手性茚蟲威對家蠶的急性毒性效應

趙文宇，張 潔，鄭世祥，汪心雨，蘇小婷，范詠梅

（海南大學 植物保護學院/熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室，?？?570228）

茚蟲威是由美國杜邦公司開發(fā)的含有手性分子的惡二嗪類殺蟲劑，其中（+）-S-茚蟲威具有殺蟲活性，對鱗翅目害蟲有較好的防效[1]。由于單一純異構體開發(fā)成本和技術工藝要求高、成本高，目前國內外市面上銷售的茚蟲威殺蟲劑多數(shù)為（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威兩種對映體的混合劑型，其中杜邦公司生產的茚蟲威產品主要有3種對映體混合劑型：DPX-JW062（S∶R =1∶1）、DPX-MP062（S∶R=3∶1）、DPX-KN128（S∶R=1∶0）[2]，中國市場上茚蟲威產品主要是富含S異構體的產品（S∶R =2.2∶1和3∶1）[3-4]。茚蟲威廣泛應用于對棉花、玉米、水稻和果樹等的害蟲防治[5-8]。由于桑園往往與農田、果園等呈交錯分布，對桑園附近農田及果園施藥時，殺蟲劑會隨空氣漂移落在桑樹上對桑葉產生污染[9-10]。家蠶（Bombyx mori）進食被殺蟲劑污染的桑葉后后果嚴重，甚至可導致蠶繭絕收，不僅給養(yǎng)蠶業(yè)造成巨大的經濟損失，而且對絲綢產業(yè)產生影響[11-12]。目前對環(huán)境生物家蠶的毒性報道中使用的多為茚蟲威商品藥，其中陳偉國等[13]測定30%茚蟲威懸浮劑對3齡期蠶的24 h LC50為0.360 4 mg ·L-1，俞瑞鮮等[14]和陳麗萍等[15]測定15%茚蟲威懸浮劑對家蠶96 h LC50分別為0.449 mg ·L-1和0.439 mg ·L-1，毒性為劇毒。（+）-S-茚蟲威、（-）-R-茚蟲威及茚蟲威原藥對家蠶毒性研究較少，僅有石麗紅[16]采用浸葉法測定了（+）-S-茚蟲威（>98%）、（-）-R-茚蟲威（>98%）和S-茚蟲威富集體（2.33S∶1R）對家蠶96 h的急性毒性報道，LC50分別為1.96、108和6.89 mg L-1。

有研究發(fā)現(xiàn)茚蟲威手性異構體對斑馬魚的毒性具有對映選擇性[17-18]，誘導斑馬魚產生氧化應激毒性且表現(xiàn)出對映選擇性[19]。然而茚蟲威原藥、（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威對家蠶的氧化應激的影響尚未見報道，因此本研究以家蠶為生物模型，采用噴霧法測定茚蟲威原藥（3S:1R）、（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威對家蠶的急性毒性，測定其抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的活性變化來評價茚蟲威原藥（3S:1R）、（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威對家蠶的毒性效應，為后續(xù)茚蟲威的實際應用及其對于環(huán)境生物的安全性評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 試驗所用家蠶品種為‘秋風’ב月白’，蠶卵購于諸暨市鑒寶農業(yè)開發(fā)有限公司。實驗室自行催青和飼養(yǎng)，在實驗室經2 d孵化，幼蟲用新鮮嫩桑葉喂養(yǎng)，恒溫養(yǎng)蟲室設置溫度條件為（27±1）℃，相對濕度為70%～85%，光照黑暗比為16 h:8 h，以二齡起蠶為供試生物，挑選活性良好、身體健康、體態(tài)大小一致、起蠶時間一致的二齡起蠶用作試驗。桑葉品種選用‘云桑二號’，購于諸暨市鑒寶農業(yè)開發(fā)有限公司。超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒和過氧化物酶（POD）測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所有限公司。茚蟲威原藥（3S:1R，98%）購于南京樂邦化工有限公司，（+）-S-茚蟲威（98%）和（-）-R-茚蟲威（98%）由上海大賽路手性公司拆分所得。

1.2 急性毒性測定

1.2.1 急性毒性測定方法 參照《化學農藥家蠶慢性毒性試驗準則》（NY/T 3087—2017）附錄B中農藥家蠶急性毒性試驗—噴霧法，使用溶劑DMF和助劑Tween-80將茚蟲威原藥、（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威配制成100 mg ·L-1的茚蟲威母液，將母液梯度稀釋，分別為14.600 、7.300 、3.650 、1.825 和0.915 mg ·L-1，同時設置空白對照組CK和助溶劑對照組SC。選取桑樹頂端大小和質量盡量一致的新鮮有光澤的嫩桑葉，每個處理的桑葉用量為（2.5±0.1）g。將桑葉用清水清洗干凈并晾干表面水漬，使用噴霧塔設備將試驗藥液均勻噴灑到桑葉的背面，以初始噴霧體積為5 mL，噴霧壓力為0.048 MPa，沉降時間為20 s作為標準參數(shù)。將桑葉自然風干至其表面看不到藥液，再將染毒桑葉置于培養(yǎng)裝置中。選擇健康、大小一致的二齡起蠶轉到桑葉上。每處理20頭二齡起蠶，重復3次。每結束1個處理組的噴霧操作后均對噴霧塔內壁進行清洗擦拭，以防止內壁形成水滴滴落。噴藥前用萬分之一天平稱量桑葉的質量，噴藥后再次立即稱量桑葉質量，進而可測定每片桑葉上噴施茚蟲威的準確含量。計算所得的試驗濃度為2.920 、1.460 、0.730 、0.365和0.183 mg·kg-1，在藥劑處理后24、48、72及96 h觀察并記錄家蠶的中毒癥狀和死亡情況。用移蟲筆輕觸家蠶，家蠶無反應視作死亡。當毒性測定試驗中溶劑對照組和空白對照組的死亡率小于10%視為有效試驗。

1.2.2 共毒系數(shù)計算 參照國家農藥室內生物測定試驗準則NY/T1154.7-2006進行共毒系數(shù)（CTC）計算。若CTC≤80，表明2種藥劑混用為拮抗作用；若80＜CTC＜120，則為相加作用；若CTC≥120，則為增效作用。

1.3 酶活力測定

1.3.1 粗酶液制備 使用噴霧法按照急性毒性試驗濃度處理24 h，其中各濃度處理組設置多組重復以滿足試驗需求，從每個濃度的處理組中各取10頭活蠶分別裝入離心管中，用液氮處理后加入2 mL的1×PBS溶液進行冰浴研磨，然后使用Z216MK冷凍離心機4 ℃ 3 500 r·min-1離心10 min后，取上清液作為粗酶液。

1.3.2 總蛋白含量的測定 蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍G-250染色法進行。首先用0.15 mol·L-1的NaCl配制出100 mL濃度為1 000 mg · L-1的牛血清白蛋白，備用。分別向編號0 ～8的離心管中加入0.01、0.02、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14和0 mL牛血清白蛋白（1 000 mg · L-1），然后依次加入0.19、0.18、0.14、0.12、0.10、0.08、0.06和0.2 mL蒸餾水，每管中加入5 mL考馬斯亮藍G-250染劑后用離心機渦旋混勻后靜置5 min，再將其移到比色皿內置于752紫外分光光度計中，波長調至595 nm，測定吸光值繪制蛋白標準曲線，8號管用于調零，每個處理重復3次。

1.3.3 酶源蛋白含量測定 向編號1～7號的離心管中分別加入0.2 mL上述步驟制備的粗酶液，在8號管中加入0.2 mL蒸餾水，向8個離心管中分別加入5 mL考馬斯亮藍G-250染劑，再將離心管中液體轉移至比色皿內，將比色皿置于紫外分光光度計中，波長調至595 nm，測定吸光值，8號管用于調零，每個處理重復3次。

1.3.4 SOD、CAT和POD酶活力測定 SOD、CAT和POD酶活力的測定使用752紫外分光光度計進行測定，具體試驗步驟操作參照南京建成試劑盒進行。

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用軟件IBM SPSS statistics 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，用GraphPad Prism 9進行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結果與分析

2.1 茚蟲威對家蠶的毒性影響 參照《化學農藥家蠶慢性毒性試驗準則》使用桑葉浸漬修正系數(shù)對農藥對家蠶的急性毒性等級劃分標準的LC50進行修正后可知，茚蟲威原藥對家蠶96 h的毒性等級為高毒，（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威對家蠶96 h的毒性等級為劇毒，毒性大小依次為（-）-R-茚蟲威> （+）-S-茚蟲威>茚蟲威原藥。主要中毒癥狀為吐黃水、蠶體發(fā)黑、蠶體縮短現(xiàn)象，隨著藥液濃度的升高，中毒家蠶越多。（+）-R-茚蟲威對家蠶的LC50是（-）-S-茚蟲威的2.75倍，茚蟲威的2種手性對映體對家蠶表現(xiàn)出對映選擇性毒性。茚蟲威原藥（3S:1R）的共毒系數(shù)為12.868≤80，（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威2種藥劑混合表現(xiàn)為拮抗作用（表1）。

表1 茚蟲威原藥、（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威對家蠶的毒性測定結果

2.2 茚蟲威對家蠶酶活性的影響 以牛血清白蛋白為標準蛋白繪制蛋白質標準曲線，標準曲線方程為y=0.044x+0.048，相關系數(shù)R2為0.971。

2.2.1 茚蟲威對家蠶SOD活性的影響 從圖1-A可知茚蟲威原藥誘導家蠶體內的超氧化物歧化酶（SOD）活性上升，和對照組SC相比，5個處理組SOD活性均顯著上升。在圖1-B中（+）-S-茚蟲威處理組中0.730、1.460和2.920 mg ·kg-13個濃度誘導SOD活性顯著上升，其余2個濃度SOD活性顯著下降。在圖1-C中（-）-R-茚蟲威處理組中0.183和0.365 mg ·kg-1濃度下誘導SOD活性顯著降低，SOD活性在0.730、1.460和2.920 mg ·kg-1濃度下顯著上升。

圖1 茚蟲威對家蠶SOD活性的影響

在0.183和0.365 mg ·kg-1濃度下，茚蟲威原藥誘導SOD酶活性和對照相比上升8.577%和23.585%。（+）-S-茚蟲威誘導SOD酶活性和對照相比下降28.536%和23.317%，（-）-R-茚蟲威誘導SOD酶活性和對照相比下降14.735%和8.170%。在0.730、1.460和2.920 mg ·kg-1濃度下，茚蟲威原藥誘導SOD酶活性和對照相比上升34.129%、20.626%和32.948%。（+）-S-茚蟲威誘導SOD酶活性和對照相比上升66.079%、25.723%和38.650%，（-）-R-茚蟲威誘導SOD酶活性和對照相比上升77.247%、32.006%和54.537%。0.183和0.365 mg ·kg-1（+）-S-茚蟲威對SOD的抑制效果更好。

2.2.2 茚蟲威對家蠶CAT活性的影響 由圖2-A可知茚蟲威原藥誘導家蠶體內的過氧化氫酶（CAT）活性整體呈上升趨勢，和對照相比，5個處理組CAT活性均顯著上升。由圖2-B可以看出（+）-S-茚蟲威處理組中除0.183 mg ·kg-1濃度下CAT活性顯著下降，其余處理組CAT活性均顯著上升。由圖2-C可知（-）-R-茚蟲威處理組中除0.183 mg ·kg-1濃度下CAT活性下降，其余4個濃度CAT活性均顯著上升。

圖2 茚蟲威對家蠶CAT活性的影響

和對照相比，在0.183 mg ·kg-1濃度下茚蟲威原藥誘導CAT活性上升39.054%，（+）-S-茚蟲威和-）-R-茚蟲威誘導CAT活性下降42.420%和13.169%。在0.365、0.730、1.460和2.920 mg ·kg-1濃度下，茚蟲威原藥誘導CAT活性上升59.065%、84.756%、33.526%和95.957%，（+）-S-茚蟲威誘導CAT活性上升76.001%、251.725%、34.229%和234.280%，（-）-R-茚蟲威誘導CAT活性上升8.590%、173.678%、30.407%和125.553%。在0.183 mg ·kg-1（+）-S-茚蟲威對CAT的活性抑制效果最好。

2.2.3 茚蟲威對家蠶POD活性的影響 由圖3-A可知，茚蟲威原藥處理組中5個濃度均誘導家蠶體內POD活性下降。圖3-B結果表明，和對照相比，（+）-S-茚蟲威誘導POD活性均顯著下降。由圖3-C可知，（-）-R-茚蟲威誘導POD活性下降，和對照相比，5個濃度家蠶POD活性均顯著下降。

圖3 茚蟲威對家蠶POD活性的影響

和對照相比，在0.183、0.365、0.730、1.460和2.920 mg ·kg-1濃度下茚蟲威原藥誘導POD活性下降165.885%、93.751%、30.108%、52.268%和6.206%；（+）-S-茚蟲威誘導POD活性下降266.722%、217.385%、151.490%、205.520%和378.033%；（-）-R-茚蟲威誘導POD活性下降406.287%、314.239%、258.185%、119.468%和64.830%。（-）-R-茚蟲威在0.183、0.365、0.730 mg·kg-1對POD活性的抑制效果最好，（+）-S-茚蟲威在0.183和2.920 mg ·kg-12個濃度對POD的抑制效果最好。

3 討 論

對于大多數(shù)手性農藥而言，其一種手性異構體對同種生物的急性毒性往往高于其外消旋體，且2種手性異構體可能在同種生物中表現(xiàn)出不同的毒性[20-21]。石麗紅[16]采用浸葉法測定的（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威96 h的LC50分別為1.96和108 mg·L-1，用桑葉浸漬修正系數(shù)修正后為0.901 6和49.680 0 mg·kg-1。本試驗家蠶毒性測定方法中噴霧法可通過試驗前后稱量桑葉重量對農藥進行定量，和浸葉法相比，該方法定量更精準、噴霧更均勻[22-23]，本研究結果表明，（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威對家蠶96 h的LC50分別為0.041和0.113 mg·kg-1，茚蟲威的2種手性異構體對家蠶的毒性存在對映選擇性的差異。

據(jù)報道，斑馬魚成魚暴露于不同濃度的（-）-R-茚蟲威和（+）-S-茚蟲威96 h后，（+）-S-茚蟲威在96 h對斑馬魚胚胎的毒性是（-）-R-茚蟲威的5.637倍；斑馬魚幼魚暴露于不同濃度的（-）-R-茚蟲威和（+）-S-茚蟲威96 h后，（+）-S-茚蟲威在96h對斑馬魚幼魚的毒性是（-）-R-茚蟲威的3.352倍[24]。本研究結果表明，（-）-R-茚蟲威對家蠶的毒性是（+）-S-茚蟲威的2.75倍，茚蟲威的2種手性異構體對家蠶的毒性存在對映選擇性的差異。

生物體中存在多種抗氧化酶系包括過超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等，SOD、CAT和POD三者協(xié)調一致,處于動態(tài)平衡，從而使自由基維持在一個較低水平，防止自由基產生毒害[25]。微量農藥誘導昆蟲體內自由基（ROS）積累發(fā)生氧化應激[26-27]，鉤蝦暴露于茚蟲威24、48、96 h后，SOD和CAT活性隨暴露時間增加而增加[28]，低劑量的茚蟲威誘導鯉魚腎臟中的SOD和CAT酶基因表達均發(fā)生上調[29]。本試驗結果表明，和對照相比，在（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威處理組中SOD和CAT活性在0.730、1.460和2.920 mg·kg-13個濃度時顯著上升，SOD和CAT活性上升可能參與了家蠶氧化應激中自由基的清除過程[30]，以減輕茚蟲威對家蠶造成的損害。在茚蟲威原藥、（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威處理組中POD活性均下降，可能影響自由基清除過程中對H2O2的催化[31]。

殺蟲劑混配后可能產生增效、相加或拮抗的聯(lián)合作用效果[32-33]。三唑磷和氯氟氰菊酯混合劑對蚯蚓的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用，該混合劑對蚯蚓體內POD酶活性的誘導作用大于單獨使用三唑磷或氯氟氰菊酯的效果[34]。阿維菌素和氟蟲脲混合劑聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用，混合農藥處理的舞毒蛾幼蟲SOD、POD和CAT活性均高于單獨使用阿維菌素或氟蟲脲處理組[35]。有研究表明，敵敵畏和溴氰菊酯及其混合劑均能抑制大鼠肝臟的SOD和CAT的活性，單獨使用時溴氰菊酯抑制效果更好，敵敵畏與溴氰菊酯混配劑對SOD和CAT的抑制效果低于二者單獨作用的效果總和，敵敵畏與溴氰菊酯混合使用對大鼠肝臟氧化應激的誘導具有拮抗作用[36]。二嗪農和溴氰菊酯混合對大鼠血液中MDA、GST、SOD的活性具有拮抗作用[37]。本試驗結果表明，（+）-S-茚蟲威和（-）-R-茚蟲威）之間的毒性效應為拮抗作用，和二者聯(lián)合毒性作用效果一致。