啟動子WY172和WY195在暹羅炭疽菌中的活性研究

董林朋，殷金瑤，趙文淵，林春花，劉文波，繆衛國，李 瀟

（海南大學 植物保護學院/熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室，海口 570228）

啟動子(Promoter)為DNA分子上與RNA聚合酶結合形成轉錄起始復合物并起始mRNA合成所必需的保守序列。啟動子有強、弱之分，其對轉錄水平的控制程度差異較大，按轉錄模式可將啟動子分為組成型、組織特異型、誘導型等多種形式。強啟動子對于基因工程的研究具有促進作用，為轉化體系的建立、互作機制的研究等提供有效的工具。例如小麥條銹菌效應蛋白Pst14872靶標的鑒定及功能分析[1]中報道了利用大腸桿菌Tac啟動子探究專性寄生真菌小麥條銹菌中Pst14872效應蛋白與靶標TaClpS1的互作機制；農桿菌及PEG介導向日葵核盤菌遺傳轉化體系的研究[2]中報道了利用大腸桿菌的Lac啟動子驅動mgfp5基因的表達以探究向日葵核盤菌轉化體系的建立；啟動子克隆概述[3]中報道了絲狀真菌啟動子可以高效表達內源基因可能得益于其具有強大的啟動子工具。因此，利用從真菌內分離的強啟動子驅動基因的轉錄表達，有望為絲狀真菌轉化體系的建立、侵染機制的研究等提供新的可能。

橡膠樹白粉菌是一類專性寄生真菌，目前尚不能離體培養[4-5]，又因其寄主橡膠樹的基因組過于龐大，因此橡膠樹白粉菌遺傳轉化體系仍是目前研究中的一個難點問題。本實驗室從橡膠樹白粉菌基因組中鑒定得到了WY172[6]與WY195[7]啟動子，但僅在外源寄主雙子葉植物內驗證過這兩個啟動子功能，為進一步探究WY172與WY195是否有廣泛應用于橡膠樹白粉菌轉化體系建立的可能性，筆者所在的實驗室通過原生質體轉化法在與寄主相同的絲狀真菌—暹羅炭疽菌內驗證了這兩個啟動子功能[8]。筆者擬構建以啟動子WY172、WY195驅動綠色熒光蛋白（GFP）表達的載體，對GFP基因在暹羅炭疽菌內的表達情況進行探究，同時對轉化子在不同環境條件下啟動子的活性進行驗證，旨在為WY172、WY195啟動子的應用提供更多的可能，同時也為橡膠樹白粉菌轉化體系的建立提供優良的啟動子工具。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒 供試菌株為筆者所在實驗室分離純化獲得并經鑒定的橡膠樹暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）HN08[9]。pJNARG質粒來自西北農林科技大學許金榮課題組，依據pFL2質粒改造而來[10]。

1.2 培養基 TB3培養基：酵母提取物1 g，酸水解酪蛋白1 g，蔗糖5 g，加ddH2O定容至1 L，121℃高溫滅菌20 min，每200 mL加瓊脂1.5 g制成固體培養基。CM培養基：酵母提取物6 g，酸水解酪蛋白1 g，蔗糖10 g，加ddH2O定容至1 L，121℃高溫滅菌20 min，每200 mL加瓊脂3 g制成固體培養基。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 (PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉 15 g，加ddH2O定容至1 L， 121℃高溫滅菌 20 min。 馬鈴薯葡萄糖液體培養基 (PDB)：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，加ddH2O定容至1 L，121℃高溫滅菌 20 min。

1.3 試劑 蝸牛酶（Snailase）購自北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司，溶壁酶（lysing enzyme）購自美國Sigma Aldrich公司。1×STC緩沖液：蔗糖20 g，50 mmol·L-1Tris-HCl 0.785 g，50 mmol·L-1CaCl20.555 g，加ddH2O定容至100 mL，121℃高溫滅菌20 min。PTC緩沖液：稱取3 g PEG 4 000，溶解于1×STC緩沖液，定容至5mL，利用細菌過濾器（孔徑0.45 μm）過濾除菌。酶解液配制：細胞壁溶壁酶0.2 g，完全溶解于0.7 mol·L-1的NaCl溶液，利用細菌過濾器（孔徑0.45 μm）過濾除菌。

1.4 表達載體的構建 利用限制性內切酶KpnⅠ和EcoRⅠ對pJNARG載體進行雙酶切，切除載體上的RP27啟動子基因片段（圖1），并使用DNA回收試劑盒（Magen，R6840-01）回收載體片段。提取橡膠樹白粉菌基因組DNA，以WY172 F/R和WY195 F/R引物，從橡膠樹白粉菌基因組中擴增出WY172（GenBank：MK049254.1）與WY195（GenBank：MK049253.1）啟動子，連接pJNARG骨架片段，并轉化DH5α感受態細胞，涂布于Amp+抗性的LB固體培養基上，在37℃的環境中培養過夜，挑取單菌落進行PCR驗證并篩選出陽性克隆轉化子用于后續實驗研究。本研究所用的引物見表1。

表1 本研究所用引物

圖1 pJNARG載體圖譜

LB液體培養基中，37℃搖床振蕩過夜后并提取質粒進行PCR驗證，驗證正確的質粒送至華大生物公司測序。測序正確的菌株保存在甘油中并放置于-80℃保存。

1.5 原生質體的制備 將野生型的暹羅炭疽菌接種至CM固體培養基上，5 d后切取菌落邊緣的菌塊，在250 mL三角瓶中加入150 mL CM液體培養基，接入切除的菌塊，28℃ 160 r·min-1培養48 h。收集菌絲，使用滅菌過濾紙過濾，用0.7 mol·L-1NaCl溶液反復沖洗，用濾紙吸干水分，將菌絲轉移至50 mL離心管中（避免手直接觸碰菌絲）。稱取菌絲質量，按照質量比為1 : 1的比例向菌絲中加入溶壁酶，置于搖床（28℃， 100 r·min-1）上，酶解時長約3.5 h。使用4層滅菌過濾紙過濾酶解液，將酶解后的菌絲溶液進行冰浴后用0.7 mol·L-1NaCl溶液洗滌，然后收集原生質體于50 mL離心管中，4℃ 4 600 r·min-1條件下離心15 min后棄上清。再用STC溶液將原生質體重懸，4℃4 600 r·min-1條件下離心15 min，重復1次。最后利用STC溶液將原生質體濃度調至1 ×108個·mL-1，分裝為每管200 μL，立即進行轉化使用。

1.6 原生質體轉化 取60～100 μL 1.4中構建的質粒，與200 μL制備成功的原生質體混合，冰浴20～30 min，每200 μL原生質體中加入2 mL PTC溶液，在室溫下靜置30 min，最后加入TB3復蘇液體培養基，每200 μL的原生質體加入3 mL的TB3培養基，輕輕顛倒混勻，室溫下振蕩培養2 h；隨后將原生質體加入10 mL熔化并冷卻到約50℃的TB3固體培養基上，并加入Amp+與G418抗性藥劑，輕輕混勻后倒入培養皿中，靜置至下層板凝固；最后向培養基倒入10 mL含Amp+和G418抗性的TB3培養基。28℃下培養2～3 d，待培養基上長出菌落后，將菌絲挑取到新的CM固體培養基上培養并進行后期驗證。

1.7 暹羅炭疽菌轉化子的驗證 分別取上述培養基中轉化菌株與野生型的菌株的菌餅進行液體培養，26℃ 160 r·min-1條件下培養2～3 d，并提取轉化子與野生型的DNA作為模板，利用GFP F/R引物進行PCR驗證。PCR反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性5 min ，56℃退火35 s，72℃延伸25 s，45個循環，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物經過1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。并將轉化子以及野生型的菌絲、孢子制備成臨時玻片，利用熒光顯微鏡（奧林巴斯BX53顯微鏡，配備DP80CCD）觀察。

1.8GFP基因表達量分析 將暹羅炭疽菌轉化子在CM液體培養基中28℃培養2～3 d。利用真菌RNA提取試劑盒（Omega，R6840-01）提取轉化子的RNA，同時也提取野生型暹羅炭疽菌的RNA，利用反轉錄試劑盒（Vazyme，R333-01）進行反轉錄得到cDNA。以RP27啟動子驅動GFP基因作為陽性對照，分別測定WY172與WY195驅動GFP基因的表達量。

1.9 啟動子在暹羅炭疽菌侵染階段驅動GFP基因表達 挑取轉化成功的暹羅炭疽菌絲放置于PDA培養基上培養4～6 d，再利用打孔器打取5 mm直徑的暹羅炭疽菌的菌碟，在PDB培養基中28℃培養3 d，緊接著利用無菌過濾紙過濾，12 000 r·min-1離心，加入無菌水制備成分生孢子懸浮液，并利用血球計數板計數，制備成106個·mL-1懸浮液備用。

將上述制備好的孢子懸浮液噴灑在經過無菌水沖洗過的離體橡膠樹葉片上。根據暹羅炭疽菌在橡膠樹葉片上的發育進程及侵染結構變化，分別選擇在0 h （非接種狀態）、12 h （附著胞形成侵染釘）、24 h （分生孢子另一端的芽管產生附著胞）、48 h （附著胞分化產生次級附著胞）、72 h （菌絲網狀分布）這5個時間段，將葉片和菌絲利用錫箔紙密封[11]，液氮冷凍，-580℃保存。

利用真菌RNA試劑盒分別提取這5個時間段的暹羅炭疽菌RNA，利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，以RP27、WY172、WY195分別在0 h驅動GPF基因的表達量作為參考值，探究不同啟動子驅動下GFP基因表達含量在暹羅炭疽菌侵染不同時間的變化。

1.10 啟動子WY172與WY195的誘導類型 將暹羅炭疽菌轉化子接種于普通CM固體培養基上，28℃培養7 d。將上述轉化子分別接種于添加H2O2（20 mmol·L-1）、葡萄糖（1 mol·L-1）、0.01%的SDS、山梨醇（1 mol·L-1）、剛果紅(200 μg·mL-1)的CM固體培養基以及普通CM固體培養基在28℃培養5 d，再取上述轉化子接種于普通CM固體培養基，分別放置于長光照、黑暗和23℃低溫條件下培養5 d。切取上述不同條件下CM平板中培養的轉化菌株進行液體培養，28℃ 160 r·min-1培養2～3 d。利用真菌RNA提取試劑盒（Omega，R6840-01）提取菌絲RNA，用反轉錄試劑盒（Vazyme，R333-01）將RNA反轉錄為cDNA，測定不同生長條件下GFP基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 表達載體的構建 對陽性菌株提取的質粒進行PCR驗證，結果顯示出與目的條帶大小基本一致的條帶（WY172大小為250 bp左右，WY195大小為250 bp左右），進一步送至華大生物公司測序以及NCBI序列對比，結果顯示相似性為100%，表明表達載體構建成功。

2.2 WY172與WY195啟動子活性的檢測 通過熒光顯微鏡觀察，發現啟動子WY172與WY195驅動GFP基因表達出了類似于RP27驅動GFP基因的熒光強度，而野生菌株未出現熒光表達（圖2），表明構建的3種載體已成功轉入，并且初步證明啟動子WY172與WY195均可在暹羅炭疽菌內驅動GFP基因的表達。

圖2 WY172與WY195啟動子驅動GFP基因表達菌絲熒光圖

利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）測定3種啟動子（WY172、WY195和RP27）驅動GFP基因的表達量是否存在差異，結果發現WY172和WY195驅動GFP表達的能力分別約為RP27的87%和91%，表現出與RP27類似的驅動GFP表達的能力，而野生型未檢測到GFP基因的表達（圖3），這再次證明WY172與WY195啟動子均可在暹羅炭疽菌內驅動GFP基因的表達，說明WY172與WY195在暹羅炭疽菌內具有啟動子活性。

圖3 啟動子驅動GFP基因的表達

2.3 WY172與WY195在暹羅炭疽菌侵染寄主的不同侵染階段的啟動子活性 以3種轉化子（WY172、WY195和RP27）分別在0 h的GFP基因的表達量作為對照， RT-qPCR結果顯示啟動子驅動GFP基因在12 、24 、48 、72 h這4個時間段表現出的效率相差較小（圖4），如在RP27啟動子驅動下，GFP基因的表達量在12、24、48、72 h分別為0 h的103%、127%、74%、131%，而在WY172啟動子驅動下，GFP基因的表達量在12、24、48、72 h分別為0 h的110%、88%、127%、129%，在WY195啟動子驅動下，GFP基因的表達量在12、24、48、72 h分別為0 h的101%、113%、134%、117%。這證明啟動子在暹羅炭疽菌侵染寄主的不同階段均可以驅動GFP基因的表達。

圖4 啟動子在暹羅炭疽菌侵染寄主階段驅動GFP基因表達

2.4 環境條件對 WY172 與 WY195 活性的影響提取不同生長條件處理下的暹羅炭疽菌RNA，利用RT-qPCR測定發現WY172在24 h光處理條件下GFP表達量升高，WY195在低溫培養與24 h光處理條件下GFP表達量升高（圖5）。

圖5 不同環境條件對啟動子驅動GFP基因表達的影響

3 討 論

啟動子作為轉錄調控的中心一直是研究熱點，優良啟動子的發現是研究基因表達調控的基礎，加深對啟動子的研究對基因工程具有很大的幫助。絲狀真菌具有豐富的啟動子資源[12]，目前應用較多的絲狀真菌誘導型啟動子含有里氏木霉的cbhl啟動子[13]、曲霉屬的glaA啟動子[14]和構巢曲霉的alcA啟動子[15]。本研究以實驗室前期結果為基礎，進一步加深對WY172與WY195啟動子應用范圍的探索，旨在擴大橡膠樹白粉菌啟動子應用，為橡膠樹白粉菌轉化體系建立和互作機制的研究提供可靠的啟動子工具。

目前已經報道的啟動子大多僅能在某種生物中發揮啟動子作用，較少可以在多種不同的生物內均可高效驅動基因的表達，例如目前使用較為廣泛的35S啟動子僅適用于雙子葉植物[16]，單子葉植物經常使用水稻ACT1啟動子[17]和玉米Ubil啟動子[18]。在筆者所在的實驗室的前期研究中，通過GUS蛋白染色實驗和GUS酶活性檢測發現，來源于橡膠樹白粉菌的WY172與WY195啟動子在雙子葉植物和單子葉植物內均具有較強的啟動子活性。這與來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子[16]相類似，雖然來源于病毒卻能在植物中穩定高效表達。但此前研究中對WY172、WY195在絲狀真菌中是否具有啟動子活性尚未進行研究。由于橡膠樹白粉菌目前尚無有效轉化體系且具有無法離體培養的特點，本研究選擇絲狀真菌中的暹羅炭疽菌作為研究對象，對WY172、WY195的啟動子功能進行探究，研究結果表明WY172與WY195均具有可以驅動GFP表達的啟動子功能。這證明WY172與WY195啟動子不僅可以應用于植物，更可以在絲狀真菌中發揮啟動子功能。筆者推測，WY172、WY195啟動子可能具有廣泛的啟動子功能，在多種生物體內均可以發揮啟動子功能，這可能與其自身具有廣泛的表達調控元件有關。筆者實驗室也將在接下來的實驗中對WY172、WY195啟動子序列中的表達調控元件進行進一步的鑒定及功能分析，為基因工程提供更為有效的啟動子工具。

本實驗室前期的研究結果[7-8]表明，在植物體內WY172為IAA誘導型啟動子，WY195為高溫、干旱、鹽誘導啟動子，經分析發現，這可能與WY172、WY195啟動子序列具有豐富的植物表達元件有關，其中，WY172不僅具有赤霉素響應、生長素響應等激素作用元件，此外還有低溫響應、光響應元件等非生物因素的作用元件[7]；WY195啟動子也具有高等植物常見的創傷應答元件、厭氧誘導必須元件、干旱誘導元件、光應答元件等[8]。此外，除這些已報道的植物誘導條件外，還發現WY172與WY195啟動子存在一些未經報道的植物啟動子誘導元件。由于WY172、WY195啟動子在植物中的誘導條件會導致真菌的生長發育受到限制，因此植物體內的啟動子誘導條件并不適用于真菌體內，為了進一步探究WY172與WY195啟動子在真菌內的表達調控方式，本研究將轉化子置于不同的生長環境條件下，測定啟動子驅動GFP基因表達量的變化，發現在光處理的條件下WY172驅動GFP基因的高效表達，在23℃低溫培養和長光照處理下WY195啟動子高效驅動GFP基因的表達。這些研究結果表明，WY172與WY195啟動子在真菌內也屬于誘導型啟動子，但這些誘導條件與植物體內的條件完全不同。這可能與真菌的生長環境有關，同時也可能與WY172與WY195啟動子豐富的誘導元件有關。由于目前專門針對絲狀真菌啟動子的研究數據庫及分析工具較少，主要依靠其他真核生物的數據庫進行預測，并通過實驗對預測結果加以驗證[12]。筆者實驗室將在接下來的實驗中對WY172與WY195啟動子在真菌體內的誘導元件進行鑒定與分析，對以上2個啟動子是否具有更多誘導條件的可能性進行進一步鑒定。

目前使用的真菌啟動子多為組成型啟動子，雖然組成型啟動子不受外界影響，在菌株的不同生長階段均可高效表達[19]，但是組成型啟動子的使用也存在局限性，例如當驅動異源基因表達時，會導致宿主菌株內產生大量異源蛋白，從而影響菌株正常生長甚至導致死亡。誘導型啟動子在未受到特定的誘導信號刺激時，驅動目的基因的表達量往往很低，只有施加可以響應的誘導信號時，目的基因的轉錄水平才可以迅速提高，因此，使用誘導型啟動子可以滿足對目的基因的實時、定量表達的研究需求。但實驗時還應根據合適的實驗條件選擇合適的誘導型啟動子，并非每個誘導型啟動子的誘導條件都能給所選的模型生物帶來最佳條件。例如，誘導型啟動子cbh1的天然誘導劑為纖維素，而真菌通過纖維素酶將纖維素降解，最后進入真菌體內對啟動子cbh1進行直接調控，因此宿主菌株體內必須有編碼纖維素酶的基因[20]。而WY172啟動子與WY195啟動子誘導條件為物理條件，不需要添加化學試劑來進行誘導，不僅避免化學試劑對寄主菌株正常生長產生影響，而且具有更廣泛的使用范圍。此外，WY172啟動子與WY195啟動子在植物和真菌內均屬于誘導型啟動子，在植物和真菌內均可運用。這不僅為功能基因的研究提供了更多的思路，也為啟動子的應用提供了更多的可能。