木薯細菌性萎蔫病菌2個候選抗銅基因簇的克隆和分析

徐春華，李超萍，時 濤，王國芬，蔡吉苗，李博勛，黃貴修

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物監(jiān)測與控制重點實驗室，海口 571101; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶生物技術研究所，海口 571101）

木薯（Manihot esculentaCrantz）為大戟科木薯屬灌木狀多年生作物，是和馬鈴薯、甘薯并稱的世界三大薯類作物之一，有近五千年的栽培史[1]，廣泛栽種于熱帶和亞熱帶地區(qū)的100多個國家和地區(qū)[2]。1820年前后，木薯首次傳入我國廣東地區(qū)，目前種植范圍已遍及華南地區(qū)。木薯在我國主要用作工業(yè)原料，可生產(chǎn)2 000多種產(chǎn)品[3]，相關產(chǎn)業(yè)在當?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位。自2005年以來，我國一直是世界上最大的木薯進口國[4]。由地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas axonopodispv.manihotis，簡稱Xam）侵染引起的細菌性萎蔫病，也稱細菌性枯萎病或細菌性疫病，是世界木薯種植中的重要病害。病原菌從氣孔或傷口侵入并在附近細胞的間隙內(nèi)增殖，通過維管束進行系統(tǒng)性擴散。病原菌主要危害葉片和莖稈，能夠產(chǎn)生葉片角斑、萎蔫、枯萎、提前脫落及幼苗萎蔫、枝條回枯、莖干潰瘍、維管束壞死等癥狀。植株受害后長勢變?nèi)酢乐貢r死亡，重病田塊產(chǎn)量損失可達一半以上。1963年，該病首次在我國臺灣地區(qū)發(fā)生[5]，1980年在我國海南省發(fā)生，隨后擴散到廣東、廣西等地區(qū)[6]。李超萍等[7]的調(diào)查表明，該病已在國內(nèi)木薯主栽區(qū)普遍發(fā)生，是當前危害我國木薯最嚴重的病害。

銅基殺菌劑是作物細菌性病害防控中的常用藥劑，也是我國木薯細菌性萎蔫病防控中常見的推薦藥劑[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外代表性菌株對銅離子和氫氧化銅、噻菌銅等銅基殺菌劑均具有較高水平的抗性，而國外部分已測序的菌株中均編碼有copTAB和XmeRSA兩個候選的抗銅基因簇[9]，但國內(nèi)及其他地區(qū)的Xam菌株是否具有抗銅性并攜帶這2個抗銅基因簇尚缺少研究。因此，本研究在繼續(xù)收集相關菌株并進行抗銅性評價的基礎上，根據(jù)基因序列特征設計引物，通過 PCR 擴增進行這2個基因簇的克隆和序列分析研究，為進一步開展相關基因的功能驗證和病原菌抗銅機理分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）菌株：供試的39個Xam菌株均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所提供，菌株編號、分離所用樣品采集時間和地點見表1。（2）培養(yǎng)基和試劑：Xam菌株的活化和培養(yǎng)均采用YGP 培養(yǎng)基；大腸桿菌的培養(yǎng)采用LB 培養(yǎng)基（參照方中達[10]的方法制備）。DNA片段膠回收試劑盒和pMD18－T載體購買自寶生物工程（大連）有限公司；Taq酶和dNTP購買自天根生化科技（北京）有限公司；所用引物對（Cop1：GTGCTGCATCGCCTGCTC和Cop2：TCAAAACCACACGCGTACAC；Xme1：ATCAGTCGGCCTTGGGC和Xme2：TCACGGCTCAAACCGATACC）由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；大腸桿菌T1感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 供試菌株及其來源

1.2 不同來源Xam病菌抗銅性評價 采用含毒介質(zhì)法中的最低抑制濃度法[11]進行，參照慕立義[12]的方法進行結果的檢查及計算。

1.3 候選抗銅基因簇的克隆和分析 各病原菌菌株活化、培養(yǎng)后收集菌體，用SDS法提取基因組DNA[13]。PCR反應體系為：10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、10 μmol·L-1各引物溶液1 μL、40%甘油3.75 μL、20%DMSO 3.75 μL、DNA模板50～100 ng、TaqDNA聚合酶1.0 U，加無菌水至25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預變性3 min；94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 2 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用l.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照DNA片段膠回收試劑盒和pMD18－T載體試劑盒說明書進行擴增產(chǎn)物的回收、連接和克隆，篩選陽性克隆后，各樣品隨機挑選3個克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定，確認序列后在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上進行比對。和近源菌株這2個基因簇的序列進行聚類分析，用MEGA version 4.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系統(tǒng)樹，用Bootstrap 對系統(tǒng)樹進行檢驗，1 000次重復。

2 結果與分析

2.1 Xam病菌抗銅性評價 完成了39個菌株的抗銅性評價，結果表明，硫酸銅對各菌株的抑菌最低有效濃度在1.25～1.55 mmol·L-1之間。來自哥倫比亞的菌株Xam1197抗銅能力最強，為1.55 mmol·L-1，來自江西的XamJX08，廣西的Xam-GX44、XamGX45、XamGX46、XamGX51、XamGX-52、XamGX53、XamGX68和XamGX70，來自廣東的XamGD54、XamGD55，來自海南的XamHN-57，來自柬埔寨的XamKHM05和馬來西亞Xam-ML1825的抗銅性較差，均為1.25 mmol·L-1，其他菌株的抗銅性在1.30～1.45 mmol·L-1之間（表1）。

2.2 候選抗銅基因簇的克隆和初步分析 根據(jù)2個候選基因簇的序列特征，分別設計了Cop1、Cop2和Xme1、Xme2兩對引物。提取各菌株基因組DNA后，分別進行PCR擴增，各菌株用2個引物對均能獲得大小約3.4 kb的擴增產(chǎn)物。隨機選擇國內(nèi)外17個代表性菌株（XamJX02、Xam-JX08、XamGX46、XamGX69、XamGX70、XamGD-26、XamGD54、XamHN16、XamHN57、XamMK-1823、XamKHM04、XamKHM05、XamMLXY-1825、Xam1197、Xam1198、XamUG1和XamUG2）的擴增產(chǎn)物，純化回收、克隆后測序并進行同源基因的比較。

所有菌株均編碼有和XamGX11完全相同的CopTAB基因簇，該基因簇由CopT、CopA和CopB等編碼方向一致的3個基因組成，3個基因之間的非編碼區(qū)長度分別為90 nt和454 nt。這些菌株中，僅有XamGD26和其他菌株在copA編碼區(qū)的第964個nt為“A”，而其他菌株為“C”，對應的氨基酸為異亮氨酸，其他菌株為纈氨酸。以其他菌株共有的基因序列進行了初步分析，CopT編碼區(qū)全長425 nt，和多個黃單胞菌的預測CopL家族金屬結合調(diào)節(jié)基因（或稱銅轉運蛋白）僅有2個堿基的差異，同源性最高為99%（登錄號CP012063.1、CP012060.1等），該基因編碼139個aa，和番茄細菌性斑點病菌（Xanthomonas axonopodispv.vesicatoria）菌株7882的預測蛋白序列（WP_017157235.1）完全一致[14]。CopA全長1 806 nt，和黃單胞菌的預測多銅氧化酶基因同源性最高，為99%（CP012063.1、CP012060.1等），有21個堿基的差異，該基因編碼601個aa，和菜豆黃單胞菌（Xanthomonas phaseoli）預測蛋白序列（WP_017157234）一致[15]。CopB全長654 nt，和地毯黃單胞萬年青致病變種（Xanthomonas axonopodispv.dieffenbachiae）菌株LMG 695預測的抗銅相關基因（CP014347.1）僅有16個堿基的差異，同源性為99%，編碼369個aa，和菜豆黃單胞菌預測蛋白序列（WP_017157233）一致。

和CopTAB基因簇相同，所有菌株同樣編碼有XmeRSA基因簇，其中XmeR和XmeS位于染色體負鏈上，兩者編碼區(qū)有4個堿基的重疊，而XmeA位于正鏈上，和另外2個基因編碼區(qū)方向相反并有161 nt的間隔區(qū)。這些菌株中，Xam-GX69和XamGD54與其他菌株均有1nt的序列差異。XamGX69在XmeS編碼區(qū)的第1 015個nt為“A”，而其他菌株為“C”，對應的氨基酸為蘇氨酸，其他菌株為丙氨酸。XamGD54在XmeA編碼區(qū)的第1 141個nt為“C”，而其他菌株為“G”，對應的氨基酸為天冬氨酸，其他菌株為組氨酸。以其他菌株共有的基因序列進行了分析，XmeR編碼區(qū)全長684 nt，和多個黃單胞菌預測的DNA結合轉錄調(diào)節(jié)因子BaeR基因（CP012063.1、CP012060.1、CP012057.1等）同源性最高，為99%，僅有6個nt的差異，該基因編碼227個aa，和菜豆黃單胞菌等病原菌預測蛋白序列（WP_046833221、WP_017157623）一致[16]。XmeS編碼區(qū)全長1 380 nt，和黃單胞菌預測的組氨酸激酶感受分泌調(diào)節(jié)基因BaeS同源性為99%，有12個nt的差異，編碼459個aa，和菜豆黃單胞菌預測蛋白序列（WP_017157622）完全相同。XmeA編碼區(qū)全長1 224 nt，和多個黃單胞菌預測的外排RND（resistancenodulation-cell-division，簡稱RND，耐藥結節(jié)細胞分化）轉運蛋白亞基基因（CP012063.1、CP012060.1、CP012057.1等）有24個nt的差異，同源性為99%，編碼407aa，和菜豆黃單胞菌預測基因蛋白序列（WP_017157621）完全一致。

2.3 候選抗銅基因簇的系統(tǒng)發(fā)育分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索和下載近源黃單胞病原菌及其他病原菌中的copTAB和XmeRSA同源基因簇（表2），構建NJ 系統(tǒng)進化樹，分析其進化關系，結果表明，所獲17個木薯細菌性萎蔫病菌菌株的copTAB基因簇聚為1個分枝，和菜豆黃單胞菜豆變種（Xanthomonas phaseolipv.phaseoli）菌株PR1同源基因的親緣關系最近。柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodispv.citri）菌株306、檸檬黃單胞病檸檬致病變種（Xanthomonas citripv.citri）菌株LH276、檸檬黃單胞菌（Xanthomonas citripv.punicae）菌株LMG7504和菜豆普通細菌性疫病病菌（Xanthomonas fuscanssubsp.fuscans）菌株ISO118C5等聚成1個分枝，和木薯細菌性萎蔫病菌菌株有很高的同源性。細菌性葉斑病菌（Xanthomonas axonopodispv. vesicatoria）菌株7882、檸檬黃單胞病菌（Xanthomonas citrisubsp. citri）菌株A44和野油菜黃單胞菌胡桃致病變種（Xanthomonas campestrispv.juglandis）菌株C5聚為1個分枝，同源性也較高。農(nóng)桿菌（Agrobacterium）菌株CFBP 6 623、丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringaepv.syringae）菌株DC3000和木薯細菌性萎蔫病菌菌株的同源性最低（圖1）。

圖1 供試菌株的 copTAB基因簇聚類分析XamJX08 代表相同的 16 個序列。

表2 近源黃單胞病原菌及其他病原菌的抗銅基因簇

各木薯細菌性萎蔫病菌菌株的XmeRSA基因簇同樣聚為1個分枝，菜豆黃單胞菜豆變種菌株Xcp25同源基因的相似性最高。地毯草黃單胞菌菜豆致病菌變種（Xanthomonas axonopodispv.phaseoli）菌株ISO98C12和野油菜黃單胞菌辣椒致病變種（Xanthomonas campestrispv.vesicatoria）菌株85-10聚為1個分枝，同源性也較高。檸檬黃單胞病菌菌株29-1、檸檬黃單胞病杧果致病變種（Xanthomonas citripv.mangiferaeindicae）GXG07和 塔斯曼尼亞歐文氏菌（Erwinia tasmaniensis）菌株ET1/99親緣關系較近，聚為1個分枝，和木薯細菌性萎蔫病菌親緣關系較遠。穿孔黃單胞（Xanthomonas perforans）菌株91-118和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）菌株B25與木薯細菌性萎蔫病菌親緣關系最遠（圖2）。

圖2 供試菌株的 XmeRSA基因簇聚類分析XamJX08 代表相同的 15 個序列。

3 討 論

研究結果表明，來自國內(nèi)不同種植區(qū)以及密克羅尼西亞、馬來西亞、烏干達、哥倫比亞等不同國家的木薯細菌性萎蔫病菌均對銅離子具有較高的抗性。分子克隆結果表明，所有供試菌株均攜帶有copTAB和XmeRSA兩個高度保守的抗銅基因簇，其和黃單胞及其他常見病原菌的抗銅相關基因也有較高的同源性，相關基因在病原菌抗銅反應及其他方面的作用機制，將是下一步的研究重點。

不同病原細菌之間的抗銅基因具有保守性，敏感性菌株常通過結合轉移獲得相關基因并產(chǎn)生抗銅性[21]。國外研究結果表明，隨著銅基殺菌劑使用，危害番茄和柑橘的黃單胞病菌中，抗銅菌株的數(shù)量和比例也在不斷增加[22-23]。國內(nèi)也有研究結果表明，隨著銅基殺菌劑的使用，危害核桃的細菌性疫病病原菌（Xanthomonas arboricolapv.juglandis）菌株種群中出現(xiàn)抗銅能力不同的抗銅性菌株[24]；臺灣地區(qū)的細菌性瘡痂病菌（Xanthomonas euvesicatoria）和柑橘潰瘍病菌也都具有抗銅性[25]。本研究結果表明，國內(nèi)外代表性菌株均具備抗銅性，分析菌株之間可能存在廣泛的抗銅相關基因轉移現(xiàn)象。

除抗銅外，copTAB基因簇還參與黃單胞菌的其他功能。例如番茄瘡痂病菌（Xanthomonas gardneri）菌株Xv10的copB基因同時控制著抗銅性和侵染番茄的能力[26]，而水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）菌株PXO99的copAB上產(chǎn)生6個氨基酸突變，導致其對銅離子敏感而且降低了對水稻的侵染能力[27]。筆者團隊在國內(nèi)木薯主栽區(qū)及柬埔寨、哥倫比亞、烏干達、密克羅尼西亞、馬來西亞等地區(qū)收集病原菌，發(fā)現(xiàn)所有菌株均具有較高的抗銅性。除國內(nèi)廣西、廣東等部分重病區(qū)之外，其他國家和地區(qū)并無使用銅基殺菌劑的記錄，分析這2個基因簇可能和病原菌侵染寄主、適應環(huán)境等方面功能相關。

前人研究結果表明，抗銅性黃單胞病菌對銅離子的抗性水平通常在0.6～1.2 mmol·L-1之間[24]，本研究結果表明木薯細菌性萎蔫病菌的抗性水平在1.25～1.55 mmol·L-1，整體上其抗銅能力高于前人報道的其他菌株。copTAB基因簇分別編碼銅轉運蛋白、多銅氧化酶和抗銅相關基因，而XmeRSA基因簇編碼DNA結合轉錄調(diào)節(jié)因子、組氨酸激酶感受分泌調(diào)節(jié)因子和外排RND轉運蛋白亞基。細菌的抗銅作用包括RND等基因家族的外排作用，陽離子擴散（CDF）基因家族的過濾作用，P型ATP酶的調(diào)控作用等不同層次的作用機制，包括銅離子的吸附沉積、隔離、修飾及向外轉運等。木薯細菌性萎蔫病菌的抗銅能力相對較高，可能和該病菌同時具備copTAB基因簇的銅離子轉運功能和XmeRSA基因簇的外排作用相關。