高溫持續時間對雞糞堆肥中多重耐藥菌、接合型質粒及耐藥基因消減特征的影響

尹天奇，孫興濱，高浩澤，申磊，姜欣然，郭雅杰，王旭明，仇天雷*

（1.東北林業大學林學院，哈爾濱 150040；2.北京市農林科學院北京農業生物技術研究所，北京 100097；3.廊坊師范學院，河北 廊坊 065000）

21 世紀以來，抗生素耐藥性嚴重威脅著全球人類的健康，美國每年約有2.3 萬人因感染抗生素耐藥細菌而死亡[1]。據WHO 預測，到2050 年因抗生素耐藥性的全球死亡人數將達到1 000 萬[2]。畜禽養殖業的抗生素使用量是人類醫療使用量的兩倍[3]，多重耐藥菌在畜禽糞便中的檢出率越來越高[4]，因而畜禽糞便是環境中耐藥細菌和抗生素耐藥基因（Antibiotic resistance gene，ARGs）的重要來源[5]。耐藥細菌和ARGs會隨畜禽糞便排出后通過有機肥料或者土壤傳播到環境中，再通過食物鏈傳播到人體，對人類健康造成潛在威脅[6]。

高溫堆肥是畜禽糞便無害化處理的有效途徑，堆肥過程中溫度、微生物群落組成、理化性質等都能夠影響ARGs 的豐度[7]，尤其是堆肥的高溫對于畜禽糞便中ARGs 的消減十分重要。當堆肥進入高溫期后，ARGs 豐度會出現明顯下降，同時也能有效降低基因水平轉移的風險[8]，但Liao 等[7]，Sardar 等[9]發現部分基因的相對豐度在高溫期結束后出現了增長趨勢，而該增長與ARGs 的宿主菌在降溫期的增長密切相關。近期有研究發現延長堆肥高溫持續時間能夠提高抗生素的降解效率，且持續的高溫處理也能夠顯著降低堆肥產品中部分ARGs的相對豐度[10]。延長堆肥高溫持續時間能否有效控制耐藥菌及其ARGs 在堆肥降溫期的反彈是改進現有堆肥工藝和有效控制ARGs水平轉移的關鍵問題。因此，本研究設置延長高溫時間（CT）和常規堆肥（NT）兩種雞糞堆肥處理，同時在堆肥原料中外源添加攜帶接合型耐藥質粒的多重耐藥大腸桿菌，利用選擇性培養、數字PCR 以及16S rRNA 基因擴增子測序技術，分析延長高溫時間對多重耐藥大腸桿菌及其接合型質粒與ARGs 的消減規律的影響，同時解析兩種堆肥方式對定量ARGs 相關宿主菌群演替規律的影響，以期為更好地利用堆肥技術控制畜禽養殖糞便中的ARGs 污染，阻控其在相關環境內的傳播奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 堆肥系統和原料

堆肥試驗在6 臺50 L 臺式圓柱形不銹鋼堆肥反應器中進行，反應器底部連接氣泵，通過氣體流量計可控制通風供氧速率。反應器內溫度主要采用外圍電阻控制加溫。同時，設有多個傳感器和智能監測系統，可實時監測反應器內部多點溫度、壓力、氣流等。

堆肥原料由雞糞和玉米秸稈粉（粒徑為2～3 cm）組成，均取自北京市平谷區某蛋雞養殖場。將雞糞和玉米秸稈按5∶1 質量比例混合，混合均勻后加水調節含水率至60%。用五點取樣法取出14 kg混合物加入大腸桿菌XT13A1 菌液攪拌均勻，XT13A1 菌株分離自養殖場雞糞，其攜帶接合型轉移質粒攜帶有Ⅰ類整合子-整合酶基因（intl1，簡稱為Ⅰ類整合酶基因）、代表接合型質粒的轉移酶基因MOBP、氨基糖苷類耐藥基因APH（3）-Ib及磺胺類耐藥基因sul2[11]，使其終濃度達到4.77×107CFU·g-1，使用透水透氣的尼龍隔離網袋（長40 cm，寬30 cm 米，孔徑2 mm）分裝成7 袋（2 kg·袋-1）。

1.2 堆肥試驗設計

本次堆肥歷時40 d，試驗設置兩個處理組，分別為常規堆肥組（NT）和延長高溫時間組（CT），每個處理組設3 個重復。NT 組0～27 d 進行自然堆肥過程，CT 組0～11 d 自然堆肥，12～27 d 設置溫度55 ℃，延長堆肥高溫期。堆肥過程中曝氣速率保持在0.05 L·（min·kg）-1。6 臺堆肥反應器中分別加入27 kg 堆肥原料混合物，堆體內部埋入尼龍隔離網袋樣品，保證其與反應器內未加菌堆體隔離。同時反應器外放置一個網袋，不參與堆肥過程（CK 組）。分別在堆肥的第0、4、11、27、40 天進行翻堆混勻并采集網袋內樣品，樣品命名分別為：第0 天取樣（初始物料）、第4 天CT 取樣（CT-高溫期）、第4 天NT 取樣（NT-高溫期）、第4 天CK 取樣（CK-前期）、第11 天NT 取樣（NT-高溫期結束）、第27 天CT 取樣（CT-高溫期結束）、第27天NT取樣（NT-腐熟期結束）、第27天CK 取樣（CK 后期）、第40天CT取樣（CT-腐熟期結束）。采集樣品后在24 h內進行總菌和耐藥菌的計數，另一部分于-20 ℃保藏，用于樣品DNA提取和數字PCR實驗。

1.3 總菌及多重耐藥菌計數

稱取10 g 堆肥樣品，倒入已滅菌的90 mL 生理鹽水三角瓶中，搖床振蕩15 min 使堆肥樣品均勻分散，吸取懸浮液進行梯度稀釋。稀釋液涂布對應培養基：細菌總數采用普通LB 營養瓊脂固體培養基，多重耐藥菌的計數采用添加抗生素的LB 固體培養基，每組3 個重復。添加的抗生素包括四環素（16 μg·mL-1）、恩諾沙星（1 μg·mL-1）、磺胺甲噁唑（76 μg·mL-1）、泰樂菌素（1μg·mL-1）、慶大霉素（20μg·mL-1）。抑菌濃度參考2011 年美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）規定值[12]。涂布后平板倒置于28 ℃恒溫箱中，培養48 h，選取菌落數為30～300 的平板進行計數，刮取菌體于保藏-80 ℃。

1.4 DNA提取及數字PCR定量檢測

1.4.1 多重耐藥細菌DNA提取及測序

使用TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒，從多重耐藥菌混菌中提取細菌DNA，經檢測后送往上海美吉生物科技有限公司進行16S rRNA基因擴增子測序。

1.4.2 耐藥基因引物設計與數字PCR定量檢測

根據多重耐藥大腸桿菌XT13A1 的基因設計腸桿菌16S rRNA 基因特異性引物；同時，根據耐藥菌攜帶的質粒序列，設計Ⅰ類整合子-整合酶基因（intl1，簡稱為Ⅰ類整合酶基因）、大腸桿菌16S rRNA基因、代表接合型質粒的轉移酶基因的MOBP基因、氨基糖苷類耐藥基因APH（3）-Ib及磺胺類耐藥基因sul2對應的Taqman探針引物。intl1和細菌16S rRNA基因引物參照文獻[13]。數字微滴式PCR 反應在QX200 Droplet Digital PCR Systems 中完成，選用Trans PCR SuperMix，反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30 個循環；72 ℃延伸5 min。引物名稱及引物序列見表1。

表1 引物名稱及引物序列Table 1 Primer and primer sequences

1.5 數據統計分析

利用軟件Origin（v9.6.5）進行試驗數據的整理和作圖。根據時間與定量基因相對豐度變化，進行非線性回歸分析，使用一級動力學反應方程對試驗數據進行擬合，方程如下：式中：C為t時基因的相對豐度，copies·16S rDNA copies-1；C0為堆肥開始時基因的相對豐度，copies·16S DNA copies-1；k為耐藥基因消減速率常數，d-1。

對于不符合一級動力學反應方程的基因運用R語言ggmisc包進行分段線性回歸分析。

2 結果與討論

2.1 高溫堆肥過程中溫度變化

溫度是判斷堆肥過程的重要參數[14]。根據溫度變化曲線圖（圖1）可以看出，CK處理組始終保持室溫28～29 ℃左右，NT和CT處理組都經歷了升溫期、高溫期和腐熟期3 個典型階段。堆肥初期升溫較快，約1 d 的時間升至50 ℃以上。NT 處理組的高溫階段持續到第11天，最高溫度為59.7 ℃，從第12天開始逐步下降至室溫，第27 天完成堆肥發酵過程。CT 處理組通過額外的加熱控制系統延長高溫期，12～27 d 溫度始終保持55 ℃左右。27 d 后溫度開始逐步下降至室溫，第40天完成發酵過程。

圖1 不同處理組溫度變化趨勢Figure 1 Temperature variation trend of different treatment groups

2.2 高溫堆肥過程中細菌總數及多重耐藥菌數的變化

如表2所示，在整個堆肥過程中，NT和CT組的總菌數變化趨勢相同，CT 組總菌數從初始的（4.0±0.30）×108CFU·g-1降低到（3.2±0.35）×106CFU·g-1，降低了2 個數量級，消減率為99.2%；NT 組總菌數從初始的（4.0±0.30）×108CFU·g-1降低到（1.1±0.41）×108CFU·g-1，消減率為72.5%。CK 組總菌數從前期（7.7±0.25）×108CFU·g-1增長到后期的（9.2±0.46）×108CFU·g-1，增長率為16.3%。由此可見，對比不參與堆肥的CK 組，堆肥可以有效降低總菌數，這與姜欣然等[11]的堆肥模擬實驗結果相類似。

表2 總菌數和多重耐藥菌數量變化Table 2 Changes in the number of multidrug-resistant bacteria and total bacterial count

初始物料中多重耐藥菌數量為（9.2±0.35）×107CFU·g-1，在第4天CK組多重耐藥菌數量減少到（2.9±0.12）×106CFU·g-1；而處于堆肥高溫期的NT 組和CT組都未檢出，說明堆肥高溫可以有效滅活原料中的多重耐藥菌，可以降低耐藥致病菌隨有機肥進入土壤的風險[15]。然而，王瑤等[16]發現堆肥后豬糞中紅霉素、金霉素等抗生素耐藥菌均能夠在堆肥后繼續存活，說明多重耐藥菌比單一耐藥菌更易被堆肥高溫滅活。然而在第27天NT組（NT-腐熟期結束）又有多重耐藥菌的出現，而延長高溫的CT 組即使在腐熟期結束后都始終沒有多重耐藥菌被檢出，這說明了延長高溫后能夠明顯抑制多重耐藥菌的反彈。

2.3 多重耐藥菌群落組成變化分析

收集初始物料、NT-腐熟期結束、CK 的前期和后期樣品中的多重耐藥菌并進行16S rRNA 擴增子測序，共獲得有效序列168 327 條，平均序列長度424 bp，共有239 個OTU。從圖2 可以看出，由于在第0 天初始樣品中添加大腸桿菌XT13A1，所以初期Escherichia占絕對優勢，相對豐度達到99.9%。從圖中可以看出，CK 前期樣品中可能由于多重耐藥質粒向其他細菌進行了轉移，導致物種多樣性相比原始物料明顯增多，從組成分析可以看出主要有norank_f__Sphingobacteriaceae（8.99%）、Halomonas（8.89%）、Ulvibacter（6.81%）和norank_f__Xanthomonadaceae（5.62%）。然而在CK 后期樣品中多重耐藥菌種類明顯減少，主要以Glutamicibacter（51.9%）為優勢屬，其次為Pseudomonas（23.3%）、Paenalcaligenes（16.39%）。該結果可以說明即使未進行堆肥，該耐藥質粒也會隨時間的延長而在缺少抗生素環境壓力的情況下被淘汰，導致整體菌群的多重耐藥性下降。堆肥腐熟期結束后的NT 樣品中Paenalcaligenes占明顯優勢，相對豐度為96.87%，其次是Pusillimonas占3.70%。但這兩種菌屬在第0 天的檢測中幾乎沒有。出現這種結果可能與ARGs 的轉移作用有關。一種可能是水平轉移作用由于人為添加的多耐藥菌株XT13A1所攜帶的多耐藥質粒接合轉移到了其他耐熱菌屬，從而導致多重耐藥菌在堆肥結束后有所增長[17]。另一種可能為堆肥高溫會阻斷多重耐藥菌的水平轉移作用，但Paenalcaligenes和Pusillimonas多重耐藥菌屬本身就有這類多重耐藥ARGs，由于耐受高溫而在堆肥過程出現了富集，即垂直傳播。因此，我們進一步對多重耐藥菌及其質粒上攜帶的ARGs 進行了定量分析，解析不同傳播特征的ARGs 在堆肥過程中的消減規律。

圖2 多重耐藥菌菌群在屬水平上的分布Figure 2 Distribution of multidrug-resistant bacterial flora at the genus level

2.4 堆肥過程中耐藥基因相對豐度的變化

ARGs的相對豐度通常表征菌群中相應耐藥水平的高低[18]。堆肥過程中，耐藥基因、Ⅰ類整合子和代表型接合質粒的相對豐度和削減率的關系如圖3 所示，從圖3 可以看出，在堆肥過程中，腸桿菌特異的16S rRNA基因和代表多重耐藥質粒的（MOBP基因）消減良好。腸桿菌16S rRNA基因在CT 組的相對豐度從初始原料中的8.61×10-3copies·16S rDNA copies-1降低到堆肥腐熟期結束時的1.53×10-5copies·16S rDNA copies-1，消減率為99.80%。在NT 組相對豐度從初始原料中的7.06×10-3copies·16S rDNA copies-1降低到1.47×10-5copies·16S rDNA copies-1，消減率為99.79%。MOBP基因CT 組中相對豐度從初始原料中的6.04×10-4copies·16S rDNA copies-1降低到腐熟期結束時的4.66×10-7copies·16S rDNA copies-1，消減率為99.92%；NT 組中相對豐度從初始原料中的5.16×10-4copies·16S rDNA copies-1降低到9.78×10-7copies·16S rDNA copies-1，消減率為99.81%，說明堆肥對于添加的多重耐藥菌及質粒均有良好的消減效果。

圖3 堆肥不同時期耐藥基因、Ⅰ類整合子和代表型接合質粒的相對豐度和消減率Figure 3 Relative abundance and reduction rate of drug resistance genes，and I integron-integratase gene representative conjugation plasmids in compost at different periods

雖然大腸桿菌及耐藥質粒的代表基因均出現明顯下降，但同為多重耐藥菌攜帶的APH（3）-Ib、sul2和intl1三種耐藥基因的相對豐度卻未出現持續下降，尤其在NT 組，反而隨著堆肥高溫期結束而逐漸升高。從圖3 可以看出在CT 組中，APH（3）-Ib、sul2和intl1在高溫期結束時相對豐度明顯降低，經歷腐熟期后，相對豐度幾乎不變。由于代表接合型耐藥質粒的基因有明顯下降，說明這三種基因傳播的增長不會來自于接合轉移的水平轉移作用，而可能通過耐藥基因隨宿主增長的垂直傳播作用，因此延長高溫的堆肥時間是能夠有效抑制耐藥基因的垂直傳播作用。具體來說，在CT 組中，APH（3）-Ib基因的相對豐度從初始物料1.55×10-3copies·16S rDNA copies-1下降到1.53×10-4copies·16S rDNA copies-1，消減率為90.18%；sul2基因的相對豐度從初始物料1.09×10-2copies·16S rDNA copies-1下降到0.14×10-2copies·16S rDNA copies-1，消減率為87.19%。Qian 等[19]也發現延長高溫持續時間可以使sul2基因的相對豐度較常規堆肥大幅下降。intl1從初始物料1.28×10-2copies·16S rDNA copies-1下降到0.26×10-2copies·16S rDNA copies-1，消減率為79.7%。但是在NT 組中，三種基因在高溫期結束時的相對豐度與和CT 組相比都存在顯著差異，APH（3）-Ib基因和sul2高溫期結束時相對豐度分別為9.01×10-1copies·16S rDNA copies-1和1.25×10-2copies·16S rDNA copies-1，相比初始物料都有所上升。Sardar 等[9]的牛糞玉米秸稈的堆肥實驗后期sul1基因相對豐度也出現了升高的現象。初始物料中intl1相對豐度為2.05×10-2copies·16S rDNA copies-1，在高溫期結束后相對豐度較初始物料變化較小，但是在腐熟期結束后增長到4.21×10-2copies·16S rDNA copies-1。綜合可培養耐藥菌及ARGs 的結果表明，由于延長高溫持續時間，CT 組中耐藥基因在消減后沒有出現明顯上升；但是NT 組在高溫期結束后，攜帶ARGs 的細菌獲得恢復生長，導致相應ARGs相對豐度增加。

2.5 堆肥過程中耐藥菌及耐藥基因的消減動力學分析

為研究堆肥過程中耐藥菌及其ARGs 消減速率特征，按堆肥時間對堆肥過程中ARGs 相對豐度數據進行擬合。首先對堆肥中的5種ARGs相對豐度進行非線性數據擬合，對比擬合曲線的決定系數（R2，表3）發現，腸桿菌特異的16S rRNA基因和質粒MOBP基因消減規律符合一級動力學方程（R2值均大于0.99），而sul2、intl1和APH（3）-Ib消減規律并不符合一級動力學方程。腸桿菌特異的16S rRNA基因的CT 組擬合曲線，消減速率常數為0.192，半消減期3.61 d。NT組消減速率常數為0.237，半消減期2.92 d，兩者在15 d 內相對豐度分別降低到3.931×10-5copies·16S rDNA copies-1和4.860×10-5copies·16S rDNA copies-1。說明常規堆肥能夠在15 d內對腸桿菌產生有效消減，這與前期堆肥的模擬研究結果一致[20]。MOBP在CT組中消減速率常數為0.277，半消減期2.50 d；NT 組中消減速率常數為0.241，半消減期為2.87 d。兩個處理中半消減期均小于3 d，且消減速率都快于腸桿菌，說明在堆肥高溫環境下，多耐藥質粒的穩定性差于腸桿菌，更容易丟失[21]。消減規律符合一級動力學方程說明，堆肥使得多重耐藥菌以及質粒的比例以穩定速率減少，即達到一定高溫時間后污染物可被消除。然而，另一方面為質粒攜帶的APH（3）-Ib、sul2和intl1基因的消減規律并不符合一級動力學方程，主要原因是三者在高溫期結束后（尤其是NT組）會出現明顯的相對豐度反彈，由于質粒代表序列未出現同步反彈，此時增長的部分是與添加質粒無關的堆肥原料糞污所貢獻，說明能夠耐受高溫的堆肥土著菌的垂直傳播作用更為占優勢，使得相關ARGs出現反彈[22]。

表3 堆肥中基因相對豐度的消減速率和半消減期Table 3 Dissipation rate and elimination half-life of ARGs in compost based on relative abuandance

采用分段法對APH（3）-Ib、sul2和intl1等三種不符合一級動力學的ARGs 相對豐度進行線性直線回歸分析（圖4）。可以看出無論CT還是NT組高溫期對三者均有一定消減效果，另外是否有額外的高溫期，對三種基因的相對豐度是否反彈影響很大。從擬合結果可以看出，第15 天后的曲線擬合結果NT 與CT組相差較大。CT 組中3 種ARGs 相對豐度在堆肥后期過程中仍以一定的速率下降，消減速率從快到慢分別為intl1（6.94×10-5）＞sul2（3.7×10-5）＞APH（3）-Ib（3.42×10-6）。在腐熟期結束后對比第0 天都有明顯的去除效果。但NT 組中APH（3）-Ib、sul2和intl1在第15 天后相對豐度都以一定的速率上升，增長速率分別為9.09×10-5、1.74×10-3、3.37×10-3，在腐熟期結束后對比原料并沒有明顯的去除效果。綜上，相關ARGs 的宿主菌并未經過堆肥高溫獲得有效去除，而是隨著高溫結束后出現了明顯富集，延長高溫持續時間對控制ARGs在腐熟期的反彈具有良好效果。

圖4 堆肥過程中不同處理組中Ⅰ類整合子和耐藥基因相對豐度消減曲線Figure 4 Relative abundance reduction curves of I integron-integratase gene and drug resistance genes in different composting groups

2.6 延長高溫持續時間對堆肥細菌群落結構的影響

微生物是影響堆肥腐熟進程的主要驅動力[23]，堆肥的高溫期能更有效地殺死細菌宿主并破壞質粒[24]。堆肥不同時期菌群在屬水平上的分布如圖5 所示，在初始物料中優勢菌屬主要是厚壁菌門中的Pseudogracilibacillus、Lactobacillus、Oceanobacillus等以及放線菌門的Corynebacterium等。在堆肥高溫期，Bacillus、Sinibacillus等耐熱或者嗜熱細菌逐漸成為優勢。Bacillus屬于厚壁菌門，厚壁菌在高溫期可以形成耐熱孢子以抵抗高溫，還可以促進堆體中有機類物質的降解[25]。但是由于CT 和NT 高溫持續時間的不同，兩組在高溫期結束時優勢菌屬也有著顯著區別，Oceanobacillus、Sinibacillus、Thermobifida、unclassified_f_Bacillaceae和Gracilibacillus等在CT 中的相對豐度都高于NT 組。其中Thermobifida的相對豐度差別最大，在CT 組中為23.91%，遠高于NT 組的0.98%，說明延長高溫時間有利于耐高溫的Thermobifida的明顯富集。Zhang 等[26]的堆肥研究中發現Thermobifida在高溫期中豐度增加了1.8倍。Halocella在兩組中的相對豐度也存在明顯差異，分別為0.67%和4.45%。Thermobacillus在NT 組中相對豐度為2.48%，但是在CT 組中只有0.29%，說明延長堆肥高溫期更有利于Halocella和Thermobacillus相對豐度的下降。在堆肥腐熟期結束時，CT 處理組中norank_f__Limnochordaceae和Thermobifida兩菌屬占比最大，分別為23.24%和21.14%。而NT 組中腐熟期結束時Moheibacter、Halomonas豐度出現明顯增長，相對豐度占比分別為10.54%和5.31%，可以看出這兩種菌群在NT-腐熟期間再次出現了富集，說明了延長高溫持續時間的CT組對Moheibacter、Halomonas等常溫菌有較好的抑制效果。

圖5 兩處理組堆肥不同時期菌群在屬水平上的分布Figure 5 Genus-level community composition heatmap of two treatment groups at different periods

2.7 細菌群落與抗性基因的相關性分析

ARGs的變化更多地取決于潛在宿主細菌的動態變化，確定堆肥過程中與ARGs 相關的潛在人類致病菌變化也具有重要意義[27]。選擇豐度前三十的菌屬與大腸桿菌16S rRNA基因、MOBP，APH（3）-Ib、sul2以及intl1基因進行相關性分析見圖6。氨基糖苷類和磺胺類抗生素是預防細菌感染和臨床中常用的抗生素類型[28]，與磺胺類耐藥基因sul2相關的菌屬有Pseudogracilibacillus、Aerosphaera、Sporosarcina等菌屬，該類微生物隨著高溫持續時間延長而得到了有效控制，CT 組四種菌屬的相對豐度均低于NT 組，分別相差0.36%、0.34%、0.041%，說明sul2基因在NT 中的增長與這些潛在宿主是直接相關的。氨基糖苷類耐藥基因APH（3）-Ib也觀察到類似的規律，與APH（3）-Ib基因相對豐度相關的菌屬有Lacobacillus、Corynebacterium、Thermobacillus，這些潛在宿主在CT 組中同樣得到顯著抑制，高溫期結束后這些菌屬的相對豐度NT 較CT 分別高出0.783%、0.749%、1.96%。與以上兩種垂直傳播的抗性基因不同，CT 組中與intl1顯著相關的Oceanbacillus、Gracebacillus、Saccharomonospora等3 個菌屬，在CT 和NT 最終堆肥產物中相對豐度組成特點各不相同，Oceanbacillus在NT中更多，Gracebacillus在兩個處理中基本沒有差異，而Saccaromonaspora在CT 組中更為豐富，可能原因是intl1為典型的基因水平轉移元件，分布更為廣泛，很難用單一或少數菌體的豐度增加或減少來關聯其潛在宿主。葡萄球菌是一種常見的病原菌，能夠引起各種類型的炎癥[29]。Duan 等[30]發現葡萄球菌與tetX、ermX等ARGs和MGEs（intl1、ISCR1）顯著相關，可能是這些ARGs和MGEs 的宿主，控制這種細菌屬可能有助于抑制ARGs 的傳播。本次實驗在CT 組中APH（3）-Ib和sul2相對豐度都與葡萄球菌屬（Staphylococcus）有關，且經過延長高溫后，葡萄球菌屬相對豐度明顯低于NT 組，說明延長高溫有利于減少APH（3）-Ib和sul2等ARGs 潛在病原菌宿主-葡萄球菌屬的相對豐度，有類似規律的還有Pseudogracilibacillus、Corynebacterium、Atopostipes等，我們在CT 組腐熟過程中并未觀察到APH（3）-Ib和sul2等基因相對豐度的明顯反彈。因此，常規堆肥不足以完全消除通過雞糞中耐藥細菌和所攜帶的ARGs，適當延長高溫持續時間可以抑制堆肥高溫期后ARGs 相關細菌的生長，這為有效抑制ARGs的腐熟期反彈提供了新思路。

3 結論

（1）延長堆肥高溫時間（15 d）能夠減少堆肥產品中細菌總數兩個數量級以上，同時也可以抑制常規堆肥高溫結束后多重耐藥菌的反彈。

（2）堆肥對于多重耐藥大腸桿菌及其接合型耐藥質粒有良好的消減效果，相對豐度消減率均達到99%以上；雖然能夠垂直傳播的APH（3）-Ib、sul2和intl1等ARGs 相對豐度會隨高溫期結束而出現增長，但延長高溫時間能夠提高堆肥過程中ARGs的消減率。

（3）堆肥中腸桿菌16S rRNA基因及其接合型質粒代表基因MOBP消減規律符合一級反應動力學方程；但APH（3）-Ib、sul2和intl1等基因相對豐度的消減動力學呈現高溫期下降、二次腐熟期上升的特點，延長高溫時間能夠顯著抑制第二階段出現的反彈。

（4）延長15 d 的高溫時間，可降低堆體中APH（3）-Ib、sul2基因的潛在宿主菌的豐度從而阻斷ARGs 垂直傳播作用，有利于減少最終堆肥產品中ARGs相對豐度。