銻污染土壤中添加蚯蚓對油菜生長及土壤特性的影響

白婧，劉宏輝，盧丹，農州，馬江濤，陳琳玉，鄭玉，向國紅，段仁燕*

（1.湖南人文科技學院農業與生物技術學院，湖南 婁底 417000；2.湘中特色農業資源開發利用與質量安全控制湖南省高校重點實驗室，湖南 婁底 417000）

銻（Sb）是一種稀有且不可再生的有色金屬元素，具有冷脹熱縮的獨特屬性，位列我國四大戰略資源之首[1]。我國銻儲量和產量均位居世界第一，銻礦主要分布在湖南、廣西、西藏、貴州、云南等地區。長期以來銻礦開采、冶煉和廢棄礦渣的無序堆置，導致我國土壤、水體和大氣中的銻濃度持續升高，據統計，“世界銻都”錫礦山地區受重金屬污染耕地面積共有2 054.9 hm2，其中已不再適合作為耕地利用的重度污染土壤面積達1 112.3 hm2，銻污染成為備受人們關注的環境問題[2-3]。銻作為一種具有長距離傳輸特點的全球性污染物，可在陸地生態系統中富集和傳遞，并通過食物鏈在人體內積累，最終影響蛋白質及糖的代謝，損害肝臟、心臟、呼吸和神經系統[4]。本課題組調查發現錫礦山礦區72.64%的土壤樣點具有極高生態風險，農田土壤樣點銻含量高達2 124.00 mg·kg-1，遠超世界衛生組織建議接受土壤中銻的最大允許污染物含量（36 mg·kg-1）[5]。礦區周邊水體銻質量濃度平均達到10.51μg·L-1[6]。因此，針對銻污染研發對應的修復技術對于保障銻污染農田的安全生產和利用具有重要意義。

油菜（Brassica napusL.）是我國重要的經濟作物，主要種植區域集中于長江流域，與銻礦主要分布地區重合。油菜生物量大、根系發達，對重金屬脅迫有一定耐性，地上部組織可累積較多含量的重金屬，被稱為是重金屬累積植物[7]。諸多研究表明油菜具有修復土壤重金屬鎘和鉛污染的能力[8-9]。相比于根、莖、葉，籽粒中重金屬富集量較低，地上部富積量高于地下部，機械化收割時即可實現邊修復邊生產[10-11]。因此，探究油菜對銻污染農田的修復潛力對推廣植物修復技術具有應用價值。

蚯蚓被譽為陸地生態系統“工程師”，其活動能顯著影響土壤生態系統的物理、化學、生物學性質，從而改變植物生長的生態環境，增強土壤微生物活性，影響土壤有機物轉化，為污染土壤生態修復提供良好的環境條件[12]。此外，蚯蚓對重金屬脅迫具有較高的耐性，在受重金屬污染土壤中可存活和再生繁殖，這是其應用于植物-動物聯合修復污染土壤的基本前提[13]。研究表明，蚯蚓通過影響微生物和酶活性、微生物群落結構，降低了鉻、鉛、鎳、鎘和銅等多種重金屬的生物有效性，強化了重金屬修復的去除效果[14-15]。銻污染情況下，蚯蚓對油菜積累銻的影響機制研究還鮮見報道。

本文通過探究赤子愛勝蚓（Eisenia fetidaSavigny，E.fetida）對油菜富集銻能力的影響效應，在分析銻脅迫下土壤酶活性、細菌群落多樣性和結構響應的基礎上，探究蚯蚓-油菜復合體系對土壤銻污染的修復潛力，為開發動物-植物聯合修復重金屬污染土壤技術提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自湖南人文科技學院九耳校外基地（27°46'26.96″N，112°01'30.30″E），土樣經自然風干、搗碎、剔除雜質，過2 mm 尼龍篩后備用。土壤pH為7.28，有機質為22.34 g·kg-1，全氮為1.27 g·kg-1，堿解氮為128.53 mg·kg-1，全磷為0.96 g·kg-1，速效磷為43.63 mg·kg-1，全鉀為15.79 g·kg-1，速效鉀為185.15 mg·kg-1，銻為33.57 mg·kg-1。

供試蚯蚓品種為赤子愛勝蚓，購買于江蘇省句容市王軍蚯蚓養殖場。選用同一批次繁殖的赤子愛勝蚓作為受試生物，蚯蚓在供試土壤中馴化2 周。選取個體相似、體色鮮亮，有明顯生殖環的蚯蚓于室溫下清腸24 h后用于試驗。

供試油菜品種為甘藍型雜交油菜南油雜1 號和灃油958，由婁底市農業科學研究所提供，兩品種油菜在前期大田和室內篩選試驗中表現出較強的銻富集能力。

半水酒石酸銻鉀[C4H4KO7Sb·1/2H2O，Sb（Ⅲ）]，分析純，生產廠家為西隴科學有限公司。試驗過程中所用的其他試劑均為分析純。

1.2 試驗設計

試驗設計如表1所示，共設6個處理，每個處理3個重復。銻濃度和油菜品種的設置均根據課題組前期在銻礦區調查結果以及室內品種篩選試驗確定。油菜南油雜1號和灃油958對銻均具有較高的抗性，銻含量達到2 000 mg·kg-1時，未對其生長產生明顯抑制。

表1 試驗處理樣品設計Table 1 Test treatment sample design

1.3 試驗方法

準確稱取1.8 kg 土壤至于花盆（12 cm×14 cm，直徑×深度）中。在播種前半個月將配好的半水合酒石酸銻鉀水溶液隨水施入土壤中充分混合，土壤平衡老化14 d。播種時將土壤再次拌勻，防止銻在土壤中分布不均，定期澆水，保持土壤含水量為田間持水量的60%～70%。油菜種子于2021 年10 月2 日播種，每盆點播10粒種子，播種深度3 cm，每盆放入赤子愛蚯蚓20 條，定期觀測油菜苗生長情況。于2021 年11月17日破盆取樣，測定作物的生理指標（株高、生物量），從盆栽土壤的10～30 cm土層選取帶有完整根系的土塊，輕輕抖落土壤，緊附在根系表面且不易被抖落的土壤即為根際土壤。再去掉土壤中的根系和小石塊，一部分過篩至2 mm，一部分裝于無菌封口袋中，冰上放置帶回實驗室后保存在-80 ℃冰箱中。

1.4 測定指標和方法

1.4.1 生長指標

每個處理取3 株油菜苗，用蒸餾水洗凈，吸水紙吸干，裝袋后于烘箱105 ℃殺青30 min，然后65 ℃烘干至質量恒定，取平均值記作干質量。

1.4.2 銻含量測定

土壤樣品置于室內經自然風干、除雜后過100 目尼龍網篩，裝入聚乙烯密封袋中4 ℃密封保存備用。油菜用自來水將表面的泥土沖洗干凈，再用去離子水反復清洗后置于室內自然晾干。重金屬銻含量用原子熒光光度計（型號：AFS-2100）測定，檢測限值為0.01 mg·kg-1。設置質量控制、空白控制和標準參考土壤（GBW07407，中國標準物質檢定中心）。質量控制樣品的回收率在92%～108%之間，平行樣品的偏差在10%以內。

富集系數（BCF）為植株體內總銻含量與相對應的土壤中銻含量之比，表示植物從土壤中吸收和富集銻的能力。

1.4.3 土壤養分的測定

土壤pH 采用電極法測定，全氮采用凱氏定氮法測定，全磷采用鉬銻抗比色法測定，全鉀采用原子吸收分光光度法測定，堿解氮采用擴散法測定，速效磷采用NaHCO3提取法測定，速效鉀采用NH4Ac 火焰光度法測定，有機質采用重鉻酸鉀容量法（外加熱法）測定，具體方法參照《土壤農化分析》[16]。

1.4.4 土壤酶活性測定

蔗糖酶（IN）活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，脲酶（UE）活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定，中性磷酸酶（NP）活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度法測定。土壤酶活性測定試劑盒由蘇州科銘生物科技有限公司提供。

1.4.5 微生物多樣性測定

利用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 提取根際土壤總DNA，使用Nanodrop 對DNA 進行定量檢測。利用338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R：5' - GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' 對16S rRNA 的V3～V4 區進行擴增，將擴增產物回收純化后，送至上海派森諾生物科技股份有限公司的Illumina MiSeq平臺進行高通量測序。

1.4.6 數據處理

利用SPSS 23.0 對數據進行統計分析，數據以平均值±標準差的形式表示，不同處理之間采用單因素方差分析（P＜0.05）和方差齊性檢驗。使用QIIME 軟件和R軟件分析土壤微生物多樣性，利用分類操作單元（OTU）表計算根際土壤微生物群落的α 多樣性分析指數。利用GraphPad Prism 8 制圖，Origin 2019b 進行主成分分析（PCA）。

2 結果與分析

2.1 蚯蚓對油菜生物量及富集銻能力的影響

添加蚯蚓使油菜的生物量和銻含量均顯著增加（表2）。與空白對照（N、F）相比，添加銻（NSb 和FSb）處理的油菜干質量均顯著下降（P＜0.05）。加入蚯蚓（NESb 和FESb）處理中的油菜干質量較未加蚯蚓（NSb 和FSb）處理顯著提高（P＜0.05），分別增加了59.84%和81.25%。NSb 處理中油菜對銻的平均吸收量顯著高于FSb 處理（P＜0.05），但兩處理富集系數之間無顯著差異。添加蚯蚓處理中油菜對銻的吸收量均分別高于相對應的未添加蚯蚓處理，NESb 處理中南油雜1號對銻的平均吸收量達到358.30 mg·kg-1，顯著高于其他處理（P＜0.05），富集系數也呈現同一趨勢。結果表明，油菜品種南油雜1 號對銻的富集能力要高于灃油958，蚯蚓可以提高油菜的生物量以及銻的富集量。

表2 不同處理的油菜生物量及其對銻的富集能力Table 2 Biomass and enrichment coefficient of oilseed varieties under different treatments

2.2 蚯蚓和油菜對銻污染土壤理化性質和酶活性的影響

由表3可知，根際土pH 范圍為7.96～8.45，呈弱堿性，其中FESb 處理的pH 最大，顯著高于其余各處理（P＜0.05）。NSb和FSb處理中土壤全鉀和速效鉀含量顯著高于對照處理（P＜0.05）。培養周期內，蚯蚓的加入（NESb 和FESb）提高了有機質、全磷、速效鉀的含量，有機質含量分別達到28.36 g·kg-1和28.14 g·kg-1，顯著高于未加蚯蚓處理，但兩個油菜品種間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同處理油菜根際土壤的理化性質Table 3 Physicochemical properties of oilseed rhizosphere soil under different treatments

如圖1 所示，銻和蚯蚓對油菜根際土壤的過氧化氫酶、蔗糖酶、中性磷酸酶、脲酶活性影響作用有差異。添加銻后，NSb、FSb 處理中土壤過氧化氫酶、蔗糖酶（除FSb 處理）和脲酶活性顯著降低（P＜0.05），NSb 處理中的中性磷酸酶活性較N 處理增加了2%，兩者之間差異不顯著（P＞0.05）。蚯蚓顯著提高了兩種油菜根際土壤中的過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性（P＜0.05），最大激活率分別為13%～31%、15%～48%和24%～44%。

圖1 蚯蚓和油菜對銻污染土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、中性磷酸酶、脲酶活性的影響Figure 1 Effects of earthworm and oilseed on catalase，invertase，neutral phosphatase，and urease activity in antimony contaminated soil

通過冗余分析探究土壤酶和土壤理化性質間的關系，結果見圖2。第一軸解釋了所有信息的53.57%，第二軸解釋了26.66%，累計解釋信息量為80.23%。土壤酶活性與土壤理化性質的關系主要由第一軸決定，全磷、全氮、堿解氮是影響土壤酶活性變化的重要因子。未添加蚯蚓的處理（N、NSb、FSb）主要分布在RDA1 負方向，添加蚯蚓的處理分布在RDA1 正方向。中性磷酸酶和過氧化氫酶位于第一象限，與全磷、全氮和pH 方向相同且夾角較小，均呈正相關關系，與土壤中銻含量呈負相關關系。脲酶和蔗糖酶位于第四象限，與有機質、堿解氮、富集系數方向相同，呈正相關關系。

圖2 土壤酶活性與環境因子的冗余分析Figure 2 Redundancy analysis for environmental factors associated with soil enzymatic activities

2.3 蚯蚓和油菜對銻污染根際土壤細菌群落多樣性的影響

2.3.1 樣品中所含OUT數目分析

以97%相似性水平劃分標準OTUs，對6 組處理獨有的OTUs 和組間樣品共有的OTUs 進行韋恩圖分析（圖3）。6 組處理根際土壤共有OTUs 數1 471 個，低于各處理獨有的OTUs，分別占處理N、F、NSb、FSb、NESb 和FESb 細菌總OTUs 數目的27.53%、26.04%、31.17%、29.27%、29.71%和29.38%，說明油菜根際細菌群落在銻和蚯蚓的外界擾動下，其組成仍保持了一定的相似性。

圖3 不同處理中根際土壤細菌群落的OTUs數目韋恩圖Figure 3 Venn diagram of OTUs numbers of bacterial communities of oilseed rhizosphere soil under different treatments

2.3.2 油菜根際土壤細菌α多樣性分析

不同處理油菜根際細菌群落豐富度指數和多樣性指數分析結果見表4。蚯蚓和銻對根際土壤細菌群落多樣性具有一定的影響，但處理間差異均不顯著（P＞0.05）。所有處理的Good's coverage 指數均超過了0.973，表明測序結果能完整反映各處理根際土壤微生物群落組成信息。N 處理的Chao1、Pielou's evenness、Shannon、Simpson 指數均高于其他處理，分別達到4 835.8、0.916 2、11.026 和0.999 1，F 處理的Good's coverage 指數高于其他處理，表明銻脅迫下添加蚯蚓會降低油菜根系細菌群落的多樣性。

表4 不同處理對細菌群落α多樣性的影響Table 4 Effects of different treatment on α diversity of bacterial community

2.4 蚯蚓和油菜系統對銻污染根際土壤細菌群落結構的影響

2.4.1 油菜根際土壤細菌群落組成的差異分析

在門水平上（圖4a），相對豐度排在前10 的菌門從大到小排列為Proteobacteria（變形菌門）＞Actinobacteria（放線菌門）＞Acidobacteria（酸桿菌門）＞Chloroflexi（綠彎菌門）＞Bacteroidetes（擬桿菌門）＞Gemmatimonadetes（芽孢桿菌門）＞Firmicutes（厚壁菌門）＞Rokubacteria（棒狀桿菌門）＞Cyanobacteria（藍細菌門）＞Verrucomicrobiota（疣微桿菌門）。與對照相比，添加銻主要降低了油菜根際土壤Actinobacteria、Chloroflexi 和Acidobacteria 的相對豐度，提高了Proteobacteria、Firmicutes 和Rokubacteria 的相對豐度。進一步添加蚯蚓后，根際土壤中Actinobacteria、Proteobacteria和Acidobacteria 的相對豐度降低，Bacteroidetes、Cyanobacteria和Chloroflexi的相對豐度增加。

圖4 不同處理在門水平的細菌群落結構Figure 4 Bacterial community structure of different treatments at the phyla level

為了進一步比較樣本間的物種組成差異，明確各樣本的物種豐度分布趨勢，將相對豐度排名前20 的微生物的豐度值繪制熱圖進行物種組成分析（圖4b）。在門水平下，6個樣品聚合為3類。施加銻處理的NSb、FSb處理聚為一類，銻加入影響了油菜根際土的微生物群落結構。添加蚯蚓處理后的樣品NESb、FESb 處理聚為一類，說明蚯蚓進一步改變了銻脅迫下油菜根際土壤細菌的群落組成分布。

從根際土壤的細菌群落中選取相對豐度均存在顯著富集的物種進行細菌群落組成差異分析，由圖5可知，從門水平到屬水平各個分類單位設定線性判別分析（LDA）閾值為2。N 處理存在顯著富集的物種有Subgroud_17、Oligoflexus和Candidatus_Chloroploca，F處理下顯著富集的物種有Xanthobacteraceae、Roseiflexaceae、Ilumatobacteraceae和Terrabacter。NSb 處理存在顯著富集的物種有Rhodobacteraceae、211ds20。FESb處理下存在顯著富集的物種是Truepera、Pseudarthrobacter等。NESb處理下達到顯著富集的物種有16種，歸屬于Actinobacteria 的Micrococcaceae，歸屬于Bacteroidetes 的Flavobacterium，歸屬于Verrucomicrobia 的Verrucomicrobiaceae，以及Bdellovibrio、Candidatus Nucleicultrix、Prosthecobacter、Thermomonas和Candidatus Pacebacteria。

圖5 不同處理土壤細菌群落相對豐度差異物種條形圖Figure 5 Bar graph of species with different relative abundance of soil bacterial communities under different treatments

2.4.2 油菜根際土壤細菌群落組成與環境因子的關系

對根際土壤細菌群落相對豐度排名前10 的菌門和土壤環境因子進行相關性熱圖分析（圖6）。排名前10 的優勢菌門中有5 個優勢菌門豐度與土壤環境因子呈顯著相關，Actinobacteria 和Acidobacteria 與土壤環境因子主要呈負相關關系。Actinobacteria 與速效鉀和有機質呈極顯著負相關（P＜0.01），Acidobacteria 與中性磷酸酶和全磷呈極顯著負相關（P＜0.01）。Proteobacteria 與堿解氮、速效鉀、有機質、土壤銻含量和富集系數呈極顯著正相關（P＜0.01），Bacteroidetes與過氧化氫酶、脲酶呈極顯著相關（P＜0.01），Firmicutes 與全鉀呈極顯著正相關（P＜0.01）。銻脅迫下，添加蚯蚓提高了土壤中Bacteroidetes 的相對豐度以及土壤酶中的脲酶和過氧化氫酶的活性，同時在提升Proteobacteria 的相對豐度時促進了土壤養分的轉化。

圖6 土壤環境因子與根際細菌群落組成相關性熱圖Figure 6 Correaltion heatmap between soil physicochemical proproties and bacterial community compositions

2.4.3 油菜根際土壤細菌群落組成與環境因子的主成分分析

對表征土壤特性的土壤養分、酶活性和細菌群落因子進行主成分分析，結果見圖7。主坐標的前兩軸總共解釋了所有信息的54.33%（PC1和PC2分別解釋了36.04%和18.29%的信息）。PC1 主要綜合了速效鉀、全鉀、土壤銻含量、富集系數、Proteobacteria、Actinobacteria 的信息，即PC1 正方向與土壤的污染程度有關，PC1 負方向與微生物群落有關，PC2 綜合了過氧化氫酶、脲酶、中性磷酸酶、全磷、全氮的信息，與土壤酶活性及養分轉化有關。

圖7 細菌群落結構、土壤養分和酶活性的主成分分析Figure 7 Principal component analysis of bacterial community structure，soil nutrients and enzyme activity under different treatments

6 組樣品分布在不同區域，處理間樣點離散程度較大。N、F處理聚集在主坐標第一軸的左側，添加銻的處理位于PC1 正方向。N、F 樣點與Actinobacteria豐度、Chloroflexi 豐度、Shannon 指數、Simpson 指數之間夾角較小，說明在未受銻脅迫的自然環境中，南油雜1號和灃油958根際土壤的特性中主要的差異來自微生物群落結構及多樣性。NSb、FSb 樣點位于第四象限，在速效鉀、全鉀、土壤銻含量上載荷量較高，表明酒石酸銻鉀作為外源銻污染物添加后，土壤中鉀、銻含量以及Proteobacteria 豐度增加，Actinobacteria、Chloroflexi豐度減少。NESb、FESb樣點聚集在第一象限，與未添加蚯蚓的NSb、FSb 樣點在PC2 上分異明顯，其中過氧化氫酶、脲酶、中性磷酸酶有較高的載荷，說明蚯蚓添加主要影響銻污染土壤中酶的活性。

3 討論

3.1 銻污染土壤中添加蚯蚓對油菜生長和富集的影響

南油雜1 號中富集銻的含量及富集系數均顯著高于灃油958（P＜0.05）（表2）。不同品種油菜對同種重金屬的積累能力差異較大，部分甘藍型油菜品種對鎘的積累能力主要受從根到地上部的轉運過程影響[17]。重金屬積累是多細胞、多組織和多器官協同作用的復雜生理過程[18]。韌皮部運輸是水稻籽粒中鎘的主要運輸途徑，大于90%的鎘來自韌皮部運輸[19]。銻在油菜中的富集轉運機理還鮮有報道，下一步可利用南油雜1號開展銻累積特性的分子機制研究。

添加蚯蚓使銻脅迫下油菜的生物量和銻富集系數均有顯著增加，表明蚯蚓可促進油菜生長和增進土壤銻向油菜體內轉移。研究表明，接種蚯蚓后印度芥菜地上部生物量增加了22.6%～88.6%，并顯著促進了植株地上部鋅和鉛的積累[20]。環境中銻主要以Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）兩種無機態形式存在，Sb（Ⅲ）比Sb（Ⅴ）更容易吸附在金屬或礦物的表面并固定，其有效性降低，而Sb（Ⅴ）的溶解性較強，Sb（Ⅲ）的氧化對銻的移動起著至關重要的作用[21]。蚯蚓主要通過排泄蚓糞及挖掘活動形成的蚓穴影響土壤結構，增加土壤團聚體及孔隙度[22]。蚯蚓擾動形成的好氧環境，促進了Sb（Ⅲ）氧化成Sb（Ⅴ），增加了銻的移動性[23]，這可能是蚯蚓促進銻從土壤向油菜轉移的因素之一，當然這其中的驅動因子還不明確。

3.2 銻污染土壤中添加蚯蚓對土壤養分的影響

蚯蚓作為“生態系統的工程師”，在農田生態系統中起著改善土壤物理結構、調節土壤pH、破碎粗有機物、促進養分循環等的作用[24-25]。本試驗中，添加蚯蚓顯著增加了銻脅迫下土壤有機質的含量。其原因可能是由于當銻含量達到2 000 mg·kg-1時，銻對蚯蚓產生了一定的毒性效應，蚯蚓死亡率達28.25%～30.00%，死亡的蚯蚓經微生物分解增加了土壤有機質含量[26]。銻含量偏高對蚯蚓活性產生一定的抑制作用，減少了土壤有機質的消耗。再者，蚯蚓吞吐過程形成的微團粒結構，使有機碳得到保存，并未引起顯著的激發效應，使有機碳礦化和固存作用之間的平衡沒有被打破[27-28]。后期試驗中，應考慮降低銻含量，明確中低污染農田中蚯蚓-植物聯合修復效果。

本試驗結果顯示，添加蚯蚓顯著增加了銻脅迫下南油雜1 號根際土壤中堿解氮和全磷的含量。諸多研究結果表明，蚯蚓能夠影響土壤氮素循環，促進土壤有機氮的礦化過程，使礦質氮、NO-3和微生物量氮含量均提高[29]。蚯蚓可以增加土壤的生物有效態磷含量[30]，主要途徑是通過促進磷酸酶的活性而間接改變土壤磷形態，提高磷活性[31]。

3.3 銻污染土壤中添加蚯蚓對土壤生物特性的影響

土壤酶在維持土壤健康和養分循環方面發揮著重要作用，可以作為衡量土壤質量的生物指標[32]。蚯蚓提高了過氧化氫酶、蔗糖酶、中性磷酸酶和脲酶活性（圖1），且過氧化氫酶與銻含量呈顯著負相關，蔗糖酶與有機質呈顯著正相關，中性磷酸酶與全磷呈正相關，脲酶與全氮和堿解氮呈正相關（圖2）。

過氧化氫酶活性能在一定程度上反映重金屬的污染程度，與土壤銅和鋅含量呈顯著性負相關[33]。赤子愛勝蚓屬于表棲型蚯蚓，主要以地表的枯枝落葉和腐殖質為食，能刺激與土壤碳循環緊密聯系的蔗糖酶的活性，進而促進蔗糖水解產生更易被吸收的葡萄糖和果糖，在可溶性營養物質的生產中發揮著重要作用[34]。脲酶與氮循環有關，能夠催化尿素分解生成氨、二氧化碳和水，為植物提供氮素營養，與有效氮含量密切相關[35]。因此，蚯蚓改善了土壤質量，在銻脅迫下促進了油菜根際土壤養分的轉化，從而提高了土壤酶活性。

重金屬在土壤中的積累會造成土壤中原始微生物群落結構的改變，使得土壤肥力和質量降低，土壤中微生物的多樣性減少[36]。也有研究表明，重金屬污染對土壤微生物群落結構影響較小[37]。蚯蚓通過蚓觸圈，對有機殘留物和礦質土壤進行攝取和擾動，可直接影響生態系統的結構和功能，改變土壤的結構及特性，進而影響土壤細菌群落的組成[38]。蚯蚓增加土壤中細菌數量造成優勢菌群豐度變化的原因可能是蚯蚓選擇性吞食菌種以及腸道環境對微生物的刺激作用[39]。

銻添加提高了油菜根際土壤中Proteobacteria 的豐度，且土壤中銻含量與Proteobacteria 呈極顯著正相關（P＜0.01），表明銻污染土壤中，Proteobacteria 耐性較強，這與前人研究結果一致[40]。Proteobacteria 是土壤圈層中相對豐度最高的一類細菌，攜帶有大量關于DNA 修復和重金屬抗性的基因，是最耐脅迫的細菌[41]。研究證實，在銻礦場篩選出的8 株耐銻細菌均來自Proteobacteria，其可將Sb（Ⅲ）氧化為Sb（Ⅴ）從而降低土壤毒性[42]，變形菌門中的α-、β-和γ-變形菌綱細菌也可將與銻同主族的As（Ⅲ）氧化為As（Ⅴ），從而降低砷的有效性[43]。

蚯蚓未改變銻脅迫下油菜根際土壤中優勢菌門的組成，而主要影響其豐度占比，增加了Bacteroidetes、Cyanobacteria 和Chloroflexi 的豐度。Bacteroidetes含有較多的重金屬抗性和還原基因，適應性較強[44]。在重金屬復合污染土壤中，蚯蚓腸道微生物中Bacteroidetes 豐度達到18.8%[45]。歸屬Bacteroidetes 的Sphingobacterium屬已被證明與超富集植物東南景天聯合可有效修復鎘污染土壤[46]。圖5 中，添加蚯蚓后（NESb），南油雜1 號根際土壤微生物群落中歸屬于Bacteroidetes 的Flavobacterium豐富度顯著高于其他處理（P＜0.05），這與相關研究結果一致[47]。Flavobacterium是蚯蚓腸道中重要的反硝化細菌，能促進氮循環中N2O 的釋放[48]。Bacteroidetes 與土壤脲酶呈極顯著正相關（P＜0.01，圖6）。因此，銻脅迫下蚯蚓對土壤氮素循環相關酶和微生物的作用，及其對銻脅迫的響應機制應引起關注。

4 結論

（1）銻污染土壤中，添加蚯蚓可以提高油菜的生物量并促進其對銻的富集。

（2）銻能顯著降低油菜根際土壤中過氧化氫酶、中性磷酸酶、脲酶的活性，提高Proteobacteria、Firmicutes 和Rokubacteria 的豐度；添加蚯蚓可以促進銻脅迫下油菜根際土壤養分循環，提高土壤酶活性，增加Bacteroidetes、Cyanobacteria和Chloroflexi的豐度。

（3）從土壤生態的角度初步得出，蚯蚓-油菜聯合能降低農田土壤中銻的含量，起到一定生態修復的效果，且南油雜1號的修復潛能大于灃油958。