不同配伍比例金銀花-連翹藥對(duì)的體外抗菌作用研究

林思綺 司徒杰 （廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣州 510405）

金銀花，是忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，性味甘、寒，2020年版《中國(guó)藥典》明確其具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效，現(xiàn)代研究表明其具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、保肝、保護(hù)肺臟、降血糖、神經(jīng)保護(hù)、增強(qiáng)免疫功能等多種生物活性［1］。連翹，是木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl 的干燥果實(shí)，性味苦、微寒，2020 年版《中國(guó)藥典》明確其具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、消腫散結(jié)之功效，現(xiàn)代研究表明其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、保肝、抗阿爾茨海默病等多種生物活性［2］。二者在性味、功效、臨床應(yīng)用等方面高度一致，中醫(yī)常將二者進(jìn)行配伍相須使用，以增強(qiáng)清氣涼血、清熱解毒的功效，是溫病治療常用藥對(duì)之一，如《溫病條辨》所載的銀翹散，能夠顯著發(fā)揮抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗過敏等作用［3］。此外，銀翹解毒丸/片/膠囊/顆粒、雙黃連口服液/片/栓/顆粒/滴眼液等多個(gè)中藥制劑亦以金銀花-連翹藥對(duì)為主藥［3］。

據(jù)相關(guān)研究［4-7］報(bào)道，金銀花-連翹藥對(duì)在抗病毒（流感病毒、呼吸道合胞病毒）、抗菌（溶珊瑚弧菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）等方面能夠起到協(xié)同作用；配伍后，抗炎作用更強(qiáng)，而且能夠發(fā)揮單用連翹所不具備的解熱作用。但是，目前對(duì)于不同配伍比例金銀花-連翹藥對(duì)的抗菌活性及作用機(jī)制研究報(bào)道甚少，無法為其臨床治療細(xì)菌感染性疾病提供理論依據(jù)。因此，本研究以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為革蘭陽性菌、革蘭陰性菌代表，采用K-B 紙片法、二倍微量稀釋法測(cè)定不同配伍比例金銀花-連翹藥對(duì)的體外抗菌活性；通過生物化學(xué)法評(píng)價(jià)最佳配伍比例對(duì)受試菌株細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的作用，從而為其配伍作用規(guī)律與臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus arureus，S.aureus）ATCC 6538，購于廣東省微生物研究所；大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）ATCC 25922，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試藥

金銀花（批號(hào)：20221001，山東產(chǎn)地）、連翹（批號(hào)：20221215，河南產(chǎn)地），購于廣州采芝林藥業(yè)連鎖有限公司；M-H 瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20220516）、M-H 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：20220910），購于青島海博生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶試劑盒（AKP，批號(hào)：20221103），購于江蘇寶萊（酶免）生物科技有限公司。

1.3 儀器

SW-CJ-2FD 凈化工作臺(tái)，購于蘇州凈化設(shè)備有限公司；LX-B50L 型高壓滅菌器，購于合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；DHP-9082 恒溫培養(yǎng)箱，購于上海一恒科技有限公司；Multiskan ? FC 酶標(biāo)儀，購于美國(guó)Thermo Fisher 公司。

2 方法

2.1 金銀花-連翹藥對(duì)提取制備

分別準(zhǔn)確稱取金銀花、連翹藥材各10.0 g 以及不同配伍比例（5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）組合物各10.0 g，置于圓底燒瓶中，加入100 mL 水，加熱回流煎煮1 h，提取2 次，合并過濾，真空濃縮至1.0 g/mL。

2.2 活化菌種與菌液制備

將低溫保存的S. aureus、E. coli取出，室溫解凍，接種于M-H 瓊脂培養(yǎng)基，劃線后置37 ℃培養(yǎng)20 h；挑選1～2 個(gè)單菌落，接種于M-H 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置37 ℃培養(yǎng)20 h，以標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葘?duì)稀釋至濃度為1×106cfu/mL 的菌液。

2.3 抑菌圈直徑（Inhibition zone diameter，IZD）測(cè)定

通過K-B 紙片法實(shí)驗(yàn)［8］，分別準(zhǔn)確吸取“2.1”項(xiàng)下的金銀花、連翹及不同配伍比例組合物提取液各10.0 μL 至直徑為6.0 mm 的無菌藥敏片，烘干；準(zhǔn)確吸取“2.2”項(xiàng)下的S. aureus、E. coli菌液稀釋液于M-H 營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上，均勻涂布；將藥敏片貼放于瓊脂板上，置37 ℃培養(yǎng)20 h，取出測(cè)量IZD；平行3 份。判斷標(biāo)準(zhǔn)：＞15 mm 為高度敏感，10～15 mm 為中度敏感，＜10 mm 為低度敏感。

2.4 最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）測(cè)定

通過96 孔板二倍微量稀釋實(shí)驗(yàn)［8］，準(zhǔn)確吸取“2.2”項(xiàng)下的S. aureus、E. coli菌液稀釋液100.0 μL 于96 孔微量培養(yǎng)板每排的第1～12 孔，再分別準(zhǔn)確吸取“2.1”項(xiàng)下的金銀花、連翹及不同配伍比例組合物提取液各100.0 μL 至每排第1孔，吹打混勻，準(zhǔn)確吸取100.0 μL 混合液至第2 孔，同理操作至第11 孔（棄去100.0 μL 混合液），第12 孔準(zhǔn)確加入100.0 μL 的無菌水作為空白對(duì)照；置37 ℃培養(yǎng)20 h，肉眼觀察，以孔中溶液未見渾濁者為MIC；平行3 份。

2.5 菌體細(xì)胞外AKP 含量的測(cè)定

通過生物化學(xué)法實(shí)驗(yàn)［8］，準(zhǔn)確吸取“2.2”項(xiàng)下的S. aureus、E. coli菌液稀釋液1.0 mL 于EP 管中，根據(jù)“2.4”項(xiàng)下的MIC 測(cè)定結(jié)果，分別加入適宜濃度的金銀花、連翹及最佳配伍比例組合物提取液各1.0 mL，使得最終濃度均為MIC，另外以無菌水作為空白對(duì)照；置37 ℃培養(yǎng)6 h，取出后于10 000 r/min離心5 min，按照說明書操作測(cè)定上清液的AKP 活性；平行3 份。

2.6 菌體細(xì)胞外核酸含量的測(cè)定

通過生物化學(xué)法實(shí)驗(yàn)［8］，準(zhǔn)確吸取“2.2”項(xiàng)下的S. aureus、E. coli菌液稀釋液1.0 mL 于EP管中，根據(jù)“2.4”項(xiàng)下的MIC 測(cè)定結(jié)果，分別加入適宜濃度的金銀花、連翹及最佳配伍比例組合物提取液各1.0 mL，使得最終濃度均為MIC，另外以無菌水作為空白對(duì)照；置37 ℃培養(yǎng)6 h，取出后于10 000 r/min 離心5 min，于酶標(biāo)儀測(cè)定上清液的A260 值；平行3 份。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同配伍比例金銀花-連翹藥對(duì)的體外抗菌活性

由表1 實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果可知，金銀花、連翹單味藥對(duì)S. aureus的IZD 為11.73、14.63 mm，MIC為62.5、15.63 mg/mL，對(duì)E. coli的IZD 為10.27、12.53 mm，MIC 為125.0、62.5 mg/mL；與金銀花、連翹單味藥相比，金銀花-連翹藥對(duì)在1∶1 比例時(shí)的IZD 最大、MIC 最低。

表1 不同配伍比例金銀花-連翹藥對(duì)對(duì)S. aureus、E. coli的IZD和MIC

分析不同比例（5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）配伍發(fā)現(xiàn)，對(duì)S. aureus而言，當(dāng)金銀花占比逐漸降低（由5∶1 至1∶1），IZD 隨著增加、MIC 隨著降低，在1∶1 時(shí)表現(xiàn)出最佳抗菌作用；當(dāng)連翹占比逐漸升高（由1∶1 至1∶5），IZD、MIC 均以1∶1 為最優(yōu)，其他比例的IZD 有所減少，但MIC 均一致。對(duì)E. coli而言，當(dāng)金銀花占比逐漸降低，IZD 隨著增加、MIC 隨著降低，在1∶1 時(shí)為最佳抗菌作用；當(dāng)連翹占比逐漸升高，IZD、MIC 均以1∶1 為最優(yōu)，其他比例的IZD 隨著減少，MIC 隨著升高。

3.2 最佳配伍比例金銀花-連翹藥對(duì)的抗菌作用機(jī)制

圖1、圖2 結(jié)果顯示，S. aureus、E. coli正常細(xì)胞外的AKP、核酸含量均比較低，但在金銀花、連翹、金銀花-連翹藥對(duì)（1∶1）作用6 h 后，胞外AKP、核酸含量均顯著增加（P＜0.05）；與金銀花、連翹單味藥相比，金銀花-連翹藥對(duì)（1∶1）在S. aureus 胞外核酸外泄量方面顯著高于金銀花（P＜0.05），在S. aureus、E. coli胞外AKP 含量、E.coli 胞外核酸含量方面雖然作用最強(qiáng)，但均無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 金銀花-連翹藥對(duì)對(duì)S. aureus、E. coli胞外核酸含量的影響

4 討論

金銀花-連翹藥對(duì)在中成藥制劑中的應(yīng)用廣泛，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已所涉及利咽解毒顆粒、小兒退熱顆粒、金嗓開音丸等400 多個(gè)上市中成藥品種，對(duì)感冒發(fā)燒、流行性腮腺炎、呼吸道感染、病毒性心肌炎等疾病均有療效［4］。

通過以上研究發(fā)現(xiàn)，連翹對(duì)S. aureus、E. coli的抑菌作用均優(yōu)于金銀花，二者通過不同比例配伍，可表現(xiàn)出不同的體外抗菌活性，其中以金銀花-連翹藥對(duì)配伍比例為1∶1 時(shí)的作用最強(qiáng)，且優(yōu)于單味藥，起到協(xié)同增效的作用。同時(shí)，當(dāng)金銀花比例增加時(shí)，抗菌活性隨著減弱，不同配伍比例測(cè)得的IZD、MIC 值均有較大差異；當(dāng)連翹比例增加時(shí)，抗菌活性亦隨著減弱，但不同配伍比例測(cè)得的IZD值略有差異，而MIC 值基本一致。這可能與金銀花-連翹藥對(duì)配伍前后以及不同配伍比例中的化學(xué)成分含量不同有關(guān)，如李莉等［9］亦測(cè)得蘆丁、綠原酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、連翹脂苷A、木犀草苷、連翹苷和槲皮素等8 種成分在金銀花-連翹配伍后的含量更高，可與金銀花-連翹藥對(duì)配伍后的抗菌活性強(qiáng)于金銀花、連翹單味藥相佐證。此外，丁影［10］測(cè)得金銀花與連翹合煎液中各成分提取率明顯大于單煎液和單煎合并液，同時(shí)金銀花-連翹藥對(duì)在3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3等不同比例配伍下，以1∶1 比例中的綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、連翹酯苷A、蘆丁、木犀草苷、連翹苷和槲皮素等9 個(gè)成分含量最高，可與金銀花-連翹藥對(duì)不同配伍比例的抗菌活性高低相佐證。

對(duì)于金銀花-連翹藥對(duì)的抗菌作用機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)配伍前后均能破壞S. aureus、E. coli的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使得通透性增大，致使菌體胞內(nèi)的AKP 以及RNA、DNA 等核酸物質(zhì)外泄，從而起到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用；同時(shí)，與金銀花、連翹單味藥相比，金銀花-連翹藥對(duì)可以在更低的藥物濃度下起到更強(qiáng)的破壞作用。

本研究測(cè)得金銀花-連翹藥對(duì)對(duì)S. aureus、E.coli均有良好的抗菌作用，且配伍后的體外抗菌活性優(yōu)于單味藥，同時(shí)不同配伍比例中，以1∶1 比例的體外抗菌活性最強(qiáng)，其作用機(jī)理可能與破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。