青霉的孢子萌發抑制作用強于塔賓曲霉。

圖6 IC50 水平的二氧化氯處理后青霉（A）和塔賓曲霉（B）的孢子萌發率Fig.6 Spore germination rate of Penicillium sp (A) and Aspergillus tubingensis (B) treated with chlorine dioxide at IC50 level

如表6 所示，ClO2極顯著抑制了兩種霉菌菌絲的生長（P<0.01），并且抑制率均大于50%，對青霉的抑制作用較塔賓曲霉更強。前人研究發現ClO2顯著促進了指狀青霉（Penicillium digitatum）的細胞凋亡，抑制了其菌絲體生長[26]，本實驗結果跟該研究趨于一致，Liu 等[26]采用了200～1800 mg/L 的ClO2，對4 種柑橘類果實的青霉病具有顯著抑制作用，其離體抑菌實驗的最低有效濃度為200 mg/L，本實驗為40 mg/L，表明ClO2對核桃霉菌的抑制作用強于柑橘的致病霉菌，更適合用于核桃霉變控制。

表6 不同處理下兩種霉菌菌絲生長速率的變化（mm/d）Table 6 Growth rate of mycelium for two molds under ClO2 treatment (mm/d)

2.4 二氧化氯對貨架期鮮核桃霉變的影響

在25 ℃貨架6 d 和12 d 時，40 mg/L ClO2緩釋熏蒸處理較對照均顯著（P<0.05）減少了鮮核桃表面滋生真菌和細菌的數量（表7），且霉變起始期從對照的6 d 推遲至12 d，且12 d 時處理組的霉菌數量較對照組減少50.1%，細菌數較對照減少98.4%。對比圖5 的離體抑菌試驗的結果，在活體條件下ClO2對細菌的抑菌效果較真菌更強。在5 ℃下，ClO2處理將真菌與細菌的滋生天數由對照的12 d 延遲至24 d 以上，與25 ℃下相同，處理對細菌的抑制率高于真菌。從各組的觀測數量上看，相同貨架時間內，鮮核桃表面滋生的細菌較真菌多，表明活體條件下，細菌較真菌繁殖和生長更快，ClO2這種優先抑制細菌的效應更有利于鮮核桃病原菌的控制。由表7還可見，5 ℃下微生物發展慢于25 ℃，低溫是抑制微生物滋生的最有效措施。國家對生鮮果實的微生物總量沒有具體標準，參考《干果食品衛生標準》規定葡萄干，柿餅等鮮果干燥制成的干果食品不得有霉變[27]的標準，及《食品安全國家標準 糕點、面包》中對糕點、面包中菌落總數應<10000 CFU/g 的規定[28]，ClO2處理鮮核桃5 ℃貨架期24 d 完全符合食品衛生標準，而對照在25 ℃下6 d，5 ℃下12 d 均已出現微生物超標的情況。25 ℃下6 d 和12 d 的觀測均得出，核桃青皮提取液（GE）的復合應用（P3+ClO2+GE）并沒有較單獨使用（P3+ClO2）增進對真菌和細菌的抑制作用。

表7 貨架期鮮核桃微生物數量變化（×104 CFU/g）Table 7 Changes of microbial quantity of fresh walnut during shelf life (×104 CFU/g)

2.5 二氧化氯對貨架期鮮核桃感觀品質的影響

25 ℃貨架6 d 和5 ℃貨架12 d 后剝去核桃殼后可見，各組核桃仁雖然均未出現肉眼可見的病變，然而感觀色澤和新鮮度差別很大。如表8 所示，25 ℃下，隨著貨架時間的延長，核桃仁種衣褐變加劇，L*下降，6 d 時各組核桃仁L*均下降15%以上，兩個處理下降量小于對照，但差異不顯著（P>0.05）。12 d 時兩個處理的L*顯著高于對照（P<0.05）。5 ℃條件下，核桃仁種衣褐變大大延緩。兩個處理進一步減少了種衣L*的下降量。在6～24 d 下降量均低于對照，差異均顯著（P<0.05），48 d 時差距縮小，但是復合處理依然顯著高于對照（P<0.05）。聯系到上文觀測到兩處理顯著的抑菌效果可知，ClO2或ClO2+GE 的復合處理通過抑制鮮核桃表面的微生物滋生，減緩了鮮核桃堅果整體品質劣變，抑制了核桃仁的褐變，以低溫條件下的作用較室溫下更強，復合處理較ClO2單獨處理效果更顯著。

表8 各抑菌劑處理后核桃仁的感官品質Table 8 Sensory quality of walnut kernel treated with various antibacterial agents

種皮剝離度方面，在25 ℃下，隨著保鮮時間延長，核桃仁種皮剝離度大幅下降。6 d 時各組核桃仁種皮剝離度均下降20%以上，6～12 d 兩個處理下降量小于對照，且差異顯著（P<0.05）。5 ℃貨架條件下，核桃仁種皮剝離度下降大大延緩。兩個處理進一步減少了種皮剝離度的下降量。在6～24 d 下降量均低于對照，但差異不顯著。消費者可接受度方面，25 ℃貨架條件下，隨著保鮮時間的加長，消費者可接受度迅速降低，12 d 時對照組的消費者可接受度僅為3.30，表明此時的核桃仁的品質（色、香、味）已低于可接受范圍。6～12 d 兩個處理的消費者可接受度均高于對照，差異顯著（P<0.05）。5 ℃貨架條件下，可延緩消費者可接受度的下降。6～24 d 兩個處理的消費者可接受度仍高于對照，但差異不顯著（P>0.05），48 d 時兩個處理的消費者可接受度顯著高于對照（P<0.05）?？梢?，ClO2增加了貨架期鮮核桃的種皮剝離度，維持了較好感官品質，增大了消費者可接受度。GE 和ClO2復合處理在維持種皮亮度方面相比ClO2單獨處理作用更強。

對25 ℃貨架保鮮的鮮核桃仁進行0～12 d 外觀形態拍攝記錄，如圖7 所示，對照組鮮核桃仁在6 d 時已出現明顯的褐變，嚴重降低了核桃仁的品相和消費者可接受度。而ClO2處理組的核桃仁品相相差較小，出現輕度褐變，核桃仁色澤光亮，品相良好。對照組鮮核桃仁在12 d 時褐變進一步加重，呈深褐色，完全失去消費價值。而ClO2處理組雖然核桃仁表面有一定的褐變程度，但仍具有良好的品相，且表面無明顯霉菌癥狀。

圖7 鮮核桃仁于25 ℃下0、6、12 d 的外觀狀態Fig.7 Appearance of fresh walnut kernel at 25 ℃ for 0 d,6 d and 12 d

前人將含核桃青皮提取液（GE）復合涂膜劑成功用于鮮切蘋果的保鮮[14]，本研究用于鮮核桃病原菌離體抑菌效果卻不明顯（數據未顯示），與ClO2復合使用于鮮核桃表現了部分活體抑菌效應。由于GE 富含各種多酚類物質[29]，可推測GE 的主要效應不在于抑菌，而是抗氧化，從而減輕了貨架期鮮核桃殼及其內部核桃仁品質下降，理論上也是鮮核桃保鮮中富于前景的功能性植物保鮮劑。只是，本文采用粗提液作用并不顯著。通過優化GE 提取的工藝溶劑[30]和提取方法[31]，有望進一步提高GE 的抑菌效果，為GE推廣應用于鮮核桃尋找新的保鮮方法。

3 結論

從病變的核桃上分離純化和鑒定出青霉（Penicilliumsp）、塔賓曲霉（Aspergillus tabinus）、桉樹假單胞菌（Pseudomonas eucalyptus）和黃色微球菌（Micrococcus flavus）4 種菌株，是鮮核桃的主要致病菌。

ClO2熏蒸對4 種病原菌的抑制效應在0～40 mg/L 之間均具有量效關系，對兩種真菌100%抑制的濃度為16～30 mg/L，對兩種細菌為40 mg/L。40 mg/L ClO2處理下，25 和5 ℃貨架期鮮核桃的真菌與細菌滋生數量均顯著降低，霉變期延遲，減緩鮮核桃仁的感官品質下降，鮮核桃無可見霉變期分別保持6、24 d，核桃仁的消費者可接受期由對照的6、24 d 分別達到12、48 d。核桃青皮提取液復合使用僅對ClO25 ℃下的抑菌效應有所促進，對核桃仁感觀品質略有提升。

綜上得出，40 mg/L ClO2熏蒸是鮮核桃室溫和低溫貨架保鮮均適用的措施，按藥劑成本0.10 元/kg核桃，是經濟又高效的保鮮方法，在生產中具有廣泛的應用潛力。