犬肝簇蟲病在海南島的流行病學(xué)調(diào)查及其遺傳關(guān)系的研究

王楷冬，王金花,2，祖海月，林 洋，王世明

（1. 海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，海口 570228; 2. 海南大學(xué) 全健康研究院，?？?570228;3. ?？谑袆?dòng)物疫病預(yù)防控制中心，海口 570205）

肝簇蟲是頂復(fù)門（Apicomplexa）真球目（Encoudida）肝簇蟲屬（Hepatozoonspp.）的原蟲，屬于血液寄生蟲的8個(gè)屬之一。目前所發(fā)現(xiàn)的肝簇蟲屬已經(jīng)達(dá)到300多種，其中至少有46種肝簇蟲屬能感染哺乳動(dòng)物[1]。肝簇蟲可以通過不同種類的節(jié)肢動(dòng)物進(jìn)行傳播，比如蜱（Ixodida），虱（Phthiraptera），蚊（Culicidae），螨（Acariformes and Parasitiformes），白蛉（Phlebotomidae），采采蠅（Glossina），錐蝽（Triatominae），水蛭（Whitmania pigra Whitman）[1-3]。

目前已知能感染犬和其他野生犬科動(dòng)物的肝簇蟲有2種，分別是犬肝簇蟲（Hepatozoon canis）[4]和美洲肝簇蟲（Hepatozoon americium）[5]。2種肝簇蟲都是通過犬和其他野生犬科動(dòng)物吞食含有成熟卵囊的蜱蟲而進(jìn)行傳播的[6-7]。也有包括犬肝簇蟲通過胎盤屏障感染胎兒，或新宿主獵食了作為美洲肝簇蟲的原宿主等其他途徑感染的報(bào)道[8]。血紅扇頭蜱（Rhipicephalus sanguineus），一種以犬為主要宿主，以多種哺乳動(dòng)物血液為食的棕色犬蜱，在世界范圍內(nèi)廣泛分布[9-10]，已被證明是犬肝簇蟲的主要傳播媒介[11]。最近，也有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，對(duì)犬肝簇蟲也有傳播作用的還有在意大利南部發(fā)現(xiàn)的圖蘭扇頭蜱（Rhipicephalus turanicus）[12]；其他蜱種如巴西的微小扇頭蜱（牛蜱）[Rhipicephalus （Boophilus） microplus][13]、卵圓花蜱（Amblyomma ovale）[14]、日本的長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）和褐黃血蜱（Haemaphysalis flava）[15]、意大利的蓖籽硬蜱（Ixodes ricinus）[16]、匈牙利的嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna）[17]等也可能是犬肝簇蟲的潛在載體。

犬肝簇蟲可廣泛感染世界各地的肉食性宿主，如狗、豺、狐貍、負(fù)鼠和家貓[16,18-22]。家養(yǎng)犬對(duì)犬肝簇蟲的感染表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性，大多數(shù)犬在感染后的疾病狀態(tài)處于亞臨床到輕度之間，而犬被美洲肝簇蟲感染后往往是致命的[5,23]。雖然美洲肝簇蟲和犬肝簇蟲在犬科動(dòng)物感染中都有報(bào)道，但犬肝簇蟲的傳播更廣泛，也是犬肝簇蟲病的主要原因[9]。

犬肝簇蟲的診斷常用鏡檢方法，即在染色的血涂片中檢測(cè)出犬肝簇蟲的配子體[24]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和間接熒光抗體試驗(yàn)等工具也被用于犬肝簇蟲抗體的血清學(xué)診斷[25]。還可以通過PCR技術(shù)檢測(cè)犬體內(nèi)的犬肝簇蟲，這是檢測(cè)犬感染犬肝簇蟲最準(zhǔn)確的診斷方法[7,26]。

犬肝簇蟲廣泛分布，歐洲[16,19]、非洲[27-28]、美洲[29]、亞洲[4,30]、澳洲[31]等地都有犬肝簇蟲的報(bào)道；在中國的鄰國也有發(fā)現(xiàn)，如柬埔寨[32]，印度[33]，日本[34]，韓國[35]，巴基斯坦[36]，泰國[37]，馬來西亞半島[38]等，而美洲肝簇蟲只在北美地區(qū)有報(bào)道[5,39]。目前我國犬只數(shù)量估計(jì)在1.5億到2億[40]之間。國內(nèi)對(duì)犬肝簇蟲的研究卻非常有限，僅有北京、河南、江蘇、陜西、新疆[41]、廣西[42]、廣東[43]、臺(tái)灣[44]等地區(qū)有關(guān)于犬肝簇蟲的報(bào)道。

在過去的幾年里，世界范圍內(nèi)影響家畜和野生動(dòng)物的肝簇蟲流行率有所增加，因此，對(duì)肝簇蟲的研究在獸醫(yī)領(lǐng)域具有重要意義。本研究旨在通過PCR和測(cè)序方法檢測(cè)出海南島犬體內(nèi)攜帶肝簇蟲的情況，可為海南島犬蜱傳疾病的流行和分布格局提供信息。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2017年10月至2022年5月，在海南島18個(gè)市縣共采集了1 039份犬血，血液保存于含有EDTA的EP管中，放入-80℃凍存。并對(duì)每只犬的信息建立檔案記錄。

1.2 主要試劑 Ezup柱式血液基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖、DL 2000 DNA Marker均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Goldview染料，購自蘇州金唯智生物科技有限公司；2 XTaqPlus Master Mix II（Dye Plus），購自南京諾維贊生物科技股份有限公司。

1.3 主要儀器 PCR儀，TProfessional，德國Biometra公司產(chǎn)品；小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，5415R，Eppendorf 公司產(chǎn)品；瓊脂糖水平電泳儀，Mini-PROTEAN Tetra，北京六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，GelDoc XR+，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.4 DNA提取 取出100 μL上述采集到的血液，分別加入到1.5 mL EP管中，參照DNA提取試劑盒說明書步驟提取犬血中DNA，并于-20 ℃保存。

1.5 PCR檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)采用的引物序列參照文獻(xiàn)[45]，上游引物為HEP-F：5′-ATACATGAG CAAAATCTCAAC-3′；下游引物為HEP-R：5′-CTTATTATTCCATGCTGCAG-3′。PCR具體反應(yīng)體系：2 XTaqPLus Master Mix II 12.5 μL，特異性引物F和特異性引物R（10-8moL·L-1）各 0.5 μL，血液基因組DNA（約20 ng） 1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃，預(yù)變性5 min；95 ℃，變性時(shí)間60 s；58℃，退火時(shí)間60 s；72 ℃，延伸時(shí)間60 s；共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠加樣孔中進(jìn)行電泳，然后在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察結(jié)果是否出現(xiàn)目的條帶。將出現(xiàn)目的條帶所對(duì)應(yīng)的陽性產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 序列分析及支序圖的構(gòu)建 使用NCBI中BLAST在線比對(duì)工具將肝簇蟲的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，選出代表性的犬肝簇蟲序列與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)，利用軟件進(jìn)行同源性分析（DNAMAN 8.0），使用Mega XI軟件，選擇Neighbor-joining（NJ）算法中的Kimura-2-parameter參數(shù)模型，Bootstrop值選擇1 000進(jìn)行支序圖構(gòu)建，以剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）的18S rRNA序列（登錄號(hào)L37415）為外群。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬肝簇蟲18S rRNA基因的PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)采集到的1 039份犬全血DNA進(jìn)行犬肝簇蟲18S rRNA基因擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物在666 bp處出現(xiàn)目的片段（圖1），與犬肝簇蟲18S rRNA基因預(yù)期片段大小相符。擴(kuò)增序列測(cè)序拼接后經(jīng)BLAST比對(duì)與GenBank上已有的犬肝簇蟲序列AF176835同源性為99.85%。

圖1 犬肝簇蟲18S rRNA基因的 PCR 擴(kuò)增

2.2 海南犬肝簇蟲病的感染率 在海南島1 039份犬血中發(fā)現(xiàn)犬肝簇蟲陽性血液135份，感染率為13.0%。海南島18個(gè)市縣犬肝簇蟲感染率見表1。?？冢?0.7%）、三亞（20.6%）、屯昌（33.3%）等地犬肝簇蟲感染率較高。文昌市（8.7%）、定安縣（5.6%）、澄邁縣（6.3%）、儋州市（5.0%）、瓊中縣（15.8%）、樂東縣（18.8%）、昌江縣（6.7%）等地均發(fā)現(xiàn)有犬感染犬肝簇蟲。

表1 海南島18個(gè)市縣犬肝簇蟲感染率

2.3 犬肝簇蟲種系發(fā)育分析 BLAST分析表明，海南的犬肝簇蟲的同源性為99.4%～100%，用MEGA-X軟件選擇本實(shí)驗(yàn)中獲得的代表性犬肝簇蟲18S rRNA基因序列構(gòu)建支序圖（圖2）（三亞（OP699205）、樂東（OP699206）、定安（OP699207）、瓊中（OP699208）的陽性樣品）。從圖2中發(fā)現(xiàn)海南的犬肝簇蟲(Hepatozoon canisLD3、HepatozooncanisDA85、Hepatozoon canisSY1、Hepatozoon canisQZ4)與印度的犬肝簇蟲（AF176835）均位于bootstrap支持度100的同一分支中，并在bootstrap支持度90的情況下與該屬其他分支分離[貓肝簇蟲（Hepatozoon felis），美洲肝簇蟲（Hepatozoon americium）]

圖2 基于18S rRNA基因構(gòu)建的支序圖

3 討 論

犬肝簇蟲是蜱傳病原蟲中分布最廣的一種，主要由血紅扇頭蜱[46]傳播。本研究采集的樣本來自于海南島18個(gè)市縣，海南島屬于熱帶季風(fēng)氣候，全年溫度和濕度相對(duì)較高，年平均溫度在22～27 ℃。海南島氣候適合熱帶物種血紅扇頭蜱的發(fā)展和生存。目前針對(duì)犬肝簇蟲對(duì)不同宿主或宿主特異性的情況尚未有較多的研究[6,11]。因此，無法消除犬肝簇蟲通過其他蜱蟲物種傳播的可能性[19]。

自1905年犬肝簇蟲首次被提出以來[4]，犬肝簇蟲已在美洲、歐洲、亞洲、非洲和澳大利亞的幾個(gè)國家被報(bào)道。大多數(shù)的報(bào)道通常是通過組織病理學(xué)或顯微鏡診斷[35]的方法來確定肝簇蟲的感染，缺乏對(duì)其種群的遺傳結(jié)構(gòu)和基因變化的理解。本實(shí)驗(yàn)采用PCR技術(shù)檢測(cè)犬體內(nèi)的犬肝簇蟲，并通過測(cè)序和建立支序圖的方式對(duì)該血液寄生蟲的物種進(jìn)行鑒定[47]，使調(diào)查結(jié)果的準(zhǔn)確性更高。

本研究使用了一套肝簇蟲屬的特異性引物對(duì)海南島1 039份犬血樣進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，其中135份樣品（13 .0%）為陽性。通過對(duì)獲得的陽性擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序分析來確定肝簇蟲的種類。

本研究結(jié)果支持并證實(shí)了海南犬體內(nèi)存在犬肝簇蟲，也是海南島犬肝簇蟲的首次分子生物學(xué)報(bào)道。據(jù)報(bào)道，犬肝簇蟲在非洲國家流行率如蘇丹42.3%[48]、尼日利亞41.4%[49]和贊比亞13%[50]。犬肝簇蟲在歐洲國家流行率如法國1%[51]、西班牙3%[52]捷克50%[53]、意大利南部50.6%[7]。犬肝簇蟲在北美洲流行率如古巴47.5%[54]、美國犬肝簇蟲與美洲肝簇蟲同時(shí)出現(xiàn)，感染率為2.5%[55]。犬肝簇蟲在南美洲流行率如巴西（53.3%）[56]，犬肝簇蟲在亞洲流行率如印度（30%）[33]、日本（42.9%）[34]。

文獻(xiàn)報(bào)道我國犬肝簇蟲感染率為河南登封市4.08%[43]，河南鄭州4.9%，北京4.5%，江蘇南京2.3%，陜西楊凌8.9%，新疆烏魯木齊1.2%[41]，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院有確診一例犬肝簇蟲陽性病例[57]，廣州也有疑似犬肝簇蟲的病例報(bào)道[58]。

海南島犬肝簇蟲的感染率為13.0%，與其他省市感染率相比偏高，比國外其他國家相比感染率偏低，這些犬肝簇蟲感染率的差異可能是由多種因素造成的，如目標(biāo)犬的種群特征、采樣季節(jié)、社會(huì)因素（犬類飼養(yǎng)、使用藥物殺蜱）、地理位置和氣候條件等，這些因素最終會(huì)影響病媒蜱物種的數(shù)量和分布[59]。因犬肝簇蟲的傳播需要通過吞食含有成熟卵囊的蜱蟲進(jìn)行，使得犬肝簇蟲病的感染率不高。但目前沒有可用的犬肝簇蟲疫苗，使得犬肝簇蟲病的治療比較困難。防治這種疾病的最佳方法是采取適當(dāng)?shù)尿缦x控制策略來預(yù)防感染。

支序圖分析結(jié)果表明，來自海南島的犬肝簇蟲與其他地區(qū)的犬肝簇蟲屬于同一支系，與海南樣品同源性最接近的序列是來自印度的犬肝簇蟲（AF176835）。這一發(fā)現(xiàn)可能表明，該病原體可能是由于旅游業(yè)、自然災(zāi)害和社會(huì)因素等，人與寵物的流動(dòng)性日益增加的原因而帶入海南。

此外，本研究中犬肝簇蟲基因型與貓肝簇蟲、美洲肝簇蟲分類不同。由于該類群的成員已在全球廣泛分布的犬科動(dòng)物和家養(yǎng)犬中被報(bào)道，因此可能對(duì)進(jìn)一步研究該類群的新類群劃定提供一定的幫助。