基于LPS 炎癥模型探究鮑姆纖孔菌（Sanghuangporus baumi）菌絲多糖對巨噬細胞RAW264.7 的免疫調(diào)節(jié)作用

馬曉穎，肖 軍，龔 娜，劉國麗，陳 珣，楊 濤，姚 瀾，李長田，肇 瑩,

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧省食用菌優(yōu)質(zhì)栽培重點實驗室，遼寧沈陽 110161；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林長春 130118）

長期的炎癥被認為與癌癥、關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)退行性變等各種疾病的進展有關(guān)。盡管在疾病發(fā)生的過程中可以暫時通過藥物來解決，但是由炎癥引起的感染、以及抗炎類藥物引起的并發(fā)癥仍是引起死亡的主要因素之一[1]。所以，開發(fā)應(yīng)用能夠抑制炎癥過度的天然、無毒副作用的替代藥物以及能夠增強宿主防御反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑是非常迫切的。

桑黃是一種珍貴的功能性真菌，數(shù)百年來在包括中國、韓國和日本在內(nèi)的幾個東亞國家被廣泛用作食物來源。具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、降糖[4]、抗氧化[5]等多種生物活性。鮑姆纖孔菌（Sanghuangporus baumi）是桑黃的一個品種，一種著名真菌，幼時表面為褐色絨毛，老后細龜裂而變粗糙[6]，其水提取物不僅具有增強小鼠免疫力的免疫調(diào)節(jié)活性[7]，還可以緩解潰瘍性結(jié)腸炎[8]以及通過分泌細胞因子來參與巨噬細胞的反應(yīng)[9]。另一方面，鮑姆纖孔菌的子實體稀有，培養(yǎng)難度大，不可能獲得大量的提取物。目前，越來越多的人開始對食藥用菌進行液體發(fā)酵培養(yǎng)。菌絲深層培養(yǎng)具有快速、經(jīng)濟、易控制、無重金屬污染、易于從菌絲體中提取生物活性物質(zhì)等優(yōu)點[10]。在過去的二十年中，從天然產(chǎn)物中獲得的多糖由于其有前景的有益健康活性而引起了研究的極大關(guān)注。

近期，從桑黃屬子實體、菌絲體和發(fā)酵液中提取和純化的多糖被認為是負責(zé)各種健康促進作用的主要生物活性成分，包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、保肝、降血糖、降血脂、抗氧化和其他生物活性[11]。研究發(fā)現(xiàn)，從Phellinus linteus 和Phellinus ignarius純化的（1→3,6）-β-D-多糖可以顯著降低TNF-α的生成，刺激高IL-10 反應(yīng)，并抑制RAW264.7 細胞中IL-6 的轉(zhuǎn)錄，表明其具有免疫抑制活性[12]。連續(xù)13 d口服500 mg/kgPhellinus linteus多糖能夠顯著改善了小鼠的健康狀況，減輕了病理變化，下調(diào)了IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA 和蛋白質(zhì)水平，并降低了DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織中的MPO 活性、MDA 和NO 水平[13]。最新研究表明，一種來自Phellinus baumii的雜多糖，命名為SHPS-1，能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細胞中的STAT-1通路和DSS 誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，具有較強的抗炎活性[14]。對于鮑姆纖孔菌多糖的研究大都集中在子實體多糖，對于菌絲多糖的藥理和構(gòu)效研究比較少。在前期研究工作中，實驗室提取了菌絲化合物，發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)作用[15]。在此基礎(chǔ)上，本實驗研究了鮑姆纖孔菌菌絲多糖（SJ）對脂多糖誘導(dǎo)下的RAW264.7 巨噬細胞的潛在免疫調(diào)節(jié)活性。利用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細胞RAW264.7 建立炎癥模型，研究了不同濃度SJ 對脂多糖誘導(dǎo)下RAW264.7細胞生成IL-6、TNF-α、IL-1β和iNOS 的影響。以此了解鮑姆纖孔菌菌絲多糖（SJ）的抗炎活性，也為進一步臨床應(yīng)用免疫佐劑和免疫增強劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮑姆纖孔菌 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所；RAW264.7 巨噬細胞 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心；DMEM 高糖培養(yǎng)基（pH7.2～7.4）、PBS 磷酸鹽緩沖液（pH7.2～7.4）、胎牛血清美國Gibco 公司；脂多糖（LPS）美國Sigma 公司；Cell Counting Kit-8 CCK8 美國MP Biomedicals生物醫(yī)藥公司；BCA 蛋白定量試劑盒 美國Thermo科技公司；一氧化氮檢測試劑盒、細胞因子ELISA試劑盒 江蘇酶聯(lián)實業(yè)有限公司；RIPA 組織細胞快速裂解液、Tris-HCl 電泳緩沖液、SDS、過硫酸銨、TEMED、蛋白上樣緩沖液、脫脂奶粉、PBS 磷酸鹽緩沖液、Tween-20 北京索萊寶生物有限公司；蛋白預(yù)染Marker Fermentas 酶制劑公司；NC 膜﹑發(fā)光液（ECL）美國Millipore 公司；抗體IL-6、TNF-α、iNOS、IL-1β、β-actin 英國Abcam 抗體試劑公司；羊抗兔HRP 標(biāo)記二抗 上海碧云天生物科技有限公司；其他所有化學(xué)品和溶劑均為分析純 國藥化學(xué)試劑有限公司。

VS-1300U 超凈工作臺 蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；Cytoperm2 型二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市江南實驗儀器廠；J6-M1 低速離心機 美國BECMAN 公司；1680多功能酶標(biāo)儀 美國Biotek 公司；BX51T-PHDJ11 顯微鏡 日本奧林巴斯公司；XW-80A 微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；Mini Protean 3 Cell電泳儀 BIO-RAD 公司；TE77XP 電轉(zhuǎn)儀 美國HOEFER 公司；Tanon-5200 成像系統(tǒng) 上海Tanon科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將RAW264.7 細胞復(fù)蘇后，混懸于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d 換液和傳代1 次。

取處于對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞（1×106cells/mL）移于6 孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。細胞分為空白對照組（Control）、模型組（LPS）、SJ 25、50、100 和200 μg/mL 組，各組設(shè)3 個復(fù)孔。除空白對照組外，其余組加入0.1 μg/mL LPS，空白對照組添加含有0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，以上不同的組與巨噬細胞RAW264.7 在37 ℃培養(yǎng)24 h。吸取各組上清液，3000 r/min 離心10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鮑姆纖孔菌菌絲多糖SJ 對巨噬細胞細胞活力的影響 CCK8 法檢測[16]SJ 對RAW264.7 細胞存活率的影響。取生長狀態(tài)良好、密度達到80%～90%的RAW264.7 細胞，密度為1×106cells/mL 接種于96 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗分為空白對照組（Control）和不同鮑姆纖孔菌菌絲多糖SJ 濃度組（25、50、100、200 μg/mL），每組平行6 孔。菌絲多糖SJ 用0.22 μm 濾膜過濾。對照組換含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，SJ 組分別加入不同濃度的菌絲多糖，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后避光加入細胞培養(yǎng)液體積1/10 的CCK-8 于各孔中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀于450 nm 處測定其吸光度。

1.2.3 鮑姆纖孔菌菌絲多糖SJ 對巨噬細胞上清液中NO 的生成量的影響 按照1.2.1 實驗分組進行實驗，收集細胞培養(yǎng)上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒測定NO 水平。

1.2.4 鮑姆纖孔菌菌絲多糖SJ 對巨噬細胞中TNFα、IL-6 和IL-β分泌量的影響 RAW264.7 細胞（5×105cells/mL）接種于96 孔板中培養(yǎng)至對數(shù)期，按照實驗分組處理：空白對照組加入200 μL 的完全培養(yǎng)液，LPS 模型組加入培養(yǎng)液和脂多糖LPS（0.2 μg/mL）各100 μL，SJ 處理組分別加入培養(yǎng)液和濃度為25、50、100、200 μg/mL 的提取物溶液各100 μL，每組設(shè)3 個重復(fù)。不同實驗分組與巨噬細胞處理24 h后，4 ℃，3000 r/min 離心10 min，收集上清液，-20 ℃保存。按照ELISA 試劑盒說明書步驟，檢測細胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β。

1.2.5 鮑姆纖孔菌菌絲多糖SJ 對巨噬細胞iNOS、IL-6、IL-β和TNF-α蛋白表達的影響 按照“1.2.1”實驗分組，每組處理均和巨噬細胞RAW246.7 共培養(yǎng)24 h，然后收集各組細胞進行裂解，裂解后的樣品4 ℃，12000 r/min 離心15 min，取上清，進行蛋白質(zhì)定量后，每孔上樣量為15 μg 蛋白，加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min 后離心取上清上樣。將配制好的PAGE 膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液進行電泳，當(dāng)染料到達膠底部時切斷電源，停止電泳，進行下一步轉(zhuǎn)膜。分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，根據(jù)說明書稀釋抗體，抗體iNOS、IL-6、TNF-α、IL-β和β-actin 分別加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2 h 或4 ℃孵育過夜。與HRP 標(biāo)記的相應(yīng)二抗37 ℃孵育1 h，ECL 避光顯色5 min。將其放入成像系統(tǒng)中進行掃描，以β-actin 作為內(nèi)參。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究獲得的所有數(shù)據(jù)均經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。比較ANOVA 單因素方差分析，統(tǒng)計軟件采用SPSS16.0 for Windows，P<0.05，數(shù)據(jù)結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義，采用GraphPad Prism 9 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮑姆纖孔菌菌絲多糖SJ 對巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響

不同處理按照1.2.1 分組作用于RAW264.7 細胞24 h 后，用CCK-8 比色法檢測細胞增殖活力。如圖1 所示，當(dāng)SJ 作用到巨噬細胞后，可以增加細胞的數(shù)量，且呈濃度依賴性上升。不同濃度的SJ 對巨噬細胞的活力與對照組相比分別增加了20.5%～50.0%。結(jié)果表明，SJ 可以增加巨噬細胞RAW264.7細胞活力。

圖1 SJ 對巨噬細胞RAW264.7 細胞增殖的影響Fig.1 Effects of SJ on the viability of RAW246.7 cells

2.2 鮑姆纖孔菌菌絲多糖SJ 對LPS 誘導(dǎo)下RAW264.7細胞釋放NO 的影響

圖2 顯示，LPS 組可以增加NO 的釋放，與單一LPS 組相比，SJ（25、50、100 和200 μg/mL）組NO分泌量顯著減少（P<0.01）。同時，200 μg/mL 組的SJ極顯著（P<0.001）抑制在炎癥模型下巨噬細胞RAW264.7 產(chǎn)NO 的能力，比單一LPS 組巨噬細胞NO 分泌量降低了21.62%。

2.3 鮑姆纖孔菌菌絲多糖SJ 對LPS 誘導(dǎo)下RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-6 和IL-β 的影響

如圖3～圖5 所示，與Control 相比，LPS 組中的TNF-α、IL-6 和IL-1β水平顯著增加（P<0.01，P<0.001，P<0.01）。與LPS 模型組相比，添加SJ 各組均能夠降低TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量（P<0.05，P<0.001，P<0.001）。與LPS 模型組相比，質(zhì)量濃度為200 μg/mL的SJ 處理組比LPS 組巨噬細胞TNF-α、IL-6 和IL-1β分泌量降低了29.99%（P<0.001）、35.5%（P<0.001）、50.03%（P<0.001）。這表明鮑姆纖孔菌菌絲多糖能夠減少LPS 誘導(dǎo)下巨噬細胞產(chǎn)炎癥因子的能力。

圖4 SJ 對巨噬細胞 RAW264.7 中 IL-6 分泌的影響Fig.4 Effect of SJ on IL-6 release from RAW264.7

圖5 SJ 對巨噬細胞 RAW264.7 中 IL-β 分泌的影響Fig.5 Effect of SJ on IL-1β release from RAW264.7

2.4 SJ 對LPS 誘導(dǎo)的RAW246.7 巨噬細胞iNOS 蛋白表達水平的影響

如圖6 所示，以不同處理組與內(nèi)參蛋白量的比值作為相對表達率，與空白對照組比較，LPS 組iNOS 蛋白相對表達水平極顯著升高（P<0.001），這表明在受到LPS 誘導(dǎo)后巨噬細胞中iNOS 表達量會上升，而加入SJ 后，與LPS 組比較，SJ 處理組中所有組別iNOS 中蛋白表達水平極顯著降低（P<0.001），且具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖6 SJ 對巨噬細胞 RAW264.7 中一氧化氮合酶蛋白表達的影響Fig.6 Effect of SJ on the iNOS protein expression level of RAW264.7

2.5 SJ 對LPS 誘導(dǎo)的RAW246.7 巨噬細胞促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α 蛋白表達水平的影響

如圖7～圖9 所示，以β-actin 作為內(nèi)參蛋白，與空白對照組比較，LPS 組巨噬細胞中的IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白的表達量會極顯著（P<0.001，P<0.001，P<0.001）增加，加入與SJ 干預(yù)后均有一定程度的降低。與LPS 組比較，SJ 的濃度25～200 μg/mL 均能顯著降低在LPS 誘導(dǎo)下IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達量（P<0.001，P<0.001，P<0.001）。表明鮑姆纖孔菌菌絲多糖干預(yù)后能在蛋白表達水平上抑制細胞炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達，降低機體炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用。

圖7 SJ 對巨噬細胞 RAW264.7 中 IL-6 蛋白表達的影響Fig.7 Effect of SJ on the IL-6 protein expression level of RAW264.7

圖8 SJ 對巨噬細胞RAW264.7 中IL-1β 蛋白表達的影響Fig.8 Effect of SJ on the IL-1β protein expression level of RAW264.7

圖9 SJ 對巨噬細胞 RAW264.7 中 TNF-α 蛋白表達的影響Fig.9 Effect of SJ on the TNF-α protein expression level of RAW264.7

3 討論與結(jié)論

炎癥是機體由內(nèi)部或外部刺激誘發(fā)的復(fù)雜生物過程，參與多種疾病的病理進程[17]。巨噬細胞是免疫細胞的主體，在炎癥的啟動、維持和消退過程中具有重要的生物學(xué)功能。病原體或炎性刺激物激活的巨噬細胞會誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生導(dǎo)致炎癥的促炎介質(zhì)[18]。

小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 可用于炎性細胞因子的產(chǎn)生、吞噬作用、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、毒理學(xué)等多種研究，并且RAW264.7 對脂多糖的誘導(dǎo)很敏感[19]。炎癥的形成是細胞與炎癥介質(zhì)之間相互作用的結(jié)果，脂多糖刺激巨噬細胞使其活化，并導(dǎo)致促炎介質(zhì)的分泌，當(dāng)巨噬細胞過度產(chǎn)生的促炎介質(zhì)時，可誘發(fā)多種炎癥相關(guān)疾病[20-21]。

iNOS 是NO 生成的限速酶，是介導(dǎo)NO 生成的上層因子，在炎癥反應(yīng)過程中可大量產(chǎn)生[22]。NO 過量產(chǎn)生會引起急性和慢性炎癥，導(dǎo)致細胞死亡、組織損傷等病理變化[23]。因此，調(diào)節(jié)iNOS基因的表達是治療涉及NO 參與的炎癥性疾病最直接、最關(guān)鍵的方式。本研究發(fā)現(xiàn)，SJ 可以顯著減少LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細胞中NO 的過量產(chǎn)生，表明SJ 通過抑制NO 的產(chǎn)生來抑制炎癥。進一步研究發(fā)現(xiàn)，SJ 通過顯著抑制iNOS 的表達來抑制NO 過量產(chǎn)生。

iNOS基因的啟動子包括NF-κB、激活蛋白-1 和轉(zhuǎn)錄激活因子等識別位點。巨噬細胞中NF-κB 的活化可使iNOS的表達水平明顯增加，導(dǎo)致NO 釋放量持續(xù)升高，進而使得巨噬細胞分泌促炎細胞因子TNF-α[24]。TNF-α是由單核細胞-巨噬細胞受到促炎因子的刺激后合成和釋放的一種關(guān)鍵性促炎性蛋白[25]。IL-6 和IL-1β在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起重要作用，機體適量的分泌IL-6和IL-1β有助于感染的恢復(fù)，但是TNF-α、IL-6 和IL-1β等促炎性細胞因子的過度表達，不僅會誘導(dǎo)NO 及iNOS 的過度產(chǎn)生，還會導(dǎo)致多種器官的衰竭和功能的喪失[26]。因此，抑制巨噬細胞的炎癥反應(yīng)被認為是控制炎癥反應(yīng)的一種治療干預(yù)措施。ELISA 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，RAW264.7 巨噬細胞經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后TNFα、IL-6 和IL-1β的釋放量顯著增加，而SJ 顯著抑制了LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β的產(chǎn)生，且呈劑量依賴性（P<0.05）。為了進一步驗證上述結(jié)果，筆者對TNF-α、IL-6 和IL-1β進行了Western-Blot 分析。發(fā)現(xiàn)SJ 顯著下調(diào)LPS處理后TNF-α、IL-6 和IL-1β的蛋白表達水平，在細胞蛋白水平顯示出鮑姆纖孔菌菌絲多糖的抗炎活性。

鮑姆纖孔菌屬于桑黃的一個品種，主要寄生在丁香屬的植物上，研究表明，已經(jīng)從桑黃屬藥用真菌中分離和鑒定出了多糖、黃酮類化合物、三萜類化合物、多酚、類固醇、香豆素、生物堿和吡喃類化合物，其中多糖的報道最多[27-28]。本研究從鮑姆纖孔菌菌絲體中提取多糖SJ，利用脂多糖建立炎癥模型來研究其對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)活性，由本實驗所得結(jié)果可知SJ 可通過抑制促炎性細胞因子及炎癥介質(zhì)的含量體現(xiàn)其抗炎活性。結(jié)果表明：SJ 可以顯著的抑制NO、TNF-α、IL-6 和IL-1β的分泌量，并呈劑量依賴性趨勢。SJ 同樣可呈劑量依賴的抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞中IL-6 和TNF-α和IL-1β 和iNOS 蛋白的表達水平；表明SJ 對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞中相關(guān)炎性細胞因子蛋白的表達水平與細胞因子分泌水平的調(diào)節(jié)作用相一致；進一步說明SJ 可通過抑制iNOS/NO 信號通路的激活進而降低NO 的生成，進而抑制炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6 和IL-1β生成發(fā)揮其抗炎作用。本實驗從細胞水平探討了鮑姆纖孔菌菌絲多糖的抗炎作用機制，為鮑姆纖孔菌菌絲多糖在臨床上進一步推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)。為進一步開發(fā)利用鮑姆纖孔菌和人類健康生活提供了依據(jù)。