蘭州市寵物貓隱孢子蟲流行情況調查及分子生物學鑒定

李雅琪，王玉桂，鄒揚，張月玥，馬平平，葉得河，王帥，馬永華*

(1. 甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；2. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室/農業部草食動物疫病重點開放實驗室，甘肅 蘭州 730046)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種重要專性胞內寄生且具有人畜共患性的機會性致病原蟲，可感染多種脊椎動物[1-3]。由隱孢子蟲感染導致的隱孢子蟲病是人類最常見的6種腹瀉病之一[4]。隱孢子蟲主要通過糞-口途徑和水源傳播[5-6]，其卵囊進入宿主體內后，定殖在消化道上皮細胞內進行發育[7-8]。據現有報道，隱孢子蟲可感染所有脊椎動物，且通常患病動物會通過糞-口途徑和水源途徑感染人類，嚴重威脅人類健康[9]。免疫力正常人群感染會出現急性自限性腹瀉，免疫力低下和免疫缺陷人群感染可引起水樣腹瀉，嚴重時會危及患者生命。

研究表明，伴侶動物，特別是寵物犬貓，不僅對寵物主人的心理健康有著正向的影響，同時對于部分疾病也有著輔助治療的作用[10]。寵物貓作為常見的隱孢子蟲宿主，長期與寵主接觸增加了人獸共患傳染病的傳播風險。1979年研究者首次在寵物貓身上發現了隱孢子蟲[11]。對寵物貓糞便中隱孢子蟲的基因研究表明，其感染蟲種主要為貓隱孢子蟲(Cryptosporidiumfelis)[12-16]。貓隱孢子蟲極易傳染給人類，已有部分亞型在兒童、免疫正常病人、免疫缺陷病人及其他多種動物的糞便樣品中發現，貓隱孢子蟲已被列為感染人類的5個重要蟲種之一[3]，并在大量人隱孢子蟲病例中報道。Meng等[11]將1988—2021年貓隱孢子蟲感染全球流行狀況進行了系統性回顧分析，整理繪制出全球貓隱孢子蟲的流行地圖，發現全球貓隱孢子蟲的感染率在0.6%～40.8%，其中肯尼亞的貓隱孢子蟲感染率為40.8%(95%置信區間：31.4～50.5)，顯著高于其他國家和地區，中國地區的貓隱孢子蟲感染率為3.4%(95%置信區間：1.8～5.2)。

隱孢子蟲基因組已有幾個遺傳位點被開發并作為分子診斷工具供臨床使用來鑒定蟲種亞型。其中擴增小亞基核糖體RNA(SSU rRNA)基因位點的方法使用較廣泛[17-18]。本試驗基于SSU rRNA序列采用套式PCR擴增調查蘭州市寵物貓隱孢子蟲的感染情況，經過測序鑒定感染蟲種亞型，分析易感因素，為預防控制隱孢子蟲感染提供理論依據[19-23]。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與保存

2020年1月至2022年6月從蘭州市五大主城區的寵物醫院、繁育貓舍及寵物市場獲取寵物貓糞便，保存于一次性無菌離心管中，記錄寵物貓品種、年齡、性別、來源等信息。將樣品及時送回實驗室，保存在-80 ℃冰箱中。各城區樣品分布情況如圖1所示。

1.2 主要試劑

E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 糞便DNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司；r-TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP Mixture、6×Loading Buffer、25 mmol MgCl2、DL1000 DNA Marker均購自TaKaRa公司；50× TAE購自生工生物工程(上海)股份有限公司；溴化乙錠(EB)購自美國Sigma公司。

M.相對分子質量標準；+.陽性對照；-.陰性對照；1～10. 糞便樣品。圖2 隱孢子蟲SSU rRNA套式PCR擴增結果

1.3 糞便DNA提取

為提高糞便純度，先進行預處理。將糞便置于50 mL燒杯中，加入40 mL ddH2O混勻后，用60目的金屬過濾篩過濾，濾液收集在50 mL離心管內，8 000 r/min，離心10 min，棄去上清液，沉淀用于后續試驗。取200 mg沉淀于2 mL無菌離心管中，參照OMRGA E.Z.NVA.?Stool DNA Kit試劑盒說明書提取糞便中的DNA，并于-20 ℃保存。

1.4 套式PCR擴增

基于SSU rRNA序列，引用參考文獻[19]中擴增引物。擴增第1輪上游引物為：5′-CCCATTTCCTTCGAAACAGGA-3′，下游引物為：5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′；第2輪擴增上游引物為：5′-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3′，下游引物為：5′-GGAAGGGTTGTATTATTAGATAAAG-3′。引物由西安擎科澤西生物有限公司負責合成。對所提取的DNA樣品進行套式PCR擴增，套式PCR反應體系為25 μL，反應共進行2輪，第1輪擴增產物作為第2輪的模板。

1.5 核酸電泳及測序分析

取終輪PCR產物5 μL與1 μL DNA Loading Buffer混勻后加入含有溴化乙錠(EB)的1.2%瓊脂糖凝膠中，160 V電泳15 min，置于成像系統中拍照檢測，將有目的條帶的PCR樣品原液送至西安擎科澤西生物有限公司進行測序。測序結果用DNAMAN軟件編輯和校準序列，在NCBI網站進行序列比對來確定蟲種亞型。

1.6 統計學分析

以蘭州市寵物貓的年齡、品種、性別、季節、采樣地區及樣品來源作為試驗相關因素，利用SPSS 25.0分析軟件中的風險因素和χ2檢驗，分析寵物貓隱孢子蟲的感染率和相關風險因素，通過計算其感染率的優勢比(odds ratio，OR)和95%置信區間，分析貓隱孢子蟲在不同來源、地區、季節、年齡、品種及性別之間是否存在顯著差異，當P<0.05或P<0.01時，表示差異具有統計學意義。

1.7 遺傳進化及發育分析

從NCBI網站的GenBank 數據庫中下載部分貓隱孢子蟲的序列作為參考序列，并將本試驗中的基因序列上傳至GenBank數據庫獲取基因號，運用MRGA 11軟件中的最大似然(Maximum Likelihood)法構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 蘭州市寵物貓隱孢子蟲感染情況

運用套式PCR擴增法，對隱孢子蟲的SSU rRNA基因位點進行擴增，在655份樣品中，成功擴增出了26份陽性樣品，總感染率為3.97%(26/655)。部分樣品的凝膠電泳圖如圖1所示，擴增出的目的片段大小約為380 bp。

2.2 不同年齡組寵物貓感染情況

對寵物貓年齡進行分組，分別計算隱孢子蟲感染率，結果顯示，3～10月齡的寵物貓感染率最高為6.16%，1～3月齡寵物貓感染率次之為3.85%，不同年齡段的感染情況詳見表1。感染組中年齡最小為2月齡，最大為4歲3月齡，由此可見，隱孢子蟲可以感染各個年齡段的寵物貓，且各年齡段之間感染情況并無統計學差異。

表1 不同年齡、性別、品種寵物貓隱孢子蟲感染情況

2.3 不同性別寵物貓感染情況

在收集的655份樣品中，雄性樣品占47%，雌性樣品占53%，不同性別的寵物貓感染情況詳見表1。通過計算可知，不同性別之間的感染率無顯著差異。

2.4 不同品種寵物貓感染情況

本試驗共涉及21個常見寵物貓品種，包括中華田園貓、美國短毛貓、英國短毛貓、加菲貓、布偶貓、藍貓、銀點貓、銀漸層貓、金漸層貓、斯芬克斯無毛貓、阿比西尼亞貓等，其中有6個品種檢出隱孢子蟲，各品種感染情況詳見表1，在本次試驗中，金漸層貓的感染率最高為18.18%，且不同品種之間的感染率存在顯著的差異(P<0.05)。由此推斷，寵物貓的品種是影響隱孢子蟲感染的主要因素之一。

2.5 不同地區寵物貓感染情況

本試驗采樣區域為蘭州市五大主城區(城關區、七里河區、安寧區、西固區、紅谷區)，主城區中，僅有城關區與七里河區檢出陽性樣品，各地區的感染情況如表2所示，城關區與區七里河區的感染率分別為7.52%和3.35%，經統計可知，不同地區之間感染率并無顯著差異。

表2 不同地區、季節、來源寵物貓隱孢子蟲感染情況

2.6 不同季節寵物貓感染情況

試驗樣品采集耗時1.5年，根據采樣季節對樣品進行劃分，各季節寵物貓隱孢子蟲感染情況如表2所示，各季節采集的樣品均有檢出隱孢子蟲，夏季共采集樣品235個，占樣本總數的36%，感染率為7.66%，感染率顯著高于其他3個季節，不同季節感染率之間也存在顯著的差異(P<0.05)。因此季節因素也是影響寵物貓感染隱孢子蟲的主要因素之一。

2.7 不同來源寵物貓感染情況

樣品分別來自寵物市場、繁育貓舍及寵物醫院，不同來源地的感染情況詳見表2。寵物市場的感染率(7.96%)遠高于繁育貓舍(4.56%)及寵物醫院(1.93%)。經檢驗發現，采樣場所之間感染率的差異也較為顯著(P<0.05)。樣品來源地也是影響隱孢子蟲感染的因素之一。

2.8 隱孢子蟲蟲種鑒定及遺傳進化發育分析

對26份PCR陽性樣品測序鑒定，結果均為貓隱孢子蟲。使用MEGA 11軟件采用最大似然(Maximum Likelihood)法構建遺傳進化樹，結果如圖3所示。測序樣品與已鑒定出的貓隱孢子蟲(基因登記號為KY882321.1)的相似性為99%以上。通過構建進化樹發現，所有陽性樣品均與中國上海地區鑒定出的貓隱孢子蟲(基因登記號為MT458670)位于同一分支上，且發育樹中的Bootstrap值較高，提示兩種分離珠遺傳進化關系較近。本研究中鑒定的貓隱孢子蟲陽性序列已上傳至GenBank數據庫，獲得了基因登記號為OP345050～OP345056。

▲為本試驗陽性樣品。圖3 基于SSU rRNA基因位點得到的貓隱孢子蟲進化關系樹

3 討論

3.1 不同來源地感染率差異分析

根據試驗結果可知，不同來源地的寵物貓感染隱孢子蟲的情況有所不同，這可能與飼養方式和生活環境有關。分析采樣信息可知，46.9%的樣品來自于繁育貓舍，這些貓舍大多存在于居民住宅區中，飼養密度大，空間相對局限，且存在共用貓砂盆、食碗、水碗等現象。一旦出現個體感染，極易引起群體暴發感染。繁育貓舍寵物貓數量過多，寵主難免會照顧不周，忽視其健康問題。建議繁育貓舍控制飼養密度，加強環境的清潔，定期對貓砂盆進行消毒清潔，更換貓砂，及時對食碗、水碗進行清洗消毒。

在本試驗中，來自寵物市場的寵物貓隱孢子蟲的感染率也較高，這些寵物貓與外界環境接觸較為頻繁，部分寵物貓是從外地引進，對之前的生活飼養史了解甚少，有可能之前已經感染了隱孢子蟲，但由于沒有明顯癥狀出現，無法進行判斷。對于寵物醫院樣本，調查寵物貓病史可知，有超過30%的寵物貓就診前出現過不同程度的腹瀉，平時散養在家，偶有誤飲生活用水和啃食盆栽的習慣，這也有可能造成隱孢子蟲感染。

3.2 不同季節感染差異分析

據統計，夏季隱孢子蟲的感染率偏高，這可能與當地氣候環境因素有關。蘭州市位于我國西北部，甘肅省的中部，屬于溫帶大陸性氣候，年平均氣溫10.3 ℃，降水主要集中在6至9月，溫暖潮濕的環境十分適合寄生蟲病的發生與傳播。很多寵主認為寵物貓平常不出門，沒有必要進行體內外驅蟲，但從本試驗結果可知，寵物貓感染體內寄生蟲的現象還是普遍存在的，尤其在夏季多發，因此做好體內外驅蟲是十分重要的。

3.3 不同年齡段感染差異分析

分析發現，3～10月齡的寵物貓隱孢子蟲感染率為6.16%(9/146)，顯著高于其他年齡組。此結論與委磊等[20]在蘭州市流浪犬蠕蟲感染情況調查中的結論一致。對于3月齡的幼貓幼犬，可以進行初次免疫，整個免疫過程長達42～56 d。免疫疫苗屬于弱毒疫苗，注射后，會造成機體抵抗力下降，在此期間極易感染其他疾病。本試驗中感染隱孢子蟲的寵物貓在2月齡至4歲不等，可見隱孢子蟲可以感染不同年齡段的寵物貓，且成貓感染后癥狀不明顯，往往不能及時發現，故更要引起重視。

3.4 不同動物隱孢子蟲的感染情況

在我國，隱孢子蟲已在多種動物及人類身上檢出，但感染率之間差距較大。國內對于飼養經濟動物及寵物的隱孢子蟲感染報道較為多見，詳見表3。飼養經濟類動物如馬、山羊、豬等可感染不同種類的隱孢子蟲。國內現有報道均表明寵物貓僅感染貓隱孢子蟲，且暫未發現其他種類。值得注意的是，犬貓隱孢子蟲亞型均為人獸共患，需引起高度重視。

表3 中國不同地區不同動物隱孢子蟲感染情況

3.5 寵物貓隱孢子蟲防治建議

隱孢子蟲作為重要的介水傳播病原微生物，其卵囊在水中可存活數月，故被美國環境保護署(EPA)和世界衛生組織(WHO)列為規定的飲用水必檢病原微生物。寵物貓飲用自來水或誤飲生活廢水也會增加感染隱孢子蟲的風險[9]。張曉等[6]在2014年檢測了我國部分地區的水源水和末梢水中隱孢子蟲，結果顯示，水源水及末梢水中均有隱孢子蟲的蟲卵存在，因此本試驗中的寵物貓隱孢子蟲極有可能是介水傳播感染。建議條件允許的情況下，勿用未加熱的自來水喂養寵物貓，可以選用涼開水或者純凈水喂養[6]。同時盡量避免喂食生肉，可加工煮熟后飼喂。在家中無人時圈養寵物貓，避免誤食和誤飲。

據統計，發展中國家人的隱孢子蟲感染率在4%～20%，鑒于本試驗寵物貓感染率較高，且貓隱孢子蟲屬于可感染人類的5種隱孢子蟲種之一[3]，人貓接觸頻繁，關系密切，人畜共患的風險也隨之升高。目前為止還沒有針對隱孢子蟲的疫苗或者預防性藥物，因此需要引起重視。在實際臨床病例中，醫生有責任和義務對寵主進行知識普及，通過糞便檢查對隱孢子蟲進行篩查，及時發現并治療，從而避免人畜共患病的發生。

4 結論

本研究結果表明，甘肅省蘭州市寵物貓存在感染隱孢子蟲的情況，感染率為3.97%，且感染率與寵物貓品種、樣品來源地、采樣季節這幾個因素有關。鑒于隱孢子蟲為人畜共患寄生蟲，寵物與寵主接觸頻繁，需引起高度重視。