氨苯砜膠體金免疫層析試紙條研制及其在牛尿液樣本檢測中的應用

譚磊，智軍海，過大江，陳彤，何玉榆，全志學

(1. 深圳市質量安全檢驗檢測研究院，廣東 深圳 518000；2. 廣東省市場監督管理局食用農產品監管重點實驗室，廣東 深圳 518000；3. 天津華測檢測認證有限公司，天津 300000；4. 華測檢測認證集團股份有限公司，廣東 深圳 518100；5. 深圳市市場監督管理局龍崗監管局，廣東 深圳 518114)

氨苯砜(dapsone，DDS)化學名為4，4′-磺酰基二苯胺，或者4，4′-二氨基苯砜，分子式為C12H12N2O2S，是一種白色結晶粉末[1]。由于其可以對麻風桿菌有較強的抑制作用，臨床上主要用于麻風病和某些皮膚類疾病的治療[2]。據報道較大劑量使用氨苯砜時會有明顯的殺菌作用，與磺胺類增效劑有相似的作用機制，因此也可以作為磺胺增效劑用于水產品養殖過程，主要用于防治魚類細菌性疾病[3]。氨苯砜會引起一些血液性疾病，是因為氨苯砜的氧化能力相對較強，在血液中可以把血紅蛋白氧化成血鐵蛋白，使血紅蛋白無法攜帶氧氣，而且嚴重的還可能會造成死亡[4]。為此我國農業農村部193號、235號公告做了明確規定，禁止在所有食品性動物中使用氨苯砜，且不得在動物食品中檢出；歐盟也在《歐盟動物源性食品獸藥最高殘留限量規定》中將其列為禁用藥物[5]。

目前國內外關于食品中氨苯砜的報道主要在蜂蜜、牛奶、雞肉、豬肉、魚肉等樣品的檢測，常用的儀器方法有高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS/MS)。儀器方法可以實現精確的定量分析檢測[6-8]，但是也有其本身的不足，其設備昂貴，對人員的操作相對要求較高，樣品的前處理比較復雜，檢測成本較高，檢測周期長，在實際檢測過程中無法對大量樣本進行快速篩查，也無法滿足養殖過程中實時監測需求。

此外，已經報道的快速檢測方法有酶聯免疫吸附測定法 (ELISA)[5]和膠體金免疫層析法[3]等方法。雖然這些方法可以實現對組織類樣本的快速檢測和大量篩查，但是也存在著滯后性，無法實現在養殖環節的實時監測。因此，亟需要開發一種既不對動物造成傷害，同時又可以實現在動物養殖過程中實時監測的快速檢測方法。

本試驗建立了牛尿液中氨苯砜殘留量膠體金免疫層析快速檢測方法，檢測樣本由傳統的牛肌肉組織變成尿液，盡管檢測樣本發生了變化，但樣本不需要復雜的前處理，也縮短了前處理的時間，實現了養殖現場實時檢測，同時不會對動物造成傷害。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

新西蘭大白兔(6月齡，體重5 kg)由青龍山動物飼養中心(南京)提供，所有動物飼養和免疫程序按照華測檢測認證集團北京實驗室提供的方案進行。

氨苯砜、葡胺苯砜、苯丙砜、醋氨苯砜標準品(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；牛血清白蛋白(BSA)、雞卵白蛋白(OVA)(純度≥99%，美國Sigma公司)；羊抗兔IgG(無錫杰圣杰康生物科技有限公司)；碳酸鉀、氫氧化鈉、異丙醇、戊二醛(GA)、蔗糖、二甲基甲酰胺(DMF)、吐溫-20(分析純，國藥集團)；硝酸纖維素(NC)膜(CN140，德國Sartorius公司)；樣品墊、吸水墊、PVC底板 (上海捷一生物科技有限公司)；膠體金專用重懸液、樣本專用復溶液由天津華測檢測認證有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 氨苯砜抗原的合成

以DDS-OVA偶聯物作為免疫原，免疫抗原的合成參考戊二醛法[9]，具體步驟：稱取DDS 5 mg溶解于500 μL二甲基甲酰胺(DMF)中，加入20 μL 25% GA，4 ℃保持10 min，然后用超純水稀釋5倍，再4 ℃避光，放置15～30 min，制備成A液。稱取OVA蛋白20 mg置于棕色的小玻璃瓶內，溶解于4 mL的碳酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH=9.6)中，制備成B液。然后在避光條件下將A液加入B液中，同時不斷攪拌，制備合成DDS-OVA免疫原。裝入透析袋中，然后再用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L pH=7.4)進行透析。

包被抗原DDS-BSA，參考DDS-OVA的合成方式進行合成，之后進行透析去除未與蛋白結合的小分子。

1.2.2 氨苯砜多克隆抗體的制備

取6月齡新西蘭大白兔，以DDS-OVA作為免疫原與等體積弗氏完全佐劑混合乳化后，選擇背部皮下多點注射方式，首次免疫時每只兔注射0.5 mL混合液，之后第3天進行第2次免疫注射，按照DDS-OVA與弗氏不完全佐劑1∶1的比例混合，注射劑量為400 μL/只[10]。分別在第30天進行第3次免疫，第45天進行第4次免疫，免疫劑量參考第2次，共免疫4次。用乳化的弗氏不完全佐劑進行后2次免疫[11]。間隔3周后，將0.3 mL不添加佐劑的免疫原通過腹腔注射免疫大白兔，3天后刺穿心臟采集兔全血，4 000 r/min 離心5 min，收集血清即為抗氨苯砜血清。通過Protein A柱子純化獲得氨苯砜多克隆抗體[12]。

1.2.3 氨苯砜多克隆抗體-膠體金標記物微孔試劑的制備

取0.01%的膠體金溶液100 mL[13]，用0.1 mol/L K2CO3調節pH值至8.5左右，再加入3 500 μg氨苯砜多克隆抗體，在室溫下攪拌均勻后，靜置30 min。加入1 mL 10% BSA，再攪拌30 min，然后靜置20 min，在4 ℃條件下12 000 r/min離心20 min，棄上清液[14]，沉淀使用20 mL膠體金重懸液(2%蔗糖，3% BSA，0.3% Tween-20，由0.04 moL/L pH值為8.0的Tris-HCl配制)重懸后放于4 ℃冰箱中備用[15]。

將氨苯砜多克隆抗體標記膠體金后加入微孔中，100 μL/孔，待冷凍干燥機冷阱溫度降到-70 ℃后，微孔先預凍3 h，再轉移到冷阱中真空干燥24 h，將凍干的混合試劑保存到干燥密封的環境中[14]。

1.2.4 試紙條制備與組裝

在NC膜的檢測線(T)和質控線(C)處，分別包被適當濃度的氨苯砜-BSA偶聯物和羊抗兔IgG抗體，在PVC底板上依次粘貼NC膜、樣品墊、吸水紙，其中樣品墊、吸水紙與硝酸纖維素膜搭接約2 mm[16]。將組裝好的試紙條大板斬切成4 mm寬的試紙條，干燥條件下，室溫下密封于鋁箔袋內保存備用[17-18]。

1.2.5 牛尿液樣品的處理

從待測樣品管中取2 mL牛尿液加入離心管中，室溫下4 000 r/min離心5 min。將離心后的上清液轉移到2 mL離心管中，即得到待檢液[14]。

1.2.6 樣品的檢測及結果判定

取待檢液200 μL加入到氨苯砜抗體金標微孔中，反復吹吸幾次使微孔內部的紅色物質完全溶解，待完全溶解后，在微孔內反應3 min，再從微孔內移取100 μL加到試紙條的加樣孔內，層析5 min后讀取結果，其余時間判讀無效，根據示意圖(圖1)判定結果。陰性(-)：C線比T線顯色淺或兩者顏色相同，則樣本中氨苯砜的含量低于檢出限或不含氨苯砜；陽性(+)：T線顯色比C線淺或T線不顯色，表示樣本中氨苯砜含量大于檢出限；無效：C線不顯色，表明本次檢測結果失效。

圖1 結果判定示意圖

1.2.7 試紙條質量評估

檢出限的確定：在空白牛尿液樣品中分別添加質量濃度為0、1.25、2.5、5、10 μg/L的氨苯砜標準品，使用3個不同批次的試紙條進行檢測，根據試驗結果確定氨苯砜快速檢測試紙條的檢出限。

特異性試驗：選擇與氨苯砜化學結構、功能相似的藥物進行檢測。分別配制0、5、50 μg/L的氨苯砜、葡胺苯砜、苯丙砜、醋氨苯砜，使用試紙條進行檢測，根據結果判斷氨苯砜快速檢測試紙條的特異性。

準確性試驗：取實驗室保存的空白牛尿液樣品和添加氨苯砜2.5、5、10 μg/L的牛尿液樣品各50份，使用3個不同批次的試紙條進行檢測，分別計算假陽性率和假陰性率。此外，取20份盲樣樣本，根據SN/T 2219—2008《進出口動物源性食品中氨苯砜及其代謝產物殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》[8]對樣品進行檢測，同時用氨苯砜試紙條進行檢測。比較2種方法的一致性。

穩定性試驗：將試紙條密封于鋁箔袋中，于室溫環境下保存，每個月隨機選取一定數量的試紙條對添加氨苯砜5 μg/L的牛尿液樣品進行檢測并重復檢測3次，連續測定18個月。

2 結果與分析

2.1 抗原鑒定

由于氨苯砜分子量較小，為了獲得抗氨苯砜的多克隆抗體，需要將DDS-OVA偶聯物作為免疫原。然后用DDS-BSA偶聯物作為包被原，包被到NC膜上進行檢測。通過紫外掃描進行初步鑒定可以看出，氨苯砜的特征吸收峰位于260 nm處，而OVA和BSA蛋白的特征吸收峰位于280 nm處，而DDS-OVA和DDS-BSA偶聯物的特征峰在270和315 nm有2處特征吸收峰(圖2)，說明DDS-OVA和DDS-BSA偶聯成功，獲得了用于免疫的氨苯砜的免疫抗原和制備試紙條的包被抗原。

圖2 不同偶聯物紫外掃描圖譜

2.2 檢出限

在牛尿液中添加不同濃度的氨苯砜標準品使其濃度分別為0、1.25、2.5、5、10 μg/L，然后用氨苯砜快速檢測試紙條進行檢測。當牛尿液中氨苯砜含量為0、1.25、2.5 μg/L時，C線比T線顯色淺，表明檢測結果為陰性；當氨苯砜含量為5、10 μg/L時，T線顯色比C線淺(見圖3)，平行試驗間檢測結果均為陽性。由此可以確定本試紙條檢測限為5 μg/L。

Ⅰ～Ⅴ.氨苯砜濃度分別為0、1.25、2.5、5和10 μg/L。圖3 氨苯砜快速檢測試紙條檢測限比較

2.3 特異性

使用氨苯砜快速檢測試紙條檢測與氨苯砜化學結構、功能相似的不同濃度藥物時，結果均為陰性，而對超出檢測限的氨苯砜進行檢測時，結果呈陽性，具體結果見表1，表明本試紙條可以特異性檢測氨苯砜的殘留而與其他藥物無交叉反應。

表1 氨苯砜快速檢測試紙條特異性比較

2.4 準確性

取實驗室保存的空白牛尿液樣品和添加氨苯砜2.5、5、10 μg/L的牛尿液樣品各50份，使用3個不同批次的試紙條進行檢測，根據檢測結果可以看出，空白牛尿液樣品中未檢測出陽性結果，氨苯砜添加量為2.5 μg/L的牛尿液樣品檢測結果中，出現4例陽性結果；當氨苯砜添加量為5和10 μg/L時，其檢測結果全部為陽性，未出現陰性結果。該方法的假陽性率為1.33%(4/300)，假陰性率為0。

取濃度含量不同的實際樣品，分別用氨苯砜膠體金卡快速檢測試紙條和液相色譜-質譜/質譜法(HPLC-MS/MS)進行檢測，檢測結果見表2，從中可以看出，2種方法的檢測結果相符，說明了2種方法之間具有較好的一致性。

表2 氨苯砜快速檢測試紙條與HPLC-MS/MS檢測結果比較

2.5 穩定性

將試紙條常溫密封保存，其間用氨苯砜5 μg/L的牛尿液每月進行1次檢測，連續檢測18個月。前13個月內試紙條檢測結果無異常，均為陽性；在第14個月至第18個月的檢測中發現，試紙條偶有出現假陰性(見圖4)，結果不穩定。從整體上看試紙條的穩定性可以滿足現場使用的要求。

1～18.分別代表1～18個月。圖4 氨苯砜快速檢測試紙條連續放置18個月穩定性檢測

3 討論

氨苯砜對治療角質層下膿皰性皮炎、血管炎和天胞瘡有較明顯的作用，但是存在著嚴重的副作用，如貧血、中性粒細胞減少癥、血小板減少癥和肝毒性[2]。由于其殘留會對人有較嚴重的危害，因此國家規定在動物源性食品中禁止檢出氨苯砜[19]。但由于其價格便宜同時防治效果好，國內一些養殖戶仍未停止使用氨苯砜，這對我國的動物源性食品安全存在著較大的隱患[8]。目前，傳統的儀器檢測法儀器設備價格高昂，檢測時間長，且無法實現現場檢測。本文使用氨苯砜-OVA 偶聯物作為免疫原制備出氨苯砜多克隆抗體，再結合免疫層析原理成功研制出快速檢測牛尿液樣品中氨苯砜殘留量的膠體金試紙，可應用于基層現場檢測，同時還可以實現在養殖過程中對氨苯砜的實時監測。

根據特異性試驗結果可以看出，本試驗研制的氨苯砜試紙條與葡胺苯砜、苯丙砜及醋氨苯砜之間無交叉反應，具有良好的特異性。在檢測樣品時，出現個別的假陽性結果。一部分原因是牛尿液存在成分復雜、離子濃度高和pH值差異較大的特點，而前處理只做了離心[16]，相對比較簡單；另一部分原因可能是膠體金標記的氨苯砜多克隆抗體由于氨苯砜隨著時間的推移，環境溫度和pH值的變化會發生一定的降解[13，15]，又有可能是不同快速檢測試紙條之間存在個體差異[14]。但假陽性率很低，結合液相色譜的檢測結果，兩者一致性較好，說明試紙條檢測結果準確可信。常溫下，試紙條的保質期在1年以上，在此期間檢測結果準確、穩定，可滿足現場快速檢測的要求。

4 結論

氨苯砜膠體金快速檢測試紙條的檢測限為5 μg/L。本試紙條由于其攜帶方便、前處理過程簡單、準確度高等優點，可以廣泛應用于牛尿液樣品現場快速檢測，能夠做到在牛生產養殖過程中的實時監測，進一步保障了牛肉產品的安全，具有較強的基層使用價值。