云南部分地區牛羊體表寄生蜱的形態及分子鑒定

陳俊蓉，徐翠蓉，謝昕言，鄒豐才，賀君君，楊建發

(云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201)

作為僅次于蚊的第二大傳染病媒介生物，蜱隸屬于節肢動物門(Arthropoda)，蛛形綱(Arachnida)，蜱螨亞綱(Acari)，寄螨目(Parasitiformes)，蜱亞目(Ixodida)，是一類寄生在陸棲脊椎動物上專性吸血的寄生蟲[1]。1983年兩位美國學者在德克薩斯州證實，蜱是多種病毒、原蟲、細菌等的傳播媒介或儲存宿主，目前全世界已發現800多種，已確定至少能傳播217種病原[2-3]。蜱在世界范圍內廣泛分布，每年造成巨大的經濟損失，Bainard等[4]利用計算機模擬得出，因為牛體表寄生蜱而導致美國養牛業每年生產損失超過7 000萬美元。我國四川蒼溪縣曾遭受嗜群血蜱(Haemaphysalisphiloxeroides)危害，受害面積占97.4%，感染人及家畜共計50多萬，嚴重威脅人體健康，阻礙畜牧業的發展[5]。在蜱的諸多種類中，微小扇頭蜱(Rhipicephalusmicroplus)可攜帶160種病毒，其中25%左右為人獸共患病原，如立克次體、埃立克體等[6-7]。研究發現云南省西北地區的優勢蜱種為微小扇頭蜱，此外，昆明地區也有微小扇頭蜱分布的報道[8-9]。

Anderson等[10]研究表明，線粒體作為一個重要的細胞器，具有自身獨立的tRNA、rRNA基因，細胞色素基因作為穩定遺傳物質而存在，常被稱為核外獨立因子。線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome coxidase subunitⅠ，coxⅠ)基因在遺傳進化中比較保守，適用于蜱的分類鑒定及系統發育分析[11-12]。

云南省作為我國蜱類分布最多的地區之一，針對蜱的種類開展研究有助于科學防控蜱媒疾病[13]。本研究對云南地區采集的牛羊體表寄生蜱進行形態學觀察及coxⅠ基因的PCR擴增，分析比對擴增序列，研究其與其他種屬蜱間的系統進化關系，以期為家畜體表寄生蜱種類的研究提供數據支撐，同時為后期家畜養殖體表寄生蜱的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 蜱蟲樣品的采集與保存

本試驗于2021年8月份至9月份期間采集云南6個地區的牛羊體表蜱共計455只，置于75%酒精，于-80 ℃條件下保存。樣品來源及數量如表1所示。

表1 樣品來源及組成

1.2 主要試劑

血液/組織/細胞基因組提取試劑盒、無水乙醇、50×TAE緩沖液及ddH2O，均購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖粉，購自昆明諾華生物科技公司；2×AccurateTaq預混液(含染料)，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；GelStain核酸染料 (全式金)購自豐科生物科技有限公司；DNA Marker DL2000為TaKaRa試劑公司產品。

1.3 主要儀器設備

體視光學顯微鏡(ST6024-B1)，南京新睿之鴻光學儀器有限公司產品；高速臺式離心機(Model CF-10)，Wise Spin公司產品；PCR儀(PTC-1148)，Bibby Scientific公司產品；凝膠成像系統(WGD-30)，大韓科學儀器有限公司產品。

1.4 形態學鑒定

將蜱放入ddH2O，放置于4 ℃冰箱，浸泡30 min后更換1次，重復3次，以充分去除酒精浸泡液。置于濾紙上吸干水分，使用體視光學顯微鏡進行形態學觀察，通過觀察假頭基、背面、腹面、盾板、生殖孔、肛溝等進行初步鑒定。

1.5 分子生物學鑒定

1.5.1 蜱的DNA提取

將ddH2O吸干并將完整的蟲體分別放置在新的1.5 mL離心管內，用消毒后的剪刀剪碎，分別加入200 μL緩沖液GA與20 μL蛋白酶K，將樣品置于56 ℃的水浴鍋里過夜消化。按照DNA提取試劑盒說明書提取蟲體基因組DNA，所得DNA樣品放在-20 ℃下保存。

1.5.2 蜱的PCR擴增及測序

參照文獻[14]設計的引物進行蜱的分子鑒定，引物序列如表2所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。預計擴展片段長度為450 bp。擴增反應總體系為25 μL，其中 2×AccurateTaq預混液12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，超純水8.5 μL，模板DNA為2.0 μL。擴增條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；最后72 ℃延伸5 min，16 ℃反應結束。同時設陰性對照。取5 μL的PCR產物于加入了核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠中，置于電泳儀上電泳，檢測結果可通過紫外透射儀拍照記錄。將與目的片段大小重合的DNA樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序、拼接。序列拼接成功后于NCBI-BLAST網站上比對分析。從GenBank中下載部分與分離株相近的基因序列。利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法構建進化樹，以環形扇頭蜱(Rhipicephalusannulatus)作為外群，Bootstrap置信值重復抽樣1 000次。

表2 引物序列

2 結果與分析

2.1 形態學觀測

對采集的成蜱進行形態學初步觀察，并與蜱分類檢索表[15]進行比對，初步鑒定采集的樣品均屬扇頭蜱屬(Rhipicephalus)。蟲體呈黃褐色的長橢圓形，背腹扁平，頭、胸及腹合為一體，有假頭和軀體2部分，有4對足，盾板長大于寬，上面富有對稱性的花紋。氣門板呈長圓形，肛溝明顯，假頭基呈六邊形，且有緣垛，為扇頭蜱屬的典型特征(圖1)。

a.雌蜱背面觀；b.雌蜱腹面觀；c.雄蜱背面觀；d.雄蜱腹面觀；e.雄蜱肛門及肛后溝；f.雌蜱肛門；g.假頭基；h.足(部分)。圖1 采集寄生蜱樣品的形態學特征

2.2 微小扇頭蜱coxⅠ鑒定

對455只蜱分別提取DNA，采用PCR技術擴增coxⅠ基因。結果擴增片段大小均約450 bp，部分PCR產物電泳見圖2。

M.DNA Marker DL2000；1～5.陽性樣品；6.陰性對照。圖2 牛羊體表寄生蜱coxⅠ基因 PCR 擴增產物

2.3 序列測定及分析

測序結果表明，云南中部地區牛羊體表寄生蜱的coxⅠ基因序列長度為450 bp，BLAST比對結果顯示樣品與微小扇頭蜱的相似性最高，達100%。序列中A、C、G和T堿基的平均含量為28.67%、13.65%、14.33%和43.35%，A+T的含量遠高于G+C的含量。牛源蜱占比81.76%(372/455)，羊源蜱占比18.24%(83/455)。

利用MAGA 6.0軟件構建進化樹，結果顯示本研究中的牛源微小扇頭蜱RM1分離株以99%的置信度與云南地區的牛源微小扇頭蜱分離株匯成一支。羊源微小扇頭蜱RM2分離株與印度、巴基斯坦、孟加拉國和緬甸的微小扇頭蜱分離株親緣關系較近(圖3)。

▲本研究分離株圖3 微小扇小蟬coxⅠ基因片段進化分析

3 討論

3.1 形態與基因比對鑒定

蟲體假頭基的形狀是鑒定蜱種屬的重要依據，扇頭蜱屬的典型特征為假頭基形狀呈六角形，且有緣垛，扇頭蜱屬下分為5個亞屬78種，其中僅Rhipicephalus就達66種之多[16]。此外，扇頭蜱屬各類群間分類地位及系統進化關系比較復雜，起源和分化問題還需進一步驗證[17]。本次研究通過對成蜱的形態學觀察，再結合蟲體的coxⅠ基因序列分析，對云南省的玉溪峨山縣、玉溪元江縣、昆明晉寧區、楚雄武定縣、玉溪澄江縣、普洱墨江縣共計6個地區的牛羊采集的體表寄生蜱分析研究，發現獲取的牛源蜱與云南牛源蜱(OM368329.1)匯聚同一分支[18]，表明本次研究所采集的牛源蜱為微小扇頭蜱，獲取的羊源蜱與印度、巴基斯坦、孟加拉國和緬甸的微小扇頭蜱分離株匯聚，表明羊源蜱同屬微小扇頭蜱，且羊源微小扇頭蜱與牛源扇頭蜱之間可能存在交叉感染的情況。本次研究豐富了云南微小扇頭蜱基因序列的資料，有利于微小扇頭蜱的分子鑒定和遺傳變異研究。

3.2 牛羊體表寄生蜱的種類與分布

牛羊體表常見寄生蜱以扇頭蜱屬、璃眼蜱屬、血蜱屬為優勢屬類[19]。其中，微小扇頭蜱的宿主以牛為主，云南地區養殖的云嶺牛、紅安格斯牛、婆羅門牛都有感染微小扇頭蜱的報道[20]。此外，羊、馬、驢、犬、貓以及水鹿、青羊、鼠類等野生動物都可以作為該蜱的宿主。微小扇頭蜱作為一種重要的人畜共患病原的傳播媒介，主要分布于華中和西南地區，集中于海拔范圍4 km左右的地區，潛在分布于我國665個縣區，影響面積約135.7萬km2，其生活范圍主要適于氣候溫暖潮濕且溫度季節性變化較小的南部地區，降雨量是影響其分布的主要因素[21]。亞紅祥等[22]利用形態學觀察結合分子鑒定的方法對1 874只蜱鑒定，發現云南四川交界處的滇西橫斷山區養殖家畜體表寄生蜱以微小扇頭蜱為優勢種，本次研究也表明云南部分地區牛羊體表寄生蜱為微小扇頭蜱。因此，將來有必要對云南全省進行家畜體表寄生蜱的系統性調查和研究，以明確云南地區家畜體表蜱的種類與分布的變化情況，為其防治與研究提供理論和實踐依據。

同時，由于蜱作為吸食血液為主的體表寄生蟲，其所攜帶的病原數量較多，已報道存在斑點熱群立克次體、無形體科病原體、巴貝斯蟲等。尹傳松等[23]在牛源微小扇頭蜱中發現該類蜱攜帶牛巴貝斯、雙芽巴貝斯等血液寄生性原蟲。由蜱攜帶并傳播的病原可導致人及家畜的血液性疾病如貧血、黃疸等，若病情嚴重可威脅家畜生命安全，應重視家畜寄生蜱的防控工作。

3.3 體表寄生蜱的防治

目前利用藥物防治仍然是減少蜱寄生的重要措施[24]。云南自然資源富饒，植被類型豐富，特別是云南地區的亞熱帶高原季風氣候夏無酷暑，冬無嚴寒，適宜蜱的生存，夏季又為蜱多生季節，各養殖戶對家畜體表寄生蜱的防控更加要引起重視。姜在階等[25]發現采自云南牛體表的微小扇頭蜱飽血后平均可產2 647枚蟲卵，其產卵能力與吸血量呈正相關且受溫度影響較大。各牛羊家畜養殖戶在養殖過程中應科學制定防蟲除蟲計劃，對放牧牛羊開展輪流放牧，對圈養牛羊要及時清理陰潮的角落、縫隙，及時通風。同時避免家畜間蜱的相互傳播，及時隔離出帶蟲個體，采用雙甲脒、氰氟蟲腙聯合用藥噴灑或洗刷畜體，可達到良好的預防和治療作用[26]。近年來微小扇頭蜱的生活范圍有擴大的趨勢，因此云南地區的養殖戶需加強對微小扇頭蜱的防控工作。