三氯生對剩余污泥堿性發酵及微生物群落結構的影響

劉澤清，宋秀蘭，張雨青

（太原理工大學 環境科學與工程學院，山西 晉中 030600）

基于活性污泥法的污水處理工藝會產生大量剩余污泥。據統計，2020年我國城市污水處理能力約為5 472.3 km3，剩余污泥產量超過60 Mt（以含水率80%計）［1］。剩余污泥組成十分復雜，包含了眾多有機物、致病微生物、重金屬等，易對環境造成嚴重污染。厭氧發酵是應用最廣泛的剩余污泥處理處置方法之一，能有效實現污泥的減量化、穩定化［2］。由于以產甲烷為導向的厭氧發酵技術周期長（15~30 d）、經濟價值不如短鏈脂肪酸（SCFA）高，因此，基于剩余污泥的厭氧發酵產酸技術成為持續研究熱點［3］。研究表明，SCFA可作為污水處理廠良好的外加碳源，也能用于合成高附加值產品，如可生物降解塑料和生物柴油［4-5］。然而，剩余污泥整體結構復雜，胞外聚合物和半剛性的細胞壁重重包裹著污泥細胞，導致大分子有機物不易破胞溶出，限制了厭氧發酵的速率。為了提高污泥發酵產酸效率，需要對其進行預處理。通常認為，堿性條件較酸性和中性條件更適合污泥厭氧發酵產酸，它能促進污泥溶解、強化水解酸化過程［6-7］。

三氯生（TCS），廣譜抗菌劑［8］，是一種典型的內分泌干擾物質，常用于生產各種藥品和個人護理用品［9］。分散于生態環境中的TCS，經污水處理廠生化處理后最終富集于剩余污泥中，其含量可達0.028~37.189 mg/kg（以TSS計，下同）［10］。由于厭氧發酵過程包含了一系列復雜的代謝反應和微生物活動，因此TCS可能會通過影響部分菌群和生物酶的活力影響發酵產酸效能。研究表明，污泥中TCS含量為100 mg/kg時，可促進丁酸和丙酸的積累，使SCFA產量增加約36%；而較高含量的TCS（500 mg/kg）會抑制發酵［11］。盡管目前已有關于TCS對污泥厭氧發酵產酸影響的研究，但堿性條件下的該類研究仍未見報道。

本工作考察了TCS投加量對剩余污泥堿性發酵產酸效果的影響，通過污泥溶解、水解、酸化和水解酶活力實驗探究了TCS強化污泥堿性發酵產酸的機理，并采用高通量測序技術分析了3種發酵條件下功能菌群的變化，以期為污泥資源化提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用剩余污泥取自山西省楊家堡污水處理廠的濃縮池，并置于冰箱4 ℃下沉降24 h，棄去上清液，其基本性質如表1所示。

1.2 實驗方法

產酸實驗采用6組工作體積為500 mL的血清瓶，每個血清瓶中加入450 mL剩余污泥。向各組血清瓶中分別投加0，40，120，200，400，500 mg/kg的TCS，使污泥的初始總TCS質量濃度分別為0.073，0.785，2.210，3.635，7.197，8.978 mg/L；再用2.5 mol/L的NaOH和HCl溶液調節污泥pH為10，發酵第1 d調3次pH，每次間隔8 h，發酵第2、3 d每天各調節2次，每次間隔12 h。將所有血清瓶用氮氣吹掃2 min，并立即用橡皮塞密封以保證厭氧環境；再置于恒溫空氣振蕩器中開始發酵，溫度和轉速分別設置為30 ℃和200 r/min。實驗發酵周期為10 d，期間每天取樣，樣品在4 500 r/min下離心5 min，取上清液經0.45 μm濾膜過濾，測定SCFA濃度。10 d發酵結束后，測定水相、泥相中TCS的濃度以及污泥VSS，根據發酵前后的VSS計算污泥的VSS減少率，以此表征有機質的減少率。

機理研究中，選取空白、pH 10、pH 10+400 mg/kg TCS 3種發酵條件。在發酵2 d時，取樣測定污泥中α-葡萄糖苷酶和蛋白酶的活性；發酵5 d時取樣進行微生物分析。進行污泥溶解過程研究時，取樣測定發酵前3 d時的SCOD、溶解性碳水化合物和可溶性蛋白質濃度。進行水解過程研究時，將2.423 g牛血清蛋白（BSA，模擬蛋白化合物）和0.719 g葡聚糖（模擬碳水化合物）溶解于405 mL蒸餾水中，接種45 mL原剩余污泥使最終污泥TSS為1.78 g/L，并在上述3種條件下進行3 d發酵，每天取樣測定上清液中BSA和葡聚糖的濃度。酸化過程研究方法同水解過程一致，僅將模擬底物更換為L-丙氨酸和葡萄糖。

1.3 分析方法

1.3.1 TCS的測定

取適量污泥樣品，在GT10-1型離心機（北京時代北利離心機有限公司）中以8 000 r/min轉速離心10 min以分離水相和泥相。將上清液，即水相，用1 mol/L的H2SO4溶液調節pH至2~3，過0.45 μm濾膜，于4 ℃保存。將離心后的污泥，即泥相，平鋪于干燥盤中，于-20 ℃冷凍24 h，再置于FD-1A-50型冷凍干燥機（北京博醫康實驗有限公司）中于-50 ℃冷凍干燥48 h，研磨過篩（60目），稱取0.1 g于離心管中，加入5 mL甲醇，用THZ-C型渦旋混合器（大倉市實驗設備廠）充分混合，超聲萃取30 min，以8 000 r/min轉速離心10 min，取上清液于棕色試管中，在40 ℃水浴條件下氮氣吹至5 mL，用超純水定容至100 mL，再用1 mol/L H2SO4溶液調節pH至2~3，于4 ℃保存。

將上述預處理后所得的水相和泥相樣品采用Oasis HLB型固相萃取柱（沃特世科技（上海）有限公司）進行萃取，然后采用Agilent 1260 Inifinity Ⅱ型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）測定TCS質量濃度。根據下式計算剩余污泥的總TCS質量濃度（ρ，mg/L）；根據發酵后的水相TCS質量濃度和發酵前的總TCS質量濃度計算TCS的表觀去除率；根據發酵后和發酵前的總TCS質量濃度計算TCS的降解率。

式中：ρw和ρs分別為水相和泥相中的TCS質量濃度，mg/L；Cs為泥相中的TCS含量，mg/kg。

1.3.2 其他

TSS、VSS、SCOD和TCOD的測定均參照標準方法進行［12］。采用SP 2100型氣相色譜儀（北京北分瑞利分析儀器有限公司）測定SCFA濃度，包括乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、異戊酸、正戊酸6種有機酸，其濃度分別乘以換算因子1.07，1.51，1.82，1.82，2.04，2.04轉化為以COD計的濃度［13］。可溶性蛋白質和BSA的測定采用福林酚試劑法［14］，溶解性碳水化合物、葡聚糖和葡萄糖的測定采用蒽酮-硫酸法［15］，L-丙氨酸測定采用液相色譜法［16］。溶解性碳水化合物和可溶性蛋白質濃度分別乘以換算因子1.06和1.50轉化為以COD計的濃度。參照文獻測定α-葡萄糖苷酶和蛋白酶的相對活力［17］。微生物樣品委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行Illumina MiSeq平臺測序分析。

2 結果與討論

2.1 TCS對污泥堿性發酵產酸過程的影響

2.1.1 TCS投加量對SCFA產量的影響

圖1a顯示了TCS投加量對污泥堿性發酵（pH 10）過程中SCFA濃度的影響。整體而言，各組反應體系SCFA濃度均隨發酵時間呈現出先迅速增大后逐漸減小的趨勢。原因是堿性條件促進了污泥的分解過程，迅速釋放出水解、酸化過程所需的有機底物；而污泥中有機物隨發酵進行不斷被消耗，導致了SCFA濃度難以進一步提高。在發酵的前5 d，隨TCS投加量從0升至400 mg/kg，SCFA產量逐漸增大。在400 mg/kg TCS組發酵至5 d時達到最大SCFA濃度，為2 900.37 mg/L（產量2 740.96 mg/L），相比未投加TCS組5 d時提高了352.54 mg/L，這表明投加400 mg/kg的TCS可顯著提高SCFA產量。而進一步提高TCS投加量至500 mg/kg時，SCFA濃度發生了下降。這表明一定量的TCS能夠有效強化污泥堿性發酵的產酸性能，而過高的TCS濃度可能對微生物有較強危害作用，從而抑制了污泥中產酸優勢菌的生長，影響SCFA的進一步積累［11］。因此，在本實驗中，強化污泥堿性發酵產酸的最佳TCS投加量為400 mg/kg。

SCFA可作為污水處理廠生物脫氮除磷的外加碳源，而其中乙酸的利用效率最高，因此提高SCFA中乙酸的相對含量有利于污泥資源化利用。圖1b顯示了堿性發酵5 d時，不同TCS投加量下的SCFA組成。由圖可知：在所有發酵條件下，乙酸的質量分數始終是最高的，占SCFA的30.20%~36.73%；其次是丙酸，占SCFA的18.56%~21.39%；而正戊酸的占比最低，約為7%。本實驗中，400 mg/kg TCS組的乙酸相對含量最高，質量分數達到36.73%，是未投加TCS組的1.22倍，表明該條件下的發酵液更適合作為污水廠的外加碳源，有助于實現污泥資源化。

2.1.2 TCS投加量對有機質減少的影響

厭氧發酵過程能促進污泥中固體有機質的溶出和利用，這對污泥減量化意義重大。圖2顯示了10 d堿性發酵結束時不同TCS投加量下的VSS的變化情況，以此表征有機質的變化。由圖2可知，所有投加TCS的反應體系中VSS均低于未投加組，相應的減少率均高于未投加組，表明TCS能有效促進污泥厭氧發酵過程中有機質的減少。隨著TCS投加量從0升至400 mg/kg，污泥的VSS減少率逐漸變大，在400 mg/kg TCS組達到最高（40.50%），相較未投加TCS組提高了3.39個百分點。這表明該條件下進行發酵對污泥有機質的消耗程度最高，有助于實現污泥減量化。

圖2 TCS投加量對有機質的影響

2.1.3 污泥發酵過程對TCS的去除

污泥中TCS的去除有吸附和生物降解兩種途徑，其中吸附是依靠TCS在固-液相之間的遷移，而生物降解能真正去除TCS。研究表明，污泥厭氧發酵過程可以促進污泥中抗生素的溶出，更好地發揮生物降解作用［18］。圖3顯示了10 d堿性發酵結束時，TCS在各組污泥樣品泥相、水相中的殘余濃度及其降解率。由圖3數據計算可知，各組水相中TCS的表觀去除率均超過90%，其中400 mg/kg TCS組的殘余總TCS濃度為3.61 mg/L，降解率達到最高值，為49.80%。

圖3 污泥堿性發酵對TCS的去除效果

2.2 TCS強化污泥堿性發酵產酸的機理分析

2.2.1 污泥溶解過程

碳水化合物和蛋白質是污泥細胞和胞外聚合物的主要組成部分，污泥厭氧發酵首先要將這些有機物由顆粒態轉化為溶解態，以便進一步利用。因此，可溶性有機物的釋放情況能表征剩余污泥的溶解程度。圖4顯示了3種發酵條件下污泥中SCOD、溶解性碳水化合物及可溶性蛋白質濃度在發酵3 d內的變化情況。由圖可知，隨發酵時間的延長，3種不同發酵體系下的溶解性有機物濃度均不斷增加，且pH 10+400 mg/kg TCS組的SCOD、溶解性碳水化合物和可溶性蛋白質濃度均高于其他組。在發酵3 d時，pH 10+400 mg/kg TCS組的SCOD達到2 616.0 mg/L，分別是空白組和pH 10組的4.09和1.10倍。這表明，投加TCS進一步促進了堿性發酵條件下污泥中顆粒有機物的溶出，增強了污泥厭氧發酵的溶解過程。同時，pH 10+400 mg/kg TCS組的溶解性碳水化合物和可溶性蛋白質濃度在發酵3 d時達到461.1 mg/L和1 225.3 mg/L，分別是空白組的4.52倍和1.14倍，pH 10組的4.66倍和1.04倍。這進一步證明了投加TCS對污泥堿性發酵溶解過程有促進作用，為后續微生物水解及酸化提供了更充足的底物，有利于SCFA的迅速積累。

圖4 發酵條件對污泥溶解過程影響

2.2.2 水解、酸化過程

污泥中的大分子有機物經破胞溶出后，在微生物作用下會被進一步水解成小分子，并代謝酸化成SCFA。因此，微生物的水解酸化速率也同SCFA積累密切相關。如圖5a和圖5b所示，本實驗通過葡聚糖、BSA的降解模擬污泥水解過程。不難看出，3種發酵體系下BSA和葡聚糖的降解率均隨時間延長而不斷提高。在發酵3 d時，pH 10+400 mg/kg TCS組的BSA降解率最高（76.38%），相比空白組和pH 10組分別提高了25.92和2.56個百分點。同時，pH 10+400 mg/kg組發酵第3 d的葡聚糖降解率為44.00%，分別是空白組和pH 10組的1.32和1.10倍。由此可知，pH 10+400 mg/kg TCS組的水解速率最大，可使污泥中更多的溶解性大分子有機物（如碳水化合物和蛋白化合物）水解為低分子量物質（如葡萄糖和氨基酸），為產酸菌群提供更多底物。上述結果表明，在堿性條件下，污泥中含有一定量TCS能有效提高水解效率。此外，本實驗通過葡萄糖、L-丙氨酸的降解來模擬污泥酸化過程，如圖5c和圖5d所示。3種發酵體系下的L-丙氨酸和葡萄糖的降解率也隨發酵時間的延長而不斷提高。在發酵3 d時，pH 10+400 mg/kg TCS組中L-丙氨酸和葡萄糖的降解率分別為64.72%和71.75%，是空白組的1.17和1.11倍，相比pH 10組分別提高了5.40和3.82個百分點。這表明，污泥堿性發酵下投加TCS能進一步促進酸化過程，更多的水解產物被產酸微生物轉化為SCFA。

圖5 發酵條件對水解、酸化過程的影響

2.2.3 水解酶活力

SCFA復雜的代謝合成離不開眾多生物酶的參與，如功能菌群在水解大分子有機物時會分泌水解酶，以提高轉化效率。α-葡萄糖苷酶和蛋白酶是兩種關鍵的水解酶，分別通過破壞多糖的糖苷鍵和蛋白質的肽鏈來促進污泥水解，產生葡萄糖和氨基酸。圖6顯示了污泥發酵2 d時這兩種水解酶的相對活力（以空白組酶活力為100%）。由圖可知：pH 10+400 mg/kg TCS組的α-葡萄糖苷酶活力為空白組的1.62倍，比pH 10組提高了11個百分點；pH 10+400 mg/kg TCS組的蛋白酶活力是空白組的2.21倍，比pH 10組提高了7個百分點。這表明堿性條件促進了兩種關鍵水解酶的釋放，而投加TCS能進一步提高酶活力，從而提升污泥水解速率，為產酸微生物提供更多小分子底物。

圖6 發酵條件對水解酶活力的影響

2.3 功能菌群分析

污泥厭氧發酵體系中微生物群落結構復雜，為了實現SCFA的富集，需要各種微生物相互配合。如圖7所示，在門水平上的優勢菌群主要包括厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。研究表明，厚壁菌門微生物能釋放水解酶、利用有機物產酸且抗極端環境能力強，而放線菌門微生物與大分子有機物的降解密切相關［19-22］。二者在pH 10+400 mg/kg TCS組的合計相對豐度由空白組的5.98%大幅增至51.78%，比pH 10組提高了2.22個百分點。變形菌門（Proteobacteria）微生物主要參與發酵過程中乙酸、丙酸和丁酸的消耗［23］，其在pH 10+400 mg/kg TCS組中的相對豐度為21.53%，相較于空白組和pH 10組分別降低了11.27和2.55個百分點。

圖7 不同發酵條件下微生物在門水平上的相對豐度

如圖8所示，在綱水平上的優勢菌群主要有梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）、放線菌綱（Actinobacteria）和α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）。梭狀芽孢桿菌綱是水解大分子有機物的主要菌群［24］，在pH 10+400 mg/kg TCS組其相對豐度為33.01%，高于空白組（1.76%）和pH 10組（31.50%）。放線菌綱微生物是典型的發酵產酸菌，能利用水解底物進行SCFA的生產［25］，其在pH 10+400 mg/kg TCS組中的相對豐度也顯著高于空白組（3.80%）和pH 10組（10.15%），達到11.63%。α-變形菌綱微生物可利用糖類和蛋白質轉化產生乙酸和丙酸［26］，在pH 10+400 mg/kg TCS組中相對豐度為12.32%，相比空白組提高了3.52個百分點。上述結果表明，堿性發酵條件下投加TCS有效富集了污泥中SCFA的生產者，同時也削減了消費者，促進了SCFA的不斷積累。

圖8 不同發酵條件下微生物在綱水平上的相對豐度

圖9進一步在屬水平上分析了3組污泥樣品的微生物群落分布情況。由圖可知，厭氧醋菌屬（Acetoanaerobium）、蛋白水解菌屬（Proteinivorax）和泰氏菌屬（Tissierella）是3種主要的優勢菌屬，且同屬于厚壁菌門（Firmicutes），該菌門中不少微生物都對產酸發揮主要作用。厭氧醋酸菌屬微生物可以吸收H2和CO2并轉化為乙酸［27］，其在pH 10+400 mg/kg TCS組中的相對豐度為15.88%，顯著高于空白組（0.08%）且比pH 10組提高了0.88個百分點。這表明，pH 10條件下污泥發酵易產生更多乙酸，而投加TCS也能進一步提高乙酸相對含量。蛋白水解菌屬微生物可在堿性厭氧條件下，以蛋白質、二糖、丙酮等物質作基質產生SCFA［28］，其在pH 10+400 mg/kg TCS組中的相對豐度達到1.90%，高于pH10組（0.53%），而在空白組中未發現。這說明TCS的存在有效富集了蛋白水解菌屬微生物。此外，pH 10+400 mg/kg TCS組中的泰氏菌屬的相對豐度由空白組的0.02%升至6.12%，且顯著高于pH 10組（4.57%）。有研究表明，該菌屬微生物通過代謝有機物可產生乙酸、丁酸和氨氮［29］。

圖9 不同發酵條件下微生物在屬水平上的相對豐度

上述結果表明，pH 10+400 mg/kg TCS發酵體系通過破壞污泥細胞釋放出可溶性有機物，有效促進了水解和產酸菌的富集。該結論證實了TCS對污泥堿性發酵產酸的強化作用。

3 結論

a）TCS影響污泥堿性發酵（pH 10）的產酸效果。當TCS投加量為400 mg/kg且發酵5 d時，SCFA的產量最高，為2 740.96 mg/L，相比未投加TCS時提高了352.54 mg/L。該體系中，乙酸在SCFA中的占比最高，質量分數達36.73%；以VSS減少率表征的有機質減少率最大，達40.50%，有助于污泥資源化利用。

b）機理研究表明，TCS進一步促進了污泥堿性發酵的溶解、水解和酸化過程，同時增強了水解酶的活力，為產酸微生物提供更多底物。

c）功能菌群分析表明，TCS顯著強化了厚壁菌門和放線菌門微生物在污泥堿性發酵過程中的富集，尤其是厚壁菌門的厭氧醋酸菌屬和泰氏菌屬微生物，其相對豐度分別達到15.88%和6.12%，有利于SCFA的積累。