硝唑尼特對日本腦炎病毒和脂多糖誘導炎癥的體外抑制效果比較

蘇鈺，陳棟梁，馬慧，2，王霄旸，王春梅，周文，張可煜*

(1. 中國農業科學院上海獸醫研究所/農業農村部獸用化學藥物與制劑學重點實驗室，上海 201100；2. 云南農業大學，云南 昆明 650000)

當外界各種病原微生物感染機體時，病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)的生物分子能被體內巨噬細胞等免疫細胞的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)識別[1]，啟動細胞內信號傳導，從而導致天然免疫細胞活化，誘導表達效應細胞分子和分泌受體[2]。各種細胞因子的過量激活將引起細胞因子風暴和嚴重的炎癥反應，并進一步損傷機體。脂多糖(LPS)是最具代表性的革蘭陰性菌產生的PAMPs。本實驗室前期研究結果顯示硝唑尼特(nitazoxanide，NTZ)及其主要代謝產物替唑尼特(tizoxanide，TIZ)能夠通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核轉錄因子(NF-κB)途徑來調控LPS誘導的炎癥反應[3]。由于新型冠狀病毒的大流行，人們在尋找抗新冠病毒藥物時發現NTZ能夠減輕新型冠狀病毒感染引起的炎癥反應和細胞因子風暴，降低病毒感染對機體造成的免疫損傷[4-6]。實驗室前期研究也顯示NTZ能有效地在中早期抑制日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)在體內外的復制[7]，但其發揮抗乙腦病毒的作用機制尚未明確。

為治療絳蟲感染而面世的NTZ是一種四氫噻唑類化合物，由勒馬克實驗室的Rossignol等[8]首先合成并在拉丁美洲、非洲等國家被廣泛用于治療隱孢子蟲和藍氏賈第鞭毛蟲引起的腹瀉。經過多年臨床實踐和實驗室研究，人們逐漸發現NTZ具有廣譜抗多種寄生蟲、細菌和病毒的活性，但是NTZ對不同病原體的作用機制卻仍不清楚[9-10]。對于不同病原體或PAMPs激活的天然免疫，NTZ是否采取了相同或相似的調節應對機制，從而發揮廣泛的病原體抑制作用需要進一步研究和探討[11]。因此，本研究比較了NTZ體外抑制JEV和LPS誘導的炎癥反應的差異，為NTZ作用機制研究和臨床的合理科學使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與毒株

小鼠腹腔巨噬細胞(RAW264.7)、乳倉鼠腎細胞(BHK-21)均由本實驗室保存，JEV VA毒株由中國農業科學院上海獸醫研究所豬傳染病風險預警與阻斷技術團隊饋贈。

1.2 藥品與試劑

NTZ由中國農業科學院上海獸醫研究所獸用抗感染藥物與創新團隊合成，純度大于98%。將藥物溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配制成100 mmol/L的儲備液并使用有機相濾器(0.22 μm)過濾除菌，-20 ℃分裝避光保存，使用前用培養基稀釋至相應的工作濃度。LPS購自MERCK公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、青霉素與鏈霉素雙抗溶液購自Gbico公司；TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；GoScript Reverse PCR 試劑盒購自Promega試劑公司；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)購自Yeason公司；細胞活力檢測(CCK8)試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒、細胞裂解液(強)、蛋白酶抑制劑(PMSF)、磷酸酶抑制劑、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、小鼠白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒均購自碧云天生物公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒(10%)、Tris/甘氨酸/SDS電泳緩沖液(10×)、TBS/Tween緩沖液(10×)、Omni-Flash免冰浴快速轉膜緩沖液(10×)均購自雅酶生物公司；誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)和環氧合酶2(COX-2)抗體購自美國CST生物科技公司；非結構蛋白3(NS3)抗體購自Gene Tex公司；β-actin抗體、HRP標記山羊抗兔(鼠)IgG(H+L)購自碧云天生物公司。

本研究所用的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 病毒效價的測定及感染復數(MOI)的計算

將BHK-21細胞以8×103個/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養12 h。待細胞貼壁生長良好時接種病毒，將JEV VA毒株按照10-1～10-10的濃度進行倍比稀釋并接種于培養孔，每個濃度設置6個復孔，100 μL/孔；置于37 ℃、5% CO2培養箱孵育2 h后，吸棄含有病毒的培養基，PBS清洗2遍后加入2% FBS DMEM培養基，于細胞培養箱中培養3～4 d，每天觀察細胞病變(CPE)并記錄終點，根據Reed-Muench法計算病毒的半數組織細胞感染量(TCID50)。

按照公式(MOI=0.7TCID50/感染細胞數)計算MOI值。本研究以MOI=10的劑量感染RAW264.7細胞開展相關研究。

1.4 細胞活力的檢測

取生長狀態良好的RAW264.7細胞，1×104個/孔的密度接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后，加入1 μg/mL的LPS或MOI=10的JEV以及不同濃度的NTZ處理，每組設置6個復孔，繼續培養18 h后，吸棄原培養液，加入新的培養液與CCK8，置于培養箱中孵育2～4 h后，酶標儀檢測450 nm下的吸光度(OD)值，根據公式計算細胞活力。

1.5 體外炎癥模型的建立

將細胞以2×106～3×106個/孔接種到六孔板中，待細胞完全貼壁后，分別用1 μg/mL的LPS和MOI=10的JEV誘導細胞炎癥，隨后給予不同濃度(15、25和50 μmol/L)的NTZ處理。將孔板置于培養箱中繼續培養18 h后，收集細胞上清液并提取蛋白和細胞總RNA，-80 ℃保存。

1.6 炎癥因子mRNA表達水平的檢測

1.6.1 細胞總RNA的提取及反轉錄

采用TRIzol法提取RAW264.7細胞中的總RNA，反轉錄后將cDNA置于-20 ℃保存。反轉錄條件：25 ℃，5 min；42 ℃，1 h；70 ℃，15 min，-20 ℃保存。

1.6.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR反應體系配制參照Hieff qPCR SYBR Green Mix (Low Rox Plus)試劑盒說明書。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸34 s，共40個循環。

1.7 炎癥因子蛋白水平的檢測

1.7.1 Western blot檢測

收集細胞，以每孔100 μL的量配制裂解液，PMSF與RIPA比例為1∶100，冰上裂解15 min，用干凈的細胞刮刮取細胞，將細胞碎片和裂解液轉移至新的離心管中并標記。12 000 r/min，4 ℃離心10 min后收集上清液至新的離心管中，加入5×蛋白上樣緩沖液(1∶4)，之后將混勻的蛋白放入100 ℃的金屬浴中，10 min后取出，并放于-20 ℃保存。樣品采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定其蛋白含量，上樣前調整至3 mg/mL，上樣量均為10 μL。首先將電壓調整為80 V，電泳約30 min，待泳道樣品下降至分離膠中；然后將電壓調至150 V，當蛋白樣品遷移至距分離膠底部約1 cm時，停止電泳(約50 min)，取出玻璃板準備電轉。將蛋白從SDS-PAGE轉至活化的PVDF膜上，以250 mA電流轉印45 min，結束后用TBST洗去膜上的轉印緩沖液，然后用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h。封閉完成后，加入一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。次日用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min；之后加入二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，洗滌條件同上。最后將條帶置于ECL發光顯色液中，瀝去多余發光液后放入Tanon全自動發光儀中成像。用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

1.7.2 ELISA法檢測細胞上清液中細胞因子水平

參照碧云天ELISA試劑盒說明書，檢測RAW264.7細胞上清液中IL-6的分泌水平。

1.8 統計分析

試驗數據采用統計學軟件GraphPad Prism 6.0分析處理，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較組間差異。數據以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 NTZ最佳作用濃度范圍篩選

LPS與NTZ共同孵育18 h后，細胞活力變化如圖1a所示，當NTZ濃度在50 μmol/L及以下時細胞活力在80%左右，但是當NTZ濃度升至75 μmol/L時，細胞活力降至68%。對于LPS誘導的炎癥模型，后續試驗將采用50 μmol/L以下的藥物濃度進行。JEV感染細胞2 h，后給予不同濃度NTZ處理，細胞活力變化如圖1b，當NTZ劑量高于25 μmol/L時，細胞活力只有60%。后續選擇25 μmol/L以下的藥物濃度進行JEV侵染RAW264.7細胞試驗。比較上述結果可見，相同藥物濃度下，MOI=10劑量的JEV侵染對RAW264.7的毒性大于1 μg/mL的LPS刺激。

***表示NTZ處理組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖1 LPS(a)和JEV(b)誘導并給予NTZ處理后細胞活力變化的比較

2.2 NTZ抑制JEV的復制

將RAW264.7細胞以MOI=10的劑量感染JEV，2 h后給予不同濃度的NTZ處理。18 h后采用實時熒光定量PCR和Western blot分別檢測細胞中病毒NS1 mRNA和NS3蛋白表達變化。如圖2所示，與對照組相比，病毒感染組中NS1 mRNA和NS3蛋白的表達水平極顯著上升(P<0.01)，表明JEV感染RAW264.7細胞成功。NTZ處理JEV感染后的細胞，各個處理組的病毒mRNA和NS3蛋白的表達水平顯著低于JEV感染組(P<0.01)，其中10和15 μmol/L處理組的下降幅度又進一步低于5 μmol/L處理組(P<0.01)，即病毒mRNA和NS3蛋白的表達水平與NTZ呈劑量依賴性降低。以上結果說明NTZ能夠抑制JEV在RAW264.7細胞中的復制，即具有抗JEV作用。

a.NTZ抑制JEV非結構蛋白NS1 mRNA的轉錄；b. NTZ抑制JEV非結構蛋白NS3在RAW264.7細胞中表達；c. NS3蛋白表達變化的統計學分析。###表示JEV處理組與對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)，***表示NTZ處理組與JEV模型組相比具有極顯著差異(P<0.01)，下同。圖2 NTZ抑制JEV在RAW264.7細胞中的復制

2.3 NTZ對JEV誘導炎癥反應的影響

2.3.1 NTZ對炎癥因子mRNA表達的影響

JEV侵染RAW264.7細胞后的相關炎癥因子mRNA轉錄水平見圖3。JEV侵染RAW264.7細胞能夠引起TNF-α、IL-1β等炎癥因子mRNA的表達量顯著上升(P<0.01)。JEV侵染的RAW264.7細胞，經NTZ處理后，細胞中TNF-α和IL-1β的mRNA轉錄水平顯著下調，且當NTZ濃度為15 μmol/L時，細胞中TNF-α和IL-1β的轉錄水平僅為JEV侵染組的20%左右。結果提示，NTZ可抑制JEV刺激巨噬細胞轉錄炎癥因子。IL-6 mRNA轉錄水平較低，未檢測到(結果未顯示)。

圖3 NTZ抑制JEV誘導的RAW264.7細胞中TNF-α(a)和IL-1β(b)mRNA的表達

2.3.2 NTZ對炎癥及JNK蛋白表達的影響

Western blot結果顯示(圖4)，與空白對照組相比，JEV刺激后細胞中iNOS和COX-2蛋白的表達升高，具有顯著差異(P<0.01)。然而，與JEV模型組相比，不同濃度的NTZ處理組中炎癥相關蛋白iNOS和COX-2的表達并未下降，表明NTZ對iNOS和COX-2蛋白的表達幾乎沒有抑制作用。除此之外，JEV模型組中磷酸化JNK(pJNK)蛋白的表達與對照組相比顯著上調(P<0.01)，給予不同濃度的NTZ處理后并未抑制JNK蛋白的磷酸化。以上結果表明，JNK信號通路參與JEV誘導的巨噬細胞炎癥反應，但NTZ對JEV誘導的JNK通路并無抑制作用。

a.NTZ對JEV誘導的iNOS、COX-2、JNK以及pJNK蛋白的影響；b. iNOS蛋白表達變化的統計學分析；c. COX-2蛋白表達變化的統計學分析；d. pJNK蛋白表達變化的統計學分析。圖4 NTZ對JEV誘導的炎癥蛋白及JNK蛋白的影響

2.4 NTZ抑制LPS誘導的炎癥反應

2.4.1 NTZ對炎癥因子mRNA表達的影響

NTZ對LPS誘導的巨噬細胞內炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達的影響如圖5所示。與對照組相比，模型組細胞內IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA的表達顯著上升(P<0.01)，說明LPS誘導細胞炎癥模型成功。給予不同濃度NTZ處理后，細胞內IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA的表達呈劑量依賴性地顯著下調(P<0.01)。

圖5 NTZ抑制LPS誘導后RAW264.7細胞中IL-6(a)、IL-1β(b)和TNF-α(c)mRNA的表達

2.4.2 NTZ對炎癥及JNK蛋白表達的影響

如圖6所示，Western blot結果顯示，LPS刺激可顯著上調細胞內iNOS和COX-2蛋白的表達(P<0.01)。給予不同濃度NTZ處理后，iNOS和COX-2蛋白的表達被下調。其中，NTZ對iNOS蛋白的表達抑制效果最顯著，當NTZ濃度為12.5 μmol/L時，iNOS的表達就已被完全抑制；而對于COX-2的表達，則與NTZ的濃度有關。隨著藥物濃度升高，COX-2蛋白的表達逐漸下降，當藥物濃度為50 μmol/L時，COX-2的表達降至30%左右。以上結果表明NTZ對LPS誘導的炎癥具有良好的抑制效果。此外，LPS誘導后，MAPKs信號通路中pJNK蛋白與對照組相比顯著上調(P<0.01)，給予不同濃度NTZ處理后，pJNK蛋白表達量下降，當藥物濃度高于25 μmol/L時，pJNK的表達已被完全抑制。以上結果表明NTZ通過抑制JNK信號通路調控LPS誘導的細胞炎癥反應。

a.NTZ抑制LPS誘導后RAW264.7細胞中iNOS、COX-2、JNK以及pJNK蛋白的表達；b. iNOS蛋白表達變化的統計學分析；c. COX-2蛋白表達變化的統計學分析；d. pJNK蛋白表達變化的統計學分析。圖6 NTZ對LPS誘導的炎癥蛋白及JNK蛋白的影響

2.5 NTZ對JEV和LPS誘導IL-6的影響

為進一步驗證JEV組中IL-6的水平，以及LPS與JEV誘導RAW264.7細胞炎癥模型的區別，采用實時熒光定量PCR和ELISA檢測了JEV和LPS誘導后巨噬細胞內炎癥因子IL-6 mRNA和蛋白的表達量變化。如圖7所示，LPS誘導組中IL-6的表達量與對照組和JEV誘導組相比顯著上升(P<0.01)，而JEV組中IL-6的mRNA表達與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。ELISA結果顯示，LPS誘導后IL-6的表達量比對照組顯著上調(P<0.01)，經不同濃度NTZ處理后，IL-6的分泌量逐漸下降；而JEV處理組中IL-6的分泌量與對照組相比上升，但無差異性顯著(P>0.05)。以上結果表明，LPS誘導可激活巨噬細胞中炎癥因子IL-6的表達，而JEV并不能激活巨噬細胞中的IL-6；此外，NTZ處理后能顯著下調LPS誘導后的炎癥因子IL-6(P<0.01)。提示JEV和LPS通過不同的途徑激活巨噬細胞中的炎癥反應。

a.LPS和JEV模型組中IL-6 mRNA的表達變化；b. LPS模型組中NTZ抑制IL-6的分泌；c. JEV模型組中NTZ處理后IL-6的分泌變化。圖7 NTZ對JEV和LPS誘導后的巨噬細胞中IL-6的調控作用

3 討論

NTZ化學名為2-乙酰氧基-N-(5-硝基-2噻唑基)苯甲酰胺，在體內迅速被血漿酯酶水解為TIZ[12]，而其主要代謝產物TIZ與NTZ具有一致的生物活性。2002年美國食品藥品管理局(FDA)批準NTZ用于治療隱孢子蟲和藍氏賈第鞭毛蟲引起的腹瀉，并在拉丁美洲和印度等地區廣泛用于治療腸道寄生蟲感染[8]，在我國被批準用于犬絳蟲的防治。除抗寄生蟲外，NTZ及TIZ還被發現對多種細菌和病毒具有廣泛的活性[13]。新冠病毒肆虐全球以來，體外篩選抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的評估認為NTZ的EC50達2.12 μmol/L，具有潛在的抗新型冠狀病毒活性[14]。NTZ對多種病原體的藥理活性成為人們關注的焦點。

NTZ對大腸桿菌等革蘭陰性需氧或微需氧細菌幾乎沒有抗菌活性[13]。但是研究顯示，LPS所誘導的細胞炎性反應卻可以被NTZ所抑制[3，15]。本研究也證實，LPS刺激RAW264.7細胞所導致的IL-6、TNF-α和IL-1β等炎癥因子可以被NTZ顯著抑制，其機制可能涉及JNK等信號通路途徑。

JEV是一種重要的人畜共患病毒，我國是該病的高發區[16]。主要通過蚊媒傳播，感染后會引起宿主神經系統炎癥，目前尚無特效藥物治療[17]。研究顯示，NTZ能有效地在中早期抑制JEV在BHK-21細胞中的復制，并提高JEV感染小鼠的存活率[7]。本研究中，JEV相關基因NS1的轉錄和翻譯都受到NTZ顯著的抑制，再次證明NTZ的抗JEV活性；同時研究還發現，JEV侵染RAW264.7細胞所刺激的炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達也受到NTZ有效抑制。然而，相較于NTZ對LPS所誘導的各種細胞炎性因子的全面抑制，NTZ對JEV誘導的炎性因子抑制作用譜仍非常有限。JNK誘導轉錄因子如核因子-κB p65蛋白(NF-κB p65)、轉錄激活因子ETS樣蛋白1(ELK-1)以及調節細胞增殖、分化和轉化的因子c-Fos和c-Jun基因和信號轉導轉錄激活因子1(STAT1)的活化，這些轉錄因子在調節病毒感染的免疫應答中起關鍵作用[18]。本研究發現，NTZ能顯著地抑制LPS誘導的JNK磷酸化激活，卻并未能有效阻止JEV激活的JNK信號激活，這可能也與本研究中的病毒感染量偏大有關。

作為革蘭陰性菌的主要PAMPs，LPS是Toll樣孕體4(TLR4)的配體，在受體識別之后經MyD88-TRAF6途徑在胞內激活NF-κB、MAPK等信號通路，最終上調多種炎癥因子mRNA的轉錄與表達[19]。TLR4-NF-κB信號通路是一條經典的炎癥反應信號通路，廣泛參與機體多種炎癥反應。而病毒的PAMPs主要指非甲基化寡核苷酸CpGDNA、單鏈RNA等病毒成分，主要被TLR3和TLR9等模式識別受體所識別，但TLR4也可以識別某些病毒的蛋白[20]。已有研究證明，JEV感染小鼠小膠質細胞能誘導TLR3和RIG-I受體蛋白表達量升高，RNA干擾TLR3和RIG-I的表達能降低細胞炎癥因子的表達量，證明TLR3、RIG-I參與JEV誘導的炎癥反應[21]。本研究中，JEV和LPS都能誘導TNF-α和IL-1β等炎性因子，但有別于LPS，JEV并未顯著誘導IL-6的增加。IL-6作為經典的促炎因子，能夠被LPS刺激后表達，且涉及多條炎癥相關的信號通路，在炎癥進程中起著重要作用。有文獻表示，NTZ對LPS刺激后RAW264.7細胞中IL-6的分泌具有抑制作用[15]。因此本研究重點分析了LPS和JEV誘導RAW264.7細胞后，NTZ對IL-6分泌的調控作用。結果顯示，JEV并不能上調RAW264.7細胞中IL-6的轉錄與表達，說明兩種炎癥刺激模式存在關聯又各有特點。NTZ對IL-6的抑制作用充分說明其調節天然免疫的作用主要依賴于對NF-κB、MAPK等信號通路的調控作用，這些調控可能通過各種信號通路之間的串擾抑制JEV誘導的TNF-α和IL-1β等炎性因子的表達，也可能是NTZ的藥物靶點位于兩種PAMPs激活模式的通路的交匯點導致的。

總之，NTZ對不同PAMPs誘導的天然免疫都具有調控作用，鑒于其對病毒抑制的復雜性，其抗病毒機理和調控天然免疫的機制仍需要繼續探索，這將為NTZ應用于病毒等病原體的感染和相關炎癥的治療提供有力的支撐。